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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, die Kraft der Wechselwirkungen zwischen einem gut definierten anorganischen Oberfläche und entweder Peptide oder Aminosäuren durch Einzelmolekülkraftspektroskopie-Messungen mit einem Rasterkraftmikroskop (AFM) zu messen. Die Informationen aus der Messung erhalten wird, ist wichtig, um besser auf die Peptid-anorganischem Material Interphase zu verstehen.

Zusammenfassung

Die Wechselwirkungen zwischen Proteinen oder Peptiden und anorganischen Materialien führen zu mehreren interessanten Prozessen. Führt beispielsweise zur Bildung von Verbundmaterialien mit einzigartigen Eigenschaften Proteine ​​mit Mineralien kombiniert. Zusätzlich wird der unerwünschte Prozess der biologischen Verschmutzung durch die Adsorption von Biomolekülen eingeleitet, vor allem Proteine, auf Oberflächen. Diese organische Schicht wird eine Haftschicht für Bakterien und ermöglicht es ihnen, mit der Oberfläche zu interagieren. die grundlegenden Kräfte zu verstehen, die die Wechselwirkungen an der organisch-anorganischen Schnittstelle regeln ist daher wichtig, für viele Bereiche der Forschung und könnte auf das Design neuer Materialien für optische, mechanische und biomedizinische Anwendungen führen. Dieses Papier zeigt eine Einzelmolekülkraftspektroskopie-Technik, die eine AFM verwendet die Adhäsionskraft zwischen entweder Peptide oder Aminosäuren und anorganischen Oberflächen gut definiert zu messen. Diese Technik beinhaltet ein Protokoll für das Biomolekül auf dem AFM BefestigungsSpitze eine kovalente flexiblen Linker durch und Einzelmolekülkraftspektroskopie-Messungen durch Rasterkraftmikroskop. Außerdem wird eine Analyse dieser Messungen enthalten.

Einleitung

Die Wechselwirkung zwischen Proteinen und anorganischen Mineralien führt zum Aufbau von Verbundmaterialien mit besonderen Eigenschaften. Dazu gehören Materialien mit hoher mechanischer Festigkeit oder einzigartigen optischen Eigenschaften. 1, 2 erzeugt beispielsweise die Kombination des Proteins Kollagen mit dem Mineral Hydroxylapatit entweder weichen oder harten Knochen für unterschiedliche Funktionalitäten. 3 Kurze Peptide können auch anorganische Materialien mit hoher Spezifität zu binden. 4, 5, 6 Die Spezifität dieser Peptide ist für die Entwicklung neuer magnetischen und elektronischen Materialien, 7, 8, 9 nanostrukturierten Materialien, Züchten von Kristallen Herstellung, 10 und Synthese von Nanopartikeln. 11 Das Verständnis der Mechanismus Wechselwirkungen zwischen Peptiden oder Proteinen und anorganischen Materialien zu Grunde liegen , damit es uns ermöglichen , neue Verbundwerkstoffe mit verbesserten adsorptive Eigenschaften zu entwerfen. Zusätzlich kann, da die Zwischenphase von Implantaten mit einer Immunantwort durch Proteine ​​vermittelt wird, besser auf die Wechselwirkungen von Proteinen mit anorganischen Materialien zu verstehen, wird sich verbessern unsere Fähigkeit Implantate zu entwerfen. Ein weiterer wichtiger Bereich, die Proteine ​​interagieren mit anorganischen Oberflächen ist die Herstellung von Antifouling-Materialien beinhaltet. 12, 13, 14, 15 Biofouling ist ein unerwünschter Vorgang , bei dem Organismen an einer Oberfläche befestigen. Es hat viele schädliche Auswirkungen auf unser Leben. Zum Beispiel führt Biofouling von Bakterien auf medizinischen Geräten im Krankenhaus erworbenen Infektionen. Biofouling von Meeresorganismen auf Booten und großen Schiffen erhöht die Verbrauch von Kraftstoff. 12, 16, 17, 18

