Studieren Mitochondrial Struktur und Funktion in<em&gt; Drosophila</em&gt; Ovarien

Zusammenfassung

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Zusammenfassung

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Einleitung

Die Mitochondrien sind klassisch als zelluläre Kraftwerk beschrieben, da sie die Haupt Sitze der Energieproduktion in differenzierten Zellen sind. Darüber hinaus spielen Mitochondrien eine wichtige Rolle im Stoffwechsel, Wärmeerzeugung, Lipid - Modifikation, Calcium und Redoxhomöostase, die Orchestrierung von Zellsignalprozesse, etc ^1. Mitochondria auch eine aktive Rolle bei der Induktion von Zelltod ^2, sowie in der Zellzyklusregulation ³ spielen. Solche Multifunktionalität ergeben sich folgende grundlegende Fragen: a) Wie Mitochondrien führen alle diese Funktionen gleichzeitig und b) gibt es spezifische mitochondriale Pools oder Subzonen, die für verschiedene Funktionen spezialisiert sind? In diesem Zusammenhang ist es wichtig, dass die multifunktionale Mitochondrien in ihrer Form, Größe und Struktur innerhalb einzelner Zellen und dass die Beharrungsform der Mitochondrien variieren zwischen Zelltypen können dynamisch sind zu beachten. Jahrzehnte der Forschung aus verschiedenen LaborOratorien legen nahe , dass die Änderung der mitochondrialen Form, Größe und Struktur, die kollektiv mitochondrialen Dynamik genannt, entscheidend ist ^4,5,6 verschiedenen mitochondrialen Funktionen _{aufrechtzuerhalten.} Diese Ergebnisse heben die Möglichkeit, dass die Mitochondrien ihre Multifunktionalität, die aufgrund ihrer strukturellen Dynamik erreichen kann.

Umfangreiche Anstrengungen unternommen werden, die mitochondriale Struktur-Funktions-Beziehung zu verstehen. Die Dynamik der mitochondrialen Struktur wird durch ihre Fähigkeit zu unterziehen Spaltung und Fusion Ereignisse miteinander in erster Linie beibehalten. Fission von großen Mitochondrien wandelt sie in kleinere mitochondrialen Elemente, während Fusion zwischen zwei kleineren Mitochondrien führt diese in ein größeres mitochondrialen Element ^7. Außerdem kann transient Fusion von zwei Mitochondrien auftreten, um die Vermischung von deren Inhalt zu ermöglichen. Die Spaltung und Fusion Ereignisse der inneren und der äußeren mitochondrialen Membranen werden sorgfältig durch spec geregeltific setzt von Proteinen. Die Kernspaltung Maschinen ist dynamin-verwandtes Protein 1 (DRP1) aus, der aus dem Cytosol in die Mitochondrien durch seine Wechselwirkung mit bestimmten bona fide mitochondriale Proteine (zB Fis1 oder MFF1) eingestellt wird, während DRP1 Funktion auch reguliert werden kann durch andere Proteine auf der mitochondrialen Oberfläche ^4. Obwohl DRP1 auf der äußeren Membran arbeitet, beeinflussen seine Spaltung Fähigkeiten, um die innere Membran als auch. Die Orchestrierung der Spaltung von äußeren und inneren Mitochondrienmembranen ist nicht gut verstanden. Auf der anderen Seite, die Fusion der inneren Membran wird im Kern durch die Aktivitäten der opA1 geregelt, während mitofusins die Fusion der äußeren Membran ⁵ regieren. Der Rest der entgegen Spaltung und Fusion Ereignisse der Mitochondrien diktieren die Steady-State-mitochondriale Form in einer Zelle. Zum Beispiel würde Unterdrückung der mitochondrialen Spaltung in vollständig und ohne Widerstand Fusion, während die Überaktivität der Mitochondrienl Spaltung würde zu einer Fragmentierung der Mitochondrien ³ führen.

