Chondrogene Differenzierung Induktion von Fettgewebe gewonnene Stammzellen durch Zentrifugalkraft Gravity

Zusammenfassung

Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.

Zusammenfassung

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 × g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.

Einleitung

Defekte im Gelenkknorpel nicht heilen natürlich. Folglich Stammzelltransplantation hat sich als vielversprechender Ansatz für die Reparatur von Knorpel beeinträchtigt vorgeschlagen worden. Jedoch erfordert dieses Verfahren sowohl die Übernahme von einer ausreichenden Anzahl von Stammzellen und die Induktion dieser Zellen chondrogene Differenzierung zu unterziehen. Knochenmark (BM) wurde als Quelle für Stammzellen weit verbreitet, aber Zellisolation aus BM hat zwei wesentliche Nachteile: Invasivität und ungenügender Ausbeute. Aufgrund seiner Leichtigkeit des Erwerbs, Fettgewebe ist eine bevorzugte Quelle für Stammzellen. Frühere Studien zeigten die Machbarkeit Stammzellen aus Fettgewebe zur Isolierung und chondrogene Differenzierung in diesen Zellen Zytokine, wie TGF-β1 ^{1 unter} Verwendung von ² zu induzieren. Diese Verfahren sind wirksam, aber teuer.

Als preiswertere Alternative zu Cytokine können mechanische Belastungen verwendet werden,induzieren die chondrogene Differenzierung. Mechanische Belastung spielt eine kritische Rolle bei der Gesundheit von Gelenkknorpel Aufrechterhaltung ^3, und es kann chondrogenen Phänotyp in verschiedenen Zellen induzieren. Beispielsweise induziert hydrostatischem Druck chondrogenen Phänotyp in Synovium abgeleiteten Vorläuferzellen über die MAP kinase / JNK - Weg ⁴ und mechanische Kompression induziert die Chondrogenese in mesenchymalen Stammzellen (MSCs) durch chondrozytische Gene ⁵ upregulating. Zusätzlich trägt Scherspannung auf die Expression von Chondrogenese bezogenen extrazellulären Matrix (ECM) in humanen MSCs ^6. Kreiselschwerkraft (CG), ein leicht angewendet und kontrolliert mechanischer Beanspruchung durch Zentrifugation erzeugt, kann Differential Gen induzieren Expression in Zellen ^7. Beispielsweise in Karzinomzellen Lungenepithelzellen, wird die Expression von Interleukin (IL) -1b durch Zentrifugation ⁸ nach oben reguliert. Therefore als experimentell induzierbaren mechanische Beanspruchung kann CG verwendet werden chondrozytische Genexpression in Stammzellen zu induzieren. Es bleibt jedoch unklar, ob CG die chondrogene Differenzierung von Stammzellen induzieren können.

In dieser Studie haben wir festgestellt, dass CG die Hochregulation von SOX9, einen Master-Regulator der Chondrogenese, in der menschlichen ASCS induziert, was zu einer Überexpression von chondrozytische Gene. Zusätzlich verglichen wir die Wirkungen von CG auf Chondrogenese mit denen von TGF-β1, die meisten der Wachstumsfaktor im Allgemeinen in vitro - Chondrogenese in Stammzellen zu induzieren , verwendet.

Protokoll

Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der Katholischen Universität von Korea (KC16EAME0162) und führte nach NIH-Richtlinien zugelassen. Alle Gewebe wurden mit schriftliche Einverständniserklärung erhalten.

1. Kreisel Gravity Laden und Pelletkultur

1. Zellkultur und Ernte
   1. Kultur ASCS (P2-P3, siehe Materialliste) in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium-Low Glucose (DMEM-LG), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S) bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO _2.
   2. Wenn die Zellen 80% Konfluenz erreichen, entsorgen Sie das Medium und die Zellen werden mit 5 ml 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
   3. 1 ml PBS , enthaltend 1 mM EDTA und Inkubation für 2 min bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO _2.
   4. Tippen Sie auf die Kulturplatte sanft, 4 ml frisches Medium, übertragen die Zellenin 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 × g für 2 min bei Raumtemperatur (RT).
2. Kreisel Schwere Belastung
   1. Nach der Zentrifugation (Schritt 1.1.4), entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören und das Pellet in 10 ml DMEM-LG mit 10% FBS resuspendieren. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer.
   2. Für CG Beladung übertragen 2,5 × 10 ⁵ Zellen in ein neues 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 2.400 × g für 15 min.
3. Pelletkultur
   1. Unmittelbar nach der Zentrifugation der Überstand absaugen und füge 500 ul definiert chondrogenen Differenzierungsmedium (CDM, High-glucose DMEM mit 1% FBS, 1% ITS + Premix, 100 nM Dexamethason, 1x MEM nicht-essentielle Aminosäurelösung, 50 ug / ml L-Prolin und 1% Penicillin / Streptomycin). In 50 ug / ml frisch zubereitet L-Ascorbinsäure-2-phosphat bei jedem Mediumwechsel. Als positive Kontrolle, veran chondrogene differentiatiauf in nicht-zentrifugierten Zellen durch Zugabe von CDM, das 10 ng / ml TGF-β1.
   2. Platzieren Sie die lose verschlossen Rohre , die Pellets in einer stehenden Position enthält , und Inkubieren bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO _2.
   3. Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag für 3 Wochen.
4. Micro Kultur
   1. Unmittelbar nach dem Zentrifugieren (Schritt 1.2.2; 2.400 × g für 15 min), der Überstand absaugen und das Pellet in 10 ul CDM resuspendieren.
   2. Um einen Mikromasse bilden, legen Sie die resuspendierten Zellen in der Mitte eine Vertiefung einer 24-Well-Platte.
   3. Nach 2 h fügt vorsichtig 1 ml CDM zum Brunnen, Pipettieren gegen die Wand der Platte Störung der Mikromasse zu vermeiden. eine Mikromassenkultur mit nicht-zentrifugierten Zellen durch Zugabe von CDM, das 10 ng / ml TGF-β1 als Positivkontrolle, durchzuführen.
   4. Inkubieren des Mikromasse bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO _2.
   5. Ändern Sie das Medium evEry anderen Tag für 3 Wochen.

2. Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) Transcriptional Upregulation von chondrogenen Differenzierungsmarker zu erkennen

1. Am Tag 14 eine Pipette verwenden, um die Sphäroid-Pellets in ein neues 1,5-ml-Röhrchen und waschen Sie sie in 1x PBS zu übertragen.
2. Extrahieren Sie die Gesamt - RNA aus den Pellets unter Verwendung des Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform - Extraktionsverfahren ^9.
3. Synthetisieren von cDNA aus 2 ug Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase gemß dem Protokoll des Herstellers (inkubieren bei 42 ° C für 1 h und dann Inaktivieren des Enzyms bei 70 ° C für 5 min).
4. Führen PCR mit Primern , die spezifisch für chondrogenen Differenzierungsmarker ^10.

3. Die Färbung zu erkennen, die Überexpression von chondrogene Differenzierung Markerproteinen

1. Paraffin-Einbettung Zellpellets
   1. Am Tag 21Verwenden einer Pipette die Sphäroid-Pellets und waschen Sie sie mit 1x PBS zu ernten.
   2. Befestigen Sie die Sphäroid-Pellets durch Eintauchen in 4% Paraformaldehyd für 24 h.
      Achtung: Paraformaldehyd ist hochgiftig. Vermeiden Sie den Kontakt mit Augen, Haut oder Schleimhäute. Minimieren Sie Belichtung und vermeiden Einatmen während der Vorbereitung. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung.
   3. Entsorgen Sie die Fixiermittel und spülen Sie die Zellpellets mit VE-Wasser (DW).
   4. Legen Sie eine Schicht aus Gaze auf die Kassette und übertragen Sie die feste Pellets mit einer Pipette. Decken Sie das Pellet durch die Gaze Falten und schließen Sie den Kassettendeckel.
   5. Entwässern der Pellets.
      1. Eintauchen der Pellets in 70% Ethanol (EtOH) 5 min bei RT.
      2. Eintauchen der Pellets in 80% EtOH für 5 min bei RT.
      3. Eintauchen der Pellets in 95% EtOH für 5 min bei RT.
      4. Eintauchen der Pellets in 100% EtOH für 5 min bei RT. Zweimal wiederholen.
      5. Eintauchen der Pellets in 100% Xylol 15 min bei RT. Wiederholen Sie twice.
   6. Einbetten der festen Zellpellets in Paraffin bei 56 ° C in einer Form; Die Pellets können in Paraffin mit speziellen automatisierten Gewebeverarbeitungssysteme eingebettet werden.
   7. Schneiden Sie 5 um dicke Abschnitte aus dem Paraffin eingebetteten Zellpellet ein Rotationsmikrotom mit.
   8. Schwimmer die Abschnitte in 50% EtOH und übertragen sie dann auf ein 50 ° C Wasserbad eine Folie verwendet wird.
   9. Legen Sie die schwimmenden Abschnitte auf Objektträger.
2. Safranin O und Alcianblaufärbung
   1. Rehydrieren die Paraffinschnitten.
      1. Tauchen Sie die Folien in Xylol für 15 min. Zweimal wiederholen.
      2. Tauchen Sie die Folien in 100% EtOH für 5 min. Zweimal wiederholen.
      3. Tauchen Sie die Folien in 90% EtOH für 5 min.
      4. Tauchen Sie die Folien in 80% EtOH für 5 min.
      5. Tauchen Sie die Folien in 70% EtOH für 5 Minuten und dann waschen Sie sie in 1x PBS.
   2. Stain die rehydratisierten Abschnitte mit 1% Safranin O-Lösung und 3% Alcianblau für30 Minuten.
   3. Entsorgen Sie die Farblösung und spülen Sie die Abschnitte mit DW.
   4. Beflecken die Abschnitte mit Hematoxylin / Eosin-Lösung (Gegenfärbemittel) für 1 min.
   5. Entsorgen Sie die Farblösung und spülen Sie die Abschnitte mit DW.
   6. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium auf einem Deckglas nach Restwasser zu entfernen. Legen Sie das Dia (Zellenseite nach unten) auf dem Deckglas des Montage Medium enthält.
   7. Ermöglichen die Objektträger für 2-3 h bei RT trocknen.
   8. Zum Aufzeichnen von Bildern mit einem Hellfeld-Mikroskop (Automatisiertes aufrechten Mikroskop, 50X und 200X).
3. Immunfluoreszenztest
   1. Rehydrieren die Abschnitte, wie in Abschnitt 3.2.1 beschrieben.