Einzelmolekülkraftspektroskopie (SMFS), einem AFM verwendet wird, kann direkt auf die Wechselwirkungen zwischen einer Aminosäure oder einem Peptid mit einem Substrat zu messen. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 auch andere Methoden wie Phage - Display, 27, 28 Quarzkristall - Mikrowaage (QCM) 29 oder Oberflächenplasmonresonanz (SPR) 29, 30, 31, 32,"ref> 33 messen die Wechselwirkungen von Peptiden und Proteinen an anorganischen Oberflächen in bulk. 34, 35, 36 Dies bedeutet, dass die Ergebnisse durch diese Verfahren auf Ensembles von Molekülen oder Aggregaten beziehen erhalten. In SMFS eine oder sehr wenige Moleküle werden an die AFM-Spitze befestigt ist und ihre Wechselwirkungen mit dem gewünschten Substrat gemessen. Dieser Ansatz kann erweitert werden, die Proteinfaltung zu untersuchen, indem das Protein von der Oberfläche zu ziehen. Zusätzlich kann es verwendet werden Wechselwirkungen zwischen Zellen und Proteinen und die Bindung von Antikörpern an ihre Liganden zu messen. 37, 38, 39, 40 Diese Veröffentlichung beschreibt detailliert , wie entweder Peptide oder Aminosäuren an die AFM - Spitze verwendet Silanol Chemie zu befestigen. Darüber hinaus erklärt das Papier wie Kraftmessungen durchführen und wie das zu analysierenErgebnisse.

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Protokoll

1. Tipp Modifikation

  1. Kauf Siliziumnitrid (Si 3 N 4) AFM Kragarmen mit Siliziumspitzen (nominal Auslegerradius ~ 2 nm).
  2. Reinigen Sie jede AFM Cantilever von 20 min in wasserfreiem Ethanol getaucht. Trocken bei Raumtemperatur. Behandeln dann die Auskragungen von ihnen zu O 2 Plasma für 5 Minuten ausgesetzt wird .
  3. Hängen Sie das saubere oben genannten Tipps (3 cm) einer Lösung, die Methyltriethoxysilan und 3- (Aminopropyl) triethoxysilan in einem Verhältnis von 15: 1 (v / v) in einem Exsikkator unter einer inerten Atmosphäre (entweder Stickstoff oder Argon) und schließen Sie den Exsikkator eine Vakuumpumpe. Vakuum 2 h eine Monoschicht dieser beiden Arten von Misch Silanverbindungen zu bilden.
  4. Verwenden Sie Halter eine Metallspitze (hergestellt für diesen Prozess) die Spitzen auf einer heißen Platte zu platzieren. Dann trocknen Sie die Tipps für 10 Minuten bei 70 ° C unter atmosphärischen Bedingungen. Vor dem Gebrauch reinigen Sie die Kochplatte, metallischen Halter und Pinzette unter Verwendung von Ethanol.
  5. Kühlen Sie die Tipps bei Raum temperatur, und tauchen dann die Spitzen in eine Lösung von Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimid (Fmoc-PEG-NHS, MW 5.000 Da) bei einer Konzentration von 5 mM in Chloroform, enthaltend 0,5% (v / v) Triethylamin 1 h bei Zimmertemperatur.
  6. Tauchen Sie die Spitzen in Chloroform für 5 min und dann tauchen sie in Dimethylformamid (DMF) für weitere 5 min. Um die Fmoc-Gruppe der gebundenen PEG-Molekülen zu entschützen, tauchen die Spitzen in 20% Piperidin (v / v) in DMF für 30 min. Tauchen Sie die Spitzen in DMF für 4 min und dann in N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) für weitere 4 min. Wiederholen Sie den sequentiellen Eintauchens dreimal.
  7. Für die Kopplung von Aminosäuren, tauchen die Spitzen in einer Lösung, die N-terminal geschützten Aminosäure (AA) / Diisopropylethylamin (DIPEA) / 2- (1H-Benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluophosphate (HBTU), in einem molaren Verhältnis von 1: 1: 1 bei einer Gesamtkonzentration von 30 mM in 5 mL NMP für 1,5 h.
  8. Für Peptidkupplung, tauchen die Spitzen in eine 5 ml Lösung containing 40 mg des geschützten Peptids (N-Terminal und Seitenketten, beispielsweise Fmoc-Gln (Trt) -Pro-Ala-Ser (tBu) -Ser (tBu) -Arg (PBF) -Tyr (tBu) -COOH). 15 mg 2- (1H-Benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphat (HBTU) und 5 ml DIPEA in NMP für 2 h.
  9. Tauchen Sie die Spitzen in NMP für 4 min. Dann wird das Aufreiben Frei / nicht - umgesetztes NH 2 durch die Acetylgruppe zu schützen, tauchen die Spitzen für 30 min in einem Gemisch aus Essigsäureanhydrid / DIPEA in einem Molverhältnis von 4: 1 und einer Gesamtkonzentration von 0,65 M in NMP.
  10. Für Peptidkupplung, führen zwei zusätzliche Schritte.
    1. Um die Seitenketten des Peptids zu entschützen, tauchen die Spitzen in einer Lösung, die 95% TFA, 2,5% Triisopropylsilan und 2,5% Wasser für 1 h, und dann waschen mit Chloroform und DMF.
    2. Um die Fmoc-Gruppe des Peptids zu entfernen, die Spitzen in 20% Piperidin (v / v) in DMF für 30 Minuten tauchen.
  11. dip sequentiell die Peptid / Aminosäure-funktionalisierend-Tipps für vier Minuten jeweils in DMF (für Peptide) oder NMP (für Aminosäuren), Chloroform, 50% Ethanol und Wasser. trocknen schließlich die Spitze in der Luft.