Die Untersuchung der mitochondrialen Struktur-Funktions-Beziehung geht es vor allem zwei komplementäre Ansätze: a) Analyse der zellulären und organismischen Phänotypen nach genetischen Manipulation von mitochondrialen Spaltung / Fusionsproteine ​​und b) die direkte Beurteilung der mitochondrialen Struktur und Funktion. Es ist bemerkenswert, dass genetische Analysen nicht immer die direkte Funktionalität des Moleküls an der Hand (in diesem Fall die mitochondriale Spaltung / Fusionsproteine) kann sich herausstellen, wie die Phänotypen aufgrund Nebenwirkungen auftreten können. Daher ist es von größter Bedeutung, Werkzeuge zu entwickeln und zu verwenden, um direkt mitochondriale Struktur und Funktion zu untersuchen. Bei der Beurteilung der mitochondrialen Struktur beinhaltet verschiedene Mikroskopie-Tools. Die Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie lebender Zellen fortgeschritten ist stark, die Studien der mitochondrialen Dynamik, da die mitochondriale Dynamik überwacht werden können, sowohl qualitativ als auch quantitathungsweise die entsprechenden Fluoreszenzmikroskopie Werkzeuge und Techniken unter Verwendung von ^8. Die Fluoreszenzmikroskopie-basierte Werkzeuge wurden mitochondriale Struktur und Funktion in lebenden und fixierten Drosophila melanogaster Gewebe zu studieren entwickelt, die Aufklärung der Bedeutung der mitochondrialen Dynamik in vivo ^9. Diese und verwandte Verfahren werden hier beschrieben, mit dem Ziel , mitochondriale Struktur studieren und Funktion in der Drosophila Ovars.

Das Drosophila Ovar besteht aus Keimbahn und somatischen Abstammungslinien, die von ihren jeweiligen adulten Stammzellen entstehen , die ^10,11 in der Germarium befinden. Sechzehn - Syncytial - Keimzellen (GCs) durch somatische Follikelzellen eingekapselt erhalten (FCs) einzelne Ei Kammern zu bilden , die aus dem Germarium (Abbildung 1) entstehen. Eines der 16 GCs eine Eizelle zu werden erhalten begangen, und die restlichen 15 GCs in Nährzellen entwickeln, die das Wachstum der Eizelle Kammer unterstützen, Die Reifung der Eizelle zu erleichtern, bevor sie verlegt wird. Die Mehrzahl der FCs laufen 9 Runden von Mitosen, bevor sie den mitotischen Zellzyklus verlassen terminal mit in einer strukturierten Epithelzellschicht unterscheiden, bestehend aus vorderen Follikelzellen (AFCs) posterior Follikelzellen (PFCs) und Hauptkörperzellen (MBCs) . Die aufeinander folgenden Ei Kammern sind durch Stengel Zellen verbunden, die Zellen unterschieden, die auch von den FCs früh in der Entwicklung ableiten. Mitochondriale Form durch die DRP1 mitochondrialen Spalt Protein reguliert wird im Prozess der Differenzierung während der normalen Entwicklung des Drosophila ovarian FC Schicht ^9,12 beteiligt. Die Verfahren , die in diesen Studien verwendet , um die Beteiligung von DRP1 in Drosophila Follikel Zellschicht Entwicklung zu identifizieren , werden hier beschrieben.

Protokoll

1. Herstellung von Drosophila (die Werkzeuge erforderlich sind , die in 2A dargestellt)

1. Für jede der beschriebenen Versuche, sammeln Drosophila (bei Raumtemperatur gehalten, oder 25 ° C) innerhalb von 5 Tagen nach dem Schlüpfen und legen Sie sie in einem Fläschchen mit 5 gefüllt - 7 ml Drosophila Lebensmittel (siehe Materialien Tabelle), mit nicht mehr als 25 in jedem Fläschchen fliegt; pflegen eine weiblich: männlich Verhältnis von 2: 1.
2. Streuen Sie eine kleine Menge granuliert Hefe Drosophila Eierproduktion zu stimulieren. Führen Sie experimentelle Manipulation innerhalb von 2 - 4 Tage.

