Herstellung von menschlichen Monozyten abgeleiteten Dendritischen Zellen aus Vollblut

Zusammenfassung

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Zusammenfassung

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity.

The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to naïve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Einleitung

Dendritische Zellen (DCs) sind die wichtigsten spezialisierten Antigen-präsentierenden Zellen des Immunsystems. Unreifen DCs (iDC) befinden sich in der Haut oder in Schleimhautgewebe und sind daher unter den ersten Immunzellen mit eindringenden Pathogenen zu interagieren. DCs stellen die Brücke zwischen dem angeborenen und adaptiven Immunsystem ^1, da sie T- und B-Zell - Antworten folgende Erregernachweis aktivieren kann. Außerdem tragen sie zur proinflammatorische Immunantworten aufgrund der Sekretion von hohen Mengen von Cytokinen, wie IL-1β, IL-6 und IL-12. DCs aktivieren auch NK-Zellen und ziehen andere Immunzellen an den Ort der Infektion durch Chemotaxis.

DCs können in unreife dendritische Zellen (iDC) und reifen dendritischen Zellen (mDCs) ² auf der Grundlage ihrer Morphologie und Funktion aufgeteilt werden. Nach der Erkennung von fremden Antigenen durch eine der vielen Mustererkennung Rezeptoren (zB Toll-like - Rezeptoren, C-TypLektine, Rezeptoren oder Komplement) reichlich auf der Zelloberfläche exprimiert, durchlaufen iDCs große Veränderungen und beginnen zu reifen. Während dieser Reifungsprozess, Rezeptoren für Antigen - Capture werden herunterreguliert, während wesentliche Moleküle für die Antigenpräsentation sind ^drei hochreguliert. Reifen DCs hochregulieren die Haupt-Histokompatibilitäts-Komplexen I und II (MHC I und II), co-stimulatorische Moleküle, wie CD80 und CD86, die für die Antigenpräsentation und Aktivierung von T-Lymphozyten wichtig sind. Zusätzlich ist die Expression des Chemokinrezeptors CCR7 auf der Zelloberfläche induziert, die die Migration von DCs aus peripheren Geweben in die Lymphknoten ermöglicht. Die Migration wird durch die "Rollen" von DCs entlang eines Chemokinligand 19 (CCL19 / MIP-3b) und Chemokinligand 21 (CCL21 / SLC) Gradienten in die Lymphknoten ^4-6 erleichtert.

Nach der Migration präsentieren mDCs das verarbeitete Antigen CD4 ⁺ und CD8 ⁺ T - Zellen zu naiv, so initiating eine adaptive Immunantwort gegen das eindringende Pathogen ^7. Diese Interaktion mit T - Zellen in den Lymphknoten ist auch mit der Ausbreitung des Virus ⁸ verbunden. Andere In - vitro - Studien zeigten , dass DCs effizient erfassen und übertragen HIV T - Zellen und dass diese Übertragung führt zu einer kräftigen Infektion ^12.09. Diese Experimente unterstreichen , dass in vivo HIV - Exploits DCs als Shuttles von der Peripherie zu den Lymphknoten. Während der Antigenpräsentation, sekretieren DCs Schlüssel Interleukine, die die Differenzierung von Effektor-T-Helferzellen die Form und somit die Ergebnisse der gesamten Immunantwort gegen die Mikrobe in diesem sehr Wechselwirkung bestimmt. Abgesehen von Typ 1 (Th1) und Typ 2 (Th2) Effektor - T - Zellen, andere Untergruppen von CD4 ⁺ T - Helferzellen (zB Typ 17 (Th17) und Typ 22 (Th22) T - Zellen) beschrieben wurden, und deren Induktion und Funktion wurden eingehend untersucht. DCs sind außerdem beteiligtdie Erzeugung von regulatorischen T - Zellen (Treg) ^13,14. Diese Zellen sind Immunsuppressiva und stoppen kann oder herunterregulieren Induktion oder Proliferation von Effektor-T-Zellen und sind somit entscheidend für die Immunität und Toleranz zu entwickeln.