2. Oberflächenvorbereitung

  1. Bereiten Glimmer. Cleave der Substrate (9,9 mm Durchmesser) vor jedem Gebrauch von Scotch Klebeband. Dann waschen Sie die Oberflächen mit dreifach destilliertem Wasser (TDW).
  2. Bereiten TiO 2 -beschichteten Silizium.
    1. Schneiden Sie die Siliziumscheibe (100) in 2 cm große Quadrate einen Diamantstift.
    2. Legen Sie das Substrat in einem 15 ml-Reagenzglas mit Aceton gefüllt und beschallen es für fünf Minuten in einem Ultraschallbad. Dann setzen Sie diese Oberfläche in einem 15 ml-Reagenzglas mit Isopropanol gefüllt und beschallen es für 5 min. Trocknen des Substrats unter Verwendung von Stickstoff.
    3. Auflösen des oberflächenaktiven Mittels (zB Byk-348) in Ethanol mit 5% (Gewicht / Volumen) Lösung herzustellen. Dann fügen 0,02 ml der Tensidlösung in einen 2 ml 30% TiO 2 -Dispersion.
    4. Aus der erhaltenen Lösung, 0 tropfen gegossen.2 mL auf einem sauberen Si-Substrat.
    5. Tempern, diese Drop-gegossenen Oberflächen bei 250 ° C für 2 h in Luft. 41

3. Die Einzelmolekülkraftspektroskopie-Messungen

  1. Bringen Sie die gewünschte Oberfläche mit einem metallischen Halter des AFM mit handelsüblichen Zweikomponenten-Klebstoff. Platzieren Sie den metallischen Halter in dem Glashalter des AFM, das als eine kleine Petrischale geformt ist. Füllen Sie diesen Halter mit Tris-Puffer (50 mM pH = 7,4) oder einem beliebigen Medium. Dann legen Sie die Halterung an der AFM-Stufe unterhalb der Spitzenhalter.
  2. Kalibrieren Sie die AFM - Cantilever mit Federkonstanten im Bereich von 10 bis 30 pN / nm 26 die thermische Fluktuationsmethode (in der AFM - Software im Lieferumfang enthalten) mit einer absoluten Unsicherheit von etwa 10%.
  3. Messen der Kraft der Wechselwirkung durch Annäherung an die Aminosäure oder Peptid-funktionalisierten Spitze auf das Substrat, bis es in Kontakt mit dem Substrat mit einer KompressionKraft von ~ 200 pN und dann sofort die Spitze bei verschiedenen Geschwindigkeiten von 0,1 bis 0,8 um / s für einen Abstand von ~ 200 nm zurückzuziehen.