2. Dissection von Drosophila Ovarien (die Werkzeuge erforderlich sind , die in 2A dargestellt)

1. Warm Insekten Sezieren Medium (siehe Materialien Tabelle) auf Raumtemperatur, 25 ° C. Füllen Sie drei Vertiefungen einer acht gut Glas Sezieren Schale, mit 200 & mgr; l Medium in jeder Vertiefung.
2. Anesthetize Drosophila mit CO _{2 durch die Nadel der Luftpistole unter dem Fläschchen Stecker platzieren. Legen Sie sie auf eine Fliege-Pad. Mit einem Binokular, aussortieren 5 Frauen und legen Sie sie in der ersten und der Sezieren Gericht. Griff eines Drosophila zu einem Zeitpunkt , wenn Live - Mikroskopie durchgeführt wird .}
3. Während durch das Okular des Präpariermikroskop suchen, den Thorax aus dem Bauch mit zwei Paaren von Zange durchtrennen. Mit Hilfe der Zange, übertragen sorgfältig die Bäuche auf den zweiten und der Schale.
4. Verwenden Sie eine Zange den Bauch am hinteren Ende zu halten, und langsam die Ovarien herausschieben (zusammen mit den anderen Bauchinhalt) mit dem anderen Paar der Zange. Sollte dieser Versuch fehlschlägt, entfernen Sie vorsichtig die Bauch Exoskelett durch die Zange in die vordere Ende Einsetzen der Ovarien zu lösen.
5. Mit Hilfe der Zange, halten eine individuelle Ovar durch die undurchsichtigen hinteren Ende (dh die Dotter gefüllt, im Spätstadium Eier) und vorsichtig auf die dritte und der Schale bewegenfür necken es für Live-Mikroskopie (Schritt 3) oder zur Fixierung zu verarbeiten Immunofärbung (Schritt 7) auszuführen.
6. Sie vorsichtig die Schutzhülle necken aus um die Ovarien zum vorderen Ende jedes Ovar eine Hänselei Nadel leicht aus dem hinteren fegt, während sie von dem hinteren Ende mit einer Pinzette zu halten.
   HINWEIS: Um eine Beschädigung während necken, biegen Sie die Nadelspitze und zoomen auf jedem Ovar durch eine Erhöhung der Vergrößerung des Mikroskops (2A) zu minimieren. Necken sollten wirksam genug sein, um die Hülle zu durchbrechen, aber es sollte auch sorgfältig die Integrität der Ovariolen zu bewahren erfolgen.

3. Vorbereitung für das Live-Gewebe-Mikroskopie

HINWEIS: Die Werkzeuge erforderlich sind , die in 2A dargestellt ist .

1. Vor Präparation Drosophila, bereiten polyL-Lysine beschichtete Kammern. Zu diesem Zweck legen Sie zwei 20-ul Tropfen polyL-Lysin (0,1 mg / ml) auf der coverglass (14 mm, Nr 0) aus einem Glasboden-Petrischale (35 mm) in einem angemessenen Abstand voneinander, um das Verschmelzen der Tropfen zu verhindern. Luft trocknen die Platten für 1 h bei 37 ºC und die Ränder des weißen polyL-Lysine Film auf der Unterseite der Platte mit einer löschbaren Marker markieren.
   HINWEIS: Die polyL-Lysine beschichteten Kammern können für eine Woche bei 4 ° C gelagert werden. Wenn eine vorher beschichtete Kammer mit, bringen Sie es auf Raumtemperatur vor der Drosophila Präparation beginnen.
2. Festlegen der Abtastparameter auf dem konfokalen Mikroskop, um sicherzustellen, daß die Probe unmittelbar nach der Beendigung der Dissektion und Befestigungs abgebildet werden kann, wie weiter unten.
3. Legen Sie eine seziert und stichelte Ovar (nach Schritt 2 und gefärbt, falls erforderlich, folgenden Schritt 5) auf einer markierten polyL-Lysine-beschichteten Bereich und die Ausbreitung der Ovar mit der Hänselei Nadel, um die Ovariolen trennen. Legen Sie eine 10-ul Tropfen Insekten Sezieren Medium auf dem Ovar, um sicherzustellen, t zu deckener ganze polyL-Lysine-beschichtete Fläche. Decken Sie die Petrischale.
4. Sofort durchführen Konfokalmikroskopie der montierten Probe bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Nur eine Drosophila sollte zu einem Zeitpunkt präpariert, verarbeitet und dargestellt werden. Auch Mikroskopie sollte nicht bei 37 ° C durchgeführt werden, die eine Hitzeschock - Umgebung für die Drosophila Gewebe nachahmen.