Menschliche herkömmlichen DCs (cDCs) umfassen mehrere Untergruppen von Zellen mit einer myeloischen Ursprungs (dh Langerhans'schen Zellen (LKS) und dermale und interstitielle DCs) oder lymphatischen Ursprungs (dh plasmazytoiden DCs (pDCs)). Für In - vitro - Experimente oder DC Impfstrategien, Monozyten abgeleiteten DCs sind als Modell für die dermale DCs routinemäßig eingesetzt. Diese Zellen zeigen Ähnlichkeiten in der Physiologie, Morphologie und Funktion zu herkömmlichen myeloischen dendritischen Zellen. Sie werden durch die Zugabe von Interleukin 4 (IL-4) und Granulozyten-Makrophagen - Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) an Monozyten isoliert von gesunden Spendern ^12,15-18 erzeugt. Dendritische Zellen können auch aus dermalen oder Schleimhaut-Biopsien direkt isoliert werden oder können sogar be von CD34 ⁺ hämatopoetischen Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut erhaltenen Proben ex utero isoliert entwickelt. Hier zeigen wir, wie Monozyten isoliert und stimuliert von antikoaguliertem menschlichem Blut nach Pbmc (PBMC) Anreicherung durch Dichtegradientenzentrifugation. Nach einer Inkubation für 5 Tage, sind menschliche Monozyten unter spezifischen Bedingungen in iDCs differenziert und sind bereit für die experimentellen Verfahren in einem nicht-klinischen Umfeld.

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Protokoll

Ethik-Anweisung: schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen teilnehmenden Blutspender vom Zentralinstitut für Bluttransfusion und Immunologische Abteilung, Innsbruck, Österreich erhalten. Die Verwendung von anonymisierten übrig gebliebenen Proben für wissenschaftliche Zwecke wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Universität Innsbruck genehmigt.

1. Anreicherung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs)

1. Konzentration von PBMCs durch Zentrifugation.
   1. Öffnen Sie die Blutpackung und Split-Blut in sterilen 50 ml Zentrifugenröhrchen nach der Menge des Blutes empfangen.
   2. Falls erforderlich, stellen Sie die Lautstärke auf 50 ml für jedes Röhrchen mit sterilem Dulbecco-Phosphat-gepufferte Saline (D-PBS).
   3. Die Röhrchen in eine Zentrifuge und Spin sie bei 400 xg für 15 min bei Raumtemperatur (RT) ohne Bremse.
   4. Zeichnen Sie die obere Schicht mit Plasma und Blutplättchen mit einer sterilen 10 ml serologische Pipette ab, so dass die boundary Schicht ungestört.
      HINWEIS: Wenn autologem Plasma anstelle von FCS verwendet, wird das Kulturmedium zu ergänzen, muss das Plasma in diesem Schritt aufgefangen und hitzeinaktiviertem werden.
   5. Sammeln Sie die mononuklearen Zellen (Grenzschichten) aus zwei 50-ml-Zentrifugenröhrchen und übertragen sie in eine sterile 50-ml-Röhrchen mit einer sterilen 10 ml serologische Pipette.
   6. Stellen Sie das Volumen auf 50 ml für jedes Rohr mit sterilen D-PBS.
   7. Die Röhrchen in eine Zentrifuge und Spin sie bei 400 xg für 15 min bei RT ohne Bremse.
   8. Zeichnen Sie die obere Schicht, die das Plasma ausgeschaltet und Blutplättchen eine sterile 10 ml serologische Pipette, so dass die Grenzschicht ungestört.
   9. Sammeln Sie die mononuklearen Zellen (Grenzschichten) aus den 50 ml Zentrifugenröhrchen und übertragen sie in zwei sterile 50 ml Sammelröhrchen mit einer sterilen 10 ml serologische Pipette.
   10. Stellen Sie das Volumen auf 50 ml für jedes Röhrchen mit sterilem D-PBS.
2. Trennungvon PBMCs durch Dichtegradientenzentrifugation (Abbildung 1).
   1. Bereiten Sie vier 50-ml-Röhrchen und Pipette 15 ml Dichtegradientenmedium in jedes Röhrchen.
   2. 25 ml gepoolt Zellen / Blut aus dem Sammelrohr (Schritt 1.1.10) und sorgfältig die Dichtegradientenmedium überlagern.
   3. Die Röhrchen in eine Zentrifuge und Spin sie bei 700 xg für 30 min bei RT ohne Bremse.
3. Sammlung und Reinigung von PBMCs.
   1. Zeichnen Sie die obere Schicht, die das Plasma ausgeschaltet und Blutplättchen eine sterile 10 ml serologische Pipette, so dass die PBMC Schicht ungestört.
   2. Sammeln Sie die PBMC Interphase aus allen Rohren und bündeln die Zellen in zwei sterile 50-ml-Röhrchen mit einer sterilen 25 ml serologische Pipette.
   3. Stellen Sie das Volumen auf 50 ml für jedes Röhrchen mit sterilem D-PBS. Die Röhrchen in eine Zentrifuge und Spin sie bei 400 xg für 15 min bei 4 ° C mit der Bremse.
   4. Den Überstand aspirieren und resuspendieren dieZellen in sterile D-PBS. Pool der Zellen aus den beiden Rohren und stellen Sie die Lautstärke auf 50 ml mit sterilem D-PBS.
   5. Die Röhrchen in die Zentrifuge und Spin sie bei 400 xg für 10 min bei 4 ° C mit Bremse.
   6. Den Überstand aspirieren und resuspendieren die Zellen in sterilen D-PBS. Stellen Sie die Lautstärke auf 50 ml mit sterilem D-PBS und Pipette 50 ul in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 450 & mgr; l D-PBS.
   7. Vortex die 1,5-ml-Röhrchen kräftig und zählen Sie die Zellen in einer Neubauer-Kammer oder einem anderen Zellzählung Instrument.
   8. Platzieren Sie die 50-ml-Röhrchen in die Zentrifuge und Spin sie bei 400 xg für 10 min bei 4 ° C mit Bremse.