   2. Eintauchen der Objektträger in Natriumcitrat-Puffer (10 mM Natriumcitrat, 0,05% Tween 20, pH 6,0), und dann halten sie an einem Unter Siedetemperatur für 10 min unter Verwendung einer Mikrowelle.
   3. Kühlen Sie die Folien für 20 min bei RT und dann waschen Sie sie mit Leitungswasser.
   4. Inkubieren Sie die Dias in 3%H ₂ O ₂ (in 1x PBS) für 15 Minuten und dann waschen Sie sie mit Leitungswasser für 15 min ^11.
   5. Blockieren die Objektträger mit Blockierungspuffer (10% normales Ziegenserum in PBS) für 1 h.
   6. Saugen Sie das Blockierungslösung, und dann gelten die Folien eine primäre Antikörper verdünnt mit 5% normalem Ziegenserum auf.
   7. Inkubieren Sie die Objektträger über Nacht bei 4 ° C.
   8. Waschen Sie die Objektträger dreimal in 1x PBS für jeweils 5 Minuten.
   9. Inkubieren der Objektträger in Fluorochrom-konjugierten sekundären Antikörpers mit 5% normalem Ziegenserum verdünnt, für 1 h bei RT im Dunkeln.
   10. Waschen Sie die Objektträger dreimal in 1x PBS für jeweils 5 Minuten im Dunkeln.
   11. Inkubieren Sie die Objektträger mit DAPI (1 ug / ml) für 10 Minuten und dann waschen Sie sie zweimal in 1x PBS für jeweils 5 Minuten.
   12. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium auf einem Deckglas nach Restwasser zu entfernen. Legen Sie das Dia (Zellenseite nach unten) auf dem Montagemedium.
   13. Lassen Sie die Folien für 2-3 trocknenh im Dunkeln bei RT.
   14. Visualisieren Sie die Folien mit der Fluoreszenzmikroskopie (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm; 60X und 200 - facher Vergrößerung) ^12.

Ergebnisse

Kreiselschwerkraft induziert die Überexpression von chondrogenen Differenzierungsmarker in Fettgewebe gewonnenen Stammzellen.

Um das Ausmaß der Zentrifugal-Schwerkraft bestimmen, die geeignet ist die chondrogene Differenzierung zu induzieren, ASCs wurden mit unterschiedlichen Graden der CG stimuliert (0, 300, 600, 1.200 und 2.400 xg) für 15 min. Nach der Stimulation wurden die ASCs erneut ausgesät auf Kulturplatten und kul...

Diskussion

Die stemness Zustand von Zellen ist sehr wichtig für CG-induzierten Überexpression von SOX9. In unserer Studie konnte SOX9 Expression von CG in frühen Passage ASCs (2-3), aber nicht in späteren Durchgang ASCs induziert werden. Es wurde berichtet , dass während der Kultivierung ASCs ¹⁶ CD34 + -Zellen bis 3 Passagen enthalten. ASCS neigen dazu, die Expression von CD34 zu verlieren, wie die Zellen passagiert werden, in einer geringen Reaktion auf CG führt.

Mit zent...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
100 mm Dish	TPP	93100
60 mm Dish	TPP	93060
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
ASC Culture Media Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM Low glucose	Life Technologies	11885-084	growth base media
Penicilin Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	1%
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044	10%
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
Chondrogenic Differentiation Media Materials
DMEM High glucose	Life Technologies	11995	chondrogenic differentiation base media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D2915	100 nM
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333	1%
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044	1%
Ascorbate-2-phosphate	Sigma Aldrich	A8960	50 μg/mL
L-proline	Sigma Aldrich	P5607	50 μg/mL
ITS	BD	354352	1%
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	10 ng/mL
Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-Collagen II antibody	abcam	ab34712	1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Molecular Probe	A-11037	1:200
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Human adipose-derived stem cells (ASCs)	Catholic MASTER Cells