4. Fluoreszenz-Verlust in den Photobleaching (FLIP) Assay zur Beurteilung Mitochondrial Matrix Kontinuität

HINWEIS: Die mitochondriale Matrix Kontinuität in einer fusionierten mitochondriale Struktur wird nach der vollständigen Verschmelzung der eine Progression durch die Zwischenschritte folgende mitochondrialen inneren und äußeren Membranen hergestellt. Spaltung von Mitochondrien kann die gleichen Schritte , aber in der umgekehrten Richtung (3A) folgen. FLIP ist eine Zeitraffer-Mikroskopie-basierten semi-quantitatives Verfahren, das verwendet werden kann mitochondrialen Matrix Kontinuität in der zur Beurteilungfinal geschmolzenen Zustand von ex vivo Mitochondrien (Schritte 3 und 4 in 3A) in lebenden Drosophila Ovarien ^9. Der FLIP - Assay wird als eine kleine Region von Interesse (ROI) der Mitochondrien durchgeführt ein fluoreszierendes Molekül in der mitochondrialen Matrix zum Ausdruck , die in regelmäßigen Abständen (FLIP ROI in 3A) gebleicht wird. Als Ergebnis kann jede umgebende mitochondrialen Region , die mit der FLIP ROI (experimental ROI in 3A) kontinuierlich ist wird Signal durch den Austausch von Molekülen in der kontinuierlichen mitochondrialen Matrix verlieren. Die FLIP - Experimente hier gezeigt , sind auf transgene Drosophila exprimiert mitoYFP, durchgeführt , die die mitochondriale Targeting - Sequenz der menschlichen Cytochrom - Oxidase - Untereinheit VIII mit YFP markiert enthält es der mitochondrialen Matrix in einer frei diffundierbare Form abzuzielen. Ein ähnliches Experiment kann auch mit dem Mito pUASP-Mito-GFP-Transgens durchgeführt werden, wie zuvor berichtet ^{9. Ein ähnliches Protokoll kann FLIP mit einer Sonde zur mitochondrialen Intermembranraum gezielt eingesetzt werden , um die Kontinuität zu erfassen , die aus der Fusion der äußeren , nicht jedoch aus der inneren Mitochondrienmembranen (Schritt 2 in Figur 3A).}

1. Öffnen Sie die Bildaufnahme - Software auf dem konfokalen Mikroskop und legen Sie die entsprechenden Scan - Parameter in der "Erwerb" Tab (Tabelle 1). Überprüfen Sie die "Zeitreihe", "Bleaching" und "Regionen" Boxen, die einzelnen Registerkarten zu öffnen. Legen Sie die entsprechenden Akquisitionsparameterwerte in jedem Register (Tabelle 1).
   HINWEIS: Die Pinhole offen gelassen werden sollte, da dieses Experiment ausgelegt Gesamtsignal aus dem gesamten mitochondrialen Population in einzelnen Zellen zu überwachen.
2. Verwenden Sie das Okular, um schnell das Feld von Interesse im montierten lebendes Gewebe lokalisieren.
   Hinweis: Um die Ovariolen auswählen, die auf dem Glas-bottome gut verteilt sindd Gericht, da die konfokale Mikroskopie kann nicht auf schwimmendem Ovariolen durchgeführt werden.
3. Klicken Sie auf "leben" ein Live-Bild des ausgewählten Interessengebiet zu erwerben. Klicken Sie auf "Stop" Live-Scan zu stoppen.
4. Falls erforderlich, stellen Sie die Aufnahmeparameter so, dass die erfasste Fluoreszenzsignal unterhalb der Sättigungspegel ist (durch das Fehlen von roten Pixeln angezeigt, wenn die Option "Bereichsanzeige" aktiviert ist), mit dem Hintergrund definiert als durch die Einstellung der Offset-Werte gesetzt.
5. Zeichnen Sie einen kleinen ROI der Bezier Zeichenwerkzeug aus der "Regions" Registerkarte mit der Photobleaching Zone auf dem Bild von Live-Scan erworben abgrenzen.
   HINWEIS: Die Größe des ROI sollte etwa 20 - 50% des gesamten fluoreszierenden mitochondrialen Signal innerhalb der Zelle.
6. Führen Sie die Bildaufnahme durch einen Klick auf "Experiment starten."
7. Quantifizierung der Fluoreszenzintensität unter Verwendung der proprietären oder Open-Source - Software (siehe MaterialienTabelle). Notieren Sie sich die mittlere Signal von der ROI bei denen das repetitive Bleichausgerichtet ist (FLIP); die ROIs wo Bleichen wurde in der gleichen Zelle (experimentell) nicht durchgeführt worden ist; der ROI aus einer anderen ungebleichten Zelle im gleichen Sichtfeld für die Gesamt Bleichen während des Versuchszeitraums (Bleaching) bewertet werden; und der ROI auf den Hintergrundbereich (Hintergrund). Subtrahieren Sie die mittlere Hintergrundsignal aus dem Mittelwert Signal in der anderen ROIs erhalten. Normalisieren das Fluoreszenzsignal mit dem anfänglichen Vorbleiche Signal für die jeweilige Zelle.
8. Zeichnen Sie die normalisierten Daten jedes Standard Plotten Software.