2. Isolierung von Monozyten durch Anti-human CD14 magnetische Partikel

1. Kennzeichnung von PBMCs mit magnetischen Partikeln.
   1. Stellen Sie die PBMC - Konzentration auf 8 x 10 ⁷ Zellen / ml Isolationspuffer verwendet wird .
   2. Vortex die anti-human CD14 magnetischen Teilchen thoroughly und je 1 x 10 ⁷ PBMCs für 50 ul Partikel hinzufügen.
   3. Mischen der Zellpartikel-Suspension gründlich und Inkubation es bei RT für 30 min.
2. Trennung der positiven und negativen Fraktionen.
   1. Stellen Sie die Lautstärke bis zu 12 ml mit Isolationspuffer.
   2. Bereiten Sie sechs sterile Rundboden Röhrchen und Pipette 2 ml der Zell-Partikel-Suspension in jedes Röhrchen.
   3. Unmittelbar danach ist die Rohre auf dem Magneten. Inkubieren sie für 10 min bei RT.
   4. Halten Sie die Rohre auf dem Magneten und den Überstand vorsichtig abziehen. Der Überstand enthält die negative Fraktion.
   5. Entfernen Sie den Schlauch aus dem Magneten und 2 ml Isolationspuffer.
   6. die Zellen durch Auf- und Abpipettieren vorsichtig resuspendieren.
   7. Die Röhrchen wieder auf den Magneten. Inkubieren für 5 min bei RT.
   8. Halten Sie die Rohre auf dem Magneten und den Überstand vorsichtig abziehen. Der Überstand enthält die negative Fraktion.
   9. Entfernen Sie die Schläuche aus dem Magneten und 2 ml Isolationspuffer in jedes Röhrchen. die Zellen durch Auf- und Abpipettieren vorsichtig resuspendieren.
   10. Übertragen Sie die positive Fraktion in ein steriles 50-ml-Tube und stellen Sie die Lautstärke auf 50 ml unter Verwendung von sterilen D-PBS.