4. Datenanalyse

  1. Konvertieren Sie die Ablenkungswerte (V) zu zwingen, durch die Photodiode Empfindlichkeit multipliziert (V / m) und mit Hilfe der experimentell bestimmten Federkonstante. 42 Dies wird automatisch durch die AFM - Software.
    1. FD-Kurven mit einem einzigen Molekül Ereignisse, Rekord mehrere hundert Kurven (800-1500) zu erhalten. Erhalten zwei Peaks in einem Einzelmolekül-Kurve: die erste Spitze zeigt unspezifische Wechselwirkungen zwischen der Spitze und der Oberfläche und der zweite Peak entspricht dem spezifischen Wechselwirkung des Moleküls mit der Oberfläche. Wenn die Kurve FD mehr als diese zwei Spitzen enthalten, entsorgen Sie sie nicht bei der Berechnung der wahrscheinlichsten Kraft.
      HINWEIS: Nur einzelne Haftung Ereignisse werden auf ein Konto genommen (von 10 bis 30% der Kurven). 43
  2. Um die scheinbare Belastungsgeschwindigkeit, fit mindestens 50 Kraft in Abhängigkeit vom Abstand Kurven mit der wurmartige Kette (WLC) Modell 44 kurz vor dem Bruch berechnen eine Reihe von Belastungsgeschwindigkeiten zu erhalten, die zur Herstellung von Histogrammen dann verwendet werden , die scheinbaren Beladungsraten. Leiten Sie die Trennkräfte zwischen den Peptiden / Aminosäuren und Oberfläche aus dem Sprung in Kraft, nachdem der Ausleger von dem Substrat zu trennen.

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die Spitze Änderungsverfahren. Im ersten Schritt wird eine Plasmabehandlung ändert sich die Oberfläche des Siliciumnitrid-Spitze. Die Spitze präsentiert OH-Gruppen. Diese Gruppen werden dann mit den Silanen reagieren. Am Ende dieser Stufe wird die Oberfläche der Spitze wird durch freie NH2 - Gruppen abgedeckt werden. Diese freien Amine reagiert dann mit Fmoc PEG-NHS, eine kovalente Linker. Die Fmoc Gruppe des PEG-Linker wird durch pipyri...

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Diskussion

Die Schritte 1.3, 1.4 und 1.7 in dem Protokoll mit umfangreichen Sorgfalt erstellt und auf sehr sanfte Weise werden sollte. In Schritt 1.3, sollte die Spitze nicht mit dem Silan-Gemisch in Kontakt stehen und die Silanisierung Verfahren in einer inerten Atmosphäre (frei von Feuchtigkeit) durchgeführt werden sollte. 45 Dies wird getan , um Mehrschichtbildung zu verhindern und weil Silanmoleküle leicht hydrolysieren in Gegenwart von Feuchtigkeit. 45

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

This work was supported by the Marie Curie International Reintegration Grant (EP7). P. D. acknowledges the support of the Israel Council for Higher Education.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Silicon nitride (Si3N4) AFM cantilevers with silicon tipsBruker (Camarilo, CA, USA)MSNL10, nominal cantilevers radius ~2 nm 
Methyltriethoxysilane Acros Organics (New Jersey, USA)For Silaylation of the AFM tip 
3-(Aminopropyl) triethoxysilaneSigma-Aldrich (Jerusalem, Israel)For Silaylation of the AFM tip
TriisopropylsilaneSigma-Aldrich (Jerusalem, Israel)Used for peptide deprotection
N-EthyldiisopropylamineAlfa-Aesar (Lancashire, UK)Used for tip modification
TriethylamineAlfa-Aesar (Lancashire, UK)Used for tip modification
PiperidineAlfa-Aesar (Lancashire, UK)Used for tip Fmoc deprotection
Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimide  (Fmoc-PEG-NHS)Iris Biotech GmbH (Deutschland, Germany)Used as the covalent flexible linker  (MW = 5,000 Da)
2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU)Alfa Aser (Heysham, England)Used as a coupling reagent. 
N-methyl-2-pyrrolidone (NMP)Acros Organics (New Jersey, USA)Used as Solvent in Tip modification procedure
DMF (dimethylformamide)Merck (Darmstadt, Germany)Used as Solvent in Tip modification procedure
ChloroformBio-Lab (Jerusalem, Israel)Used as Solvent in Tip modification procedure
Ethanol (Anhydrous)Gadot (Netanya, Israel)Used as Solvent in Tip modification procedure
Trifluoro acetic acid (TFA)Merck (Darmstadt, Germany)
Acetic anhydrideMerck (Darmstadt, Germany)
PeptidesGL Biochem (Shanghai, China).
Phenylalanine and Tyrosine Biochem (Darmstadt, Germany) 
30% TiO2 dispersion in the mixture of solvent 2-(2-Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP)Applied Vision Laboratories (Jerusalem, Israel)(30%) in the mixture of solvent 2-(2 Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP). Used for TiO2 substrate preparation
Mica substratesTED PELLA, INC. (Redding, California, USA)9.9 mm diameter

Referenzen

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