5. Live-Färbung mit fluoreszierenden Farbstoffen Mitochondrial

HINWEIS: Steady-State - mitochondriale Struktur und das Potenzial kann mit Farbstoffen bewertet werden , die spezifisch in die Mitochondrien in lebenden Zellen und Gewebe integrieren. Live - Drosophila Ovarien können ex vivo mit fluoreszierenden mitochondrialen gefärbt werdenFlecken, die Mitochondrien zu visualisieren, mitochondriale reaktive Sauerstoffspezies (Mito-ROS) Produktion, und zur Beurteilung der mitochondrialen Potential pro Masseneinheit zu beurteilen. Dies kann durch Co-Färbung mit der mitochondrialen potentiometrische Farbstoff Tetramethylrhodamin ethylester (TMRE) und einem kompatiblen Live mitochondrialen stain , die die mitochondriale Masse (siehe Materialien Tabelle für die spezifischen Farbstoffe) durchgeführt werden.

1. Verdünnen Sie die Lager der Flecken in warmen Insekt Sezieren Medium auf die endgültigen Arbeitskonzentrationen: mitochondriale Färbung, 250 nM; TMRE, 50 nM; und Mito-ROS-Färbung, 5 uM.
2. Nach Präparation und necken die Ovarien folgenden Schritt 2, legen Sie die Ovarien in 200 ul einer bestimmten Farblösung in eine Vertiefung einer Dissektion Gericht. Inkubieren sie 10 Minuten lang mit dem durch eine geeignete Feld abgedeckt Teller mit Alufolie umwickelt zum Schutz vor Licht. Waschen Sie die gefärbten Ovarien durch sie vorsichtig mit einer Pinzette in 3 aufeinanderfolgenden Vertiefungen bewegen mit deg Medium ohne Flecken.
3. Für die gleichzeitige Färbung mit TMRE und dem kompatiblen Gesamt mitochondrialen Fleck, folgen Sie dem obigen Protokoll zuerst mit TMRE und dann sofort mit der gesamten mitochondrialen Fleck (ohne Waschschritte dazwischen) zu färben.
4. Montieren Sie die Ovarien auf einem polyL-Lysine beschichteten Glasbodenschale nach Schritt 3 und die Vorbereitungen für die konfokale Mikroskopie mit den entsprechenden Scan - Parameter (Tabelle 1), folgende Schritte 4,2-4,4.
   HINWEIS: Das Signal von der eingebauten Farbstoffe hielt nicht bei dem Versuch , die gefärbten Proben zu montieren Medium bei der Montage.
5. Überprüfen Sie die Z-sectioning Feld die Registerkarte zu öffnen. Drehen Sie den Fokus Rad in Richtung der Unterseite der Probe, während sie Live-abgetastet wird, und klicken Sie auf "Set zuerst" die unterste Z-Abschnitt zu definieren. Machen Sie dasselbe, während der Fokus-Rad in Richtung der anderen Richtung bewegt den obersten Abschnitt zu definieren.
6. Führen Sie die Bildaufnahme durch einen Klick auf "Experiment starten."
7. Quantifizieren den Hintergrund korrigierten Fluoreszenzintensität aus den ROIs für das Hintergrundsignal und den einzelnen Zellen (wie in Schritt 4.7) und die Daten zu zeichnen jede Plotten Software.