3. Stimulation von isolierten Monozyten mit IL-4 und GM-CSF

1. Das Röhrchen wird in die Zentrifuge und drehen Sie es bei 400 × g für 10 min bei 4 ° C mit Bremse.
2. Den Überstand aspirieren und wieder die Zellen in 50 ml D-PBS.
3. Je 50 ul in ein 1,5 ml Röhrchen mit 450 & mgr; l D-PBS. Vortex die 1,5-ml-Röhrchen kräftig und zählen Sie die Zellen in einer Neubauer-Kammer oder eine andere Zelle Zählgerät.
4. Legen Sie die 50-ml-Röhrchen in die Zentrifuge und drehen Sie es bei 400 × g für 10 min bei 4 ° C mit Bremse.
   HINWEIS: Wenn die negative Fraktion, peripheren Blut-Lymphozyten (PBL) enthält, auch erforderlich ist, führen Sie das Waschen und Zählen Schritte ähnlich zu tSchlauch der positiven Fraktion (Schritte 3,1-3,5).
5. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 1 x 10 ⁶ / ml mit vorgewärmten Kulturmedium (RPMI 1640 Medium , ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem FBS und 1% L-Glutamin - Lösung) und Pipette 3 ml / Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen.
   HINWEIS: Wenn hitzeinaktiviertem autologem Plasma verwendet, ersetzen Sie die 10% FCS mit 1-5% autologem Plasma, nach dem Versuchsaufbau.
6. Stimulierung der Monozyten mit rekombinantem humanem IL-4 (250 U / ml) und rekombinantem Human-GM-CSF (1000 U / ml) pipettiert, die Cytokine direkt in das Kulturmedium. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO _2.
7. Re-Stimulierung der Zellen mit IL-4 (250 U / ml) und GM-CSF (1000 U / ml) nach 48 h durch das Pipettieren Cytokine direkt in das Kulturmedium.
   HINWEIS: Wenn es irgendwelche Anzeichen für eine Versauerung durch den pH-Indikator in dem Medium gezeigt sind, mit vorgewärmten Kulturmedium die Hälfte des Mediums ersetzen.
8. Ernte unreifen dendritischen Zellen am Tag 5 füraus der 6-Well-Platte down-stream-Experimente durch die kultivierten Zellen pipettiert und in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen nach dem Pipettieren des Kulturmediums nach oben und unten ein paar Mal.
9. Zählen Sie die Zellen und färben eine Probe von isolierten Monozyten mit anti-human Antikörper gegen CD11b, CD11c und DC-SIGN / CD209, zusammen mit einem Zellebensfähigkeit Farbstoff. Zur Vermeidung von unspezifischer Bindung der Antikörper bei der Oberflächenfärbung, die Verwendung von Fc-Rezeptor-Reagenzien oder Rinderserumalbumin (BSA) Puffer blockiert wird dringend empfohlen.
10. Analyse der Probe, die die Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung von Farbstoff, entsprechend dem Protokoll des Herstellers durch Zytometrie Durchführung fließen, um die Reinheit und Lebensfähigkeit der erzeugten iDCs zu beurteilen.

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Ergebnisse

Nach der Zentrifugation von antikoaguliertem Blut ein Sucrosekissen, peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) unter Verwendung von in einem Interphase auf dem Dichtegradienten-Medium (Abbildung 1) angereichert. Nachdem die PBMCs abgezogen werden, wird FACS - Analyse durchgeführt , um die verschiedenen Zellpopulationen innerhalb der PBMCs zu charakterisieren mit Lineage Marker (zB CD3 für T - Lymphozyten, CD14 für Monozyten und CD19 für B - Lymphozyten). ...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (MDDCs) durch die Isolierung von humanen Monozyten aus antikoaguliertem Blut eines magnetischen Nanopartikel-basierten Assay. In diesem Protokoll werden die Zentrifugationsschritte stromaufwärts der Zellisolierungsverfahren durchgeführt, was zu einer Anreicherung der PBMC-Fraktion führt. Obwohl Zellen während der Zentrifugation verloren gehen würde, den Inhalt eines Vollblut-Packung auf Dichtegradienten-Medium zu überlagern 2...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19	BD Biosciences	555415
APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e	BD Biosciences	551073
BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles	BD Biosciences	557769
BD Imagnet	BD Biosciences	552311
BSA (Albumin Fraction V)	Carl Roth	EG-Nr 2923225
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Costar	3506
Density gradient media: Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare Bio-Sciences	17-5442-03
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Falcon 10 ml Serological Pipet	Corning	357551
Falcon 25 ml Serological Pipet	Corning	357525
Falcon 50 ml High Clarity PP Centrifuge Tube	Corning	352070
Falcon Round-Bottom Tubes	Corning	352054
FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a	BD Biosciences	555339
Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent)	Tonbo biosciences	13-0870
GM-CSF	MACS Miltenyi Biotec	130-093-862
Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America)	Gibco	10500-064
Hettich Rotanta 460R	Hettich	---
IL-4 CC	PromoKine	C-61401
Isolation buffer: BD IMag Buffer (10x)	BD Biosciences	552362
L-Glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513
Microcentrifuge tubes, 1.5 ml, SuperSpin	VWR	211-0015
PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2	BD Biosciences	555398
PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46	BD Biosciences	551265
RPMI-1640 medium	Sigma-Aldrich	R0883
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020