6. Erzeugung von DRP1 Null Mosaiken

HINWEIS: Die hier verwendete klonalen Strategie stellt das grün fluoreszierende Protein (GFP) -negativen DRP1 null Klone im Hintergrund eines GFP-positive, phänotypisch Wildtyp - Hintergrund , die genotypisch heterozygot für die DRP1 Nullmutation ⁹ ist. Hitzeschock-induzierte Flippase-Flippase Erkennungsziel (FLP-FRT) vermittelter ortsspezifische mitotische Rekombination erzeugt homozygot Klone des funktionell null drpKG03815 Allel. Der Genotyp von Drosophila die DRP1 Mutante trägt , ist drpKG03815 FRT40A / CYO, während der Genotyp des Hitzeschock-induzierte FLP (hsFLP) und UbiGFP klonalen Marker ist hsflp trägt; Ubiquitin nls-GFP (UbiGFP) FRT 40A / Cyo. Der Genotyp des sewählten Nachkommen der Kreuzung zwischen den oben genannten Genotypen ist hsFLP / +; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A.

1. Synchronisieren Sie die Drosophila für virgin Sammlung , indem sie in neue Fläschchen mit frischen Lebensmitteln alle 2 bis 3 Tagen zu bewegen. Überwachen Sie die pupariating Fläschchen täglich um Schwellen jungfräulichen Weibchen zu sammeln.
2. Sammeln Sie mit roten Augen, lockiges-Flügel jungfräulichen Weibchen aus dem mutierten Genotyp DRP1 täglich, einmal morgens und einmal abends, und legen Sie sie in einem separaten Fläschchen. Parallel dazu sammeln männlichen Drosophila mit dunkelroten Augen und gerade Flügel hsflp und UbiGFP innerhalb von 5 Tagen nach dem Schlüpfen tragen.
3. Richten Sie ein Kreuz, indem die Männchen zu den jungfräulichen Weibchen mit einem weiblich: männlich Verhältnis von 2: 1.
4. Streuen Sie eine kleine Menge granuliert Hefe Eierproduktion zu stimulieren.
   HINWEIS: Sie vorsichtig die Drosophila in ein frisches Fläschchen Medien alle 2 bis 3 Tage zu navigieren , um die Menge an Nachkommen erhöhen und Fläschchen Crowding zu reduzieren.
5. Einesthetize, sortieren und sammeln gerade geflügelte, mit roten Augen weiblichen Nachkommen, die innerhalb von 5 Tagen nach dem Schlüpfen.
6. Für den Hitzeschock, legen Sie die gesammelten Drosophila in leere Fläschchen mit einer kleinen Menge von granulierten Hefe und einem kleinen, weichen Wischtuch (die Feuchtigkeit während der Hitzeschock zu absorbieren). Legen Sie das Fläschchen mit der Drosophila in einem Wasserbad bei 38 ° C für 1 h, um in erster Linie Follikel - Zell - Klone erzeugen, und bei 37 ° C für 1 h zweimal täglich (so dass mindestens 5 h zwischen den zwei Wärmeschocks) für zwei aufeinanderfolgende Tage , sowohl Keimbahn und Follikel-Zellklone generieren.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher , dass das Fläschchen vollständig im Wasser bis zur Höhe des Steckers eingetaucht ist.
7. Der Hitzeschock kann die Drosophila unbeweglich machen. Lassen Sie die Hitzeschock Drosophila für 1 h bei Raumtemperatur zu erholen , wenn sie wieder mobil werden.
8. Fügen Sie die Männer zurück auf die Weibchen im gleichen Verhältnis wie im Kreuz, und bewegen Sie sie an die frische Fläschchen mit medium bestreut mit einer geringen Menge an granulierter Hefe. Pflegen Sie die Drosophila mindestens 5 Tage.
9. Präparieren Sie die Ovarien als notwendig für eine Live-oder Fest Experiment.
   HINWEIS: Ovarien vom parentalen Drosophila exprimiert UbiGFP isoliert sollten als negative Kontrollen verwendet werden , um die effiziente Induktion der GFP-negativen Klonen durch den Hitzeschock zu bestätigen.

7. Co-Immunfärbung für Cyclin E und Mitochondria

HINWEIS: Drosophila Cyclin E (dCyclinE) zu erfassen, haben wir ein kommerziell erhalten Antikörper , der spezifisch gegen dCyclinE ⁹ verwendet haben (siehe Materialien Tabelle). Als mitochondrialen Marker verwendeten wir einen Antikörper gegen ATP-B (a - Untereinheit der mitochondrialen ATP - Synthase - Komplex) ^9.

1. Warm 4% Paraformaldehyd (PFA) auf Raumtemperatur, 25 ° C. Vorsicht! Paraformaldehyd ist giftig.
   HINWEIS: Nach dem Öffnendie Ampulle, sollte PFA innerhalb von 7 Tagen bei 4 ° C und verwendet, gespeichert werden. Dies liegt daran, die Lagerung von PFA Oxidation zu Methanol erlauben kann, die dramatisch mitochondrialen Membranen während der Fixierung verändern würde, auch dann vor, wenn in Spuren.
2. Unmittelbar nach der Präparation, fixieren die seziert Ovarien, indem sie in 200 ml frisches PFA in eine Vertiefung einer Glas Sezieren Schale (ohne teasing) platzieren. Halten Sie die Schale in einem Abzug für 15 min. Waschen der festen Ovarien durch sie sorgfältig mit der Zange in 3 aufeinanderfolgenden Vertiefungen mit jeweils 200 & mgr; l 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) zu bewegen.
   HINWEIS: Der Versuch abgebrochen hier werden kann , und die Proben können bei 4 ºC für 1 Tag belassen werden.
3. Necken die Ovarien gründlicher in PBS (ähnlich 2,6 Schritt A) vorsichtig die Schutz faserige Hülle zu entfernen, die durch den Zugang Antigen-Antikörper behindern.
4. Permeabilisieren die aufgezogen Ovarien indem man sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 & mgr; l frisch 0 gemacht platzieren.5% PBS-Triton-X100 (PBS-TX) und Inkubation für 30 min, während bei 25 Umdrehungen pro Minute zu schaukeln.
   HINWEIS: Während der rocking, legen die Rohre an die Schaukelbewegung parallel; Platzieren sie das Gewebe senkrecht erlauben kann auf die Kappe der Rohre zu halten, so dass in Gewebeverlust zur Folge hat.
5. Um die PBS-TX entfernen, legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in einem Rack das Gewebe zu ermöglichen, an der Unterseite der Rohre zu beruhigen. Überprüfen Sie sie visuell und die Röhrchen klopfen, falls erforderlich, alle schwimmenden Gewebe zu bringen, bis auf den Boden. Absaugen die Lösung von oben vorsichtig und achten Sie darauf, dass das Gewebe an der Unterseite der Rohre ungestört bleibt.
6. Blockieren die Ovarien durch Zugabe von 200 ul 2% Rinderserumalbumin (BSA), gelöst in 0,5% PBS-TX, und Inkubieren auf der Wippe bei Raumtemperatur für 1 h. Entfernen Sie die Blockierungsmittel für Schritt folgende 7.5.
7. Hinzufügen primäre Antikörper in 200 & mgr; l frischem Blockierungsmittel: anti-rabbit dCyclinE Antikörper (1: 100) und anti-Maus-ATP-B-Antikörper(1: 100). Inkubieren Sie das Gewebe an der Wippe für 2 h bei Raumtemperatur.
8. Waschen Sie die Ovarien mit PBS-TX 3 mal für jeweils 15 min, nach Schritt 7.5.
9. Fügen Sie 200 ul der entsprechenden Sekundärantikörper in frischem PBS-TX: anti-Maus-Cy3 (1: 1000) und Anti-Kaninchen-Cy5 (1: 500). Inkubieren an der Wippe für 1 h bei Raumtemperatur.
10. Waschen Sie die Ovarien mit PBS-TX 3 mal für jeweils 15 min, nach Schritt 7.5.
11. Um die DNA-Fleck, fügen Hoechst (1: 1000 Verdünnung) auf die endgültige PBS-TX zu waschen.
12. Schließlich das Gewebe in 500 ul 1x PBS verlassen.
13. Mit einer 1-ml-Mikropipette, entfernen Sie die immunogefärbten Ovarien aus dem Mikrozentrifugenröhrchen in eine frische und einer Glas Sezieren Schale mit 200 ul PBS.
14. Einen Tropfen Glycerol-basierten Mounting Medium auf einem Glasobjektträger und fügen die immunogefärbten Ovarien einzeln an der Befestigungsmedium.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher , dass die Ovarien in der Tat auf die Montagemedium übertragen werden. Andernfalls s zu tuno wird auf Gewebeverlust führen.
15. Während durch das Aufschneiden Mikroskop, zupfen vorsichtig die transparente Ovariolen (jüngere Stufen) von den undurchsichtigen reifen Eikammern die Hänselei Nadel, während die undurchsichtigen Bereich des Ovars mit der Zange zu halten. Entfernen Sie die reife Eizelle Kammern aus dem Eindeckmedium.
16. Legen Sie ein Deckglas (22 mm, No. 1) auf der Folie und drücken Sie leicht, um sicherzustellen, dass die Montagemedium gleichmäßig unter verteilt wird.
    HINWEIS: Durch Drücken auf das Deckglas sorgt auch für die richtige Ausrichtung des Gewebes entlang der Abdeckglas. kann so optimal auf Sie dies nicht erlauben, die kleineren Stufen in der Montagemedium zu schweben, zu verhindern optimale Mikroskopie von diesen Geweben.
17. Der Luft trocknen die Proben für 15 min und die Ränder des Deckglas vorsichtig mit Nagellack.
18. Führen Konfokalmikroskopie gemäß experimentellen Bedarf (Tabelle 1).

Ergebnisse

Die beschriebenen Verfahren können mitochondriale Struktur und Funktion zu untersuchen in lebenden und fixierten Drosophila Ovarien (2B) verwendet werden. einige Beispiele für die erwarteten Ergebnisse, die mit den beschriebenen Verfahren werden zur Verfügung gestellt.

Dissektion der Drosophila Ovar: Wenn weiter seziert, sollten die abgetrennten Bäuche (3B) aus dem...

Diskussion

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls

Photobleaching: Vermeidung unzumutbarer Photobleichens fluoreszierenden Proben ist unbedingt erforderlich, um eine effiziente Durchführung der konfokalen Mikroskopie. Daher wird die Zeitproben durch das Okular zu lokalisieren oder Bildaufnahmeparameter über den Live-Abtastmodus eingestellt sollte Photobleichens minimiert werden minimiert.

Gewebeschäden: Da Mitochondrien betrachtet sind die Sen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium)	Fisher Scientific	30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ	Electronic Microscopy Sciences	50-259-99
Mitotracker Green (overall mitochondrial stain)	Life Technologies	m7514	Reconstitute and Aliquot
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate	Sigma Aldrich	87917-25MG	Reconstitute and Aliquot
MitoSox (Mito-Ros stain)	Life Technologies	m36008	Reconstitute and Aliquot
PolyLysine	MP Biomedicals	ICN15017625
Fly Vials	Fisher Scientific	AS-515
Fly Conicals	Fisher Scientific	AS-355
Fly Vial Flugs	Fisher Scientific	AS273
Fly Conical Flugs	Fisher Scientific	AS 277
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)	Fisher Scientific	AS153
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9647-50G
Cyclin E Antibody (d-300)	Santa Cruz	sc- 33748
ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker	AbCam	ab14730
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-165-146
Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-175-144
Hoechst	Fisher Scientific	H3570
VectaShield	Fisher Scientific	H100
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides	Fisher Scientific	22-026-252
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish	Fisher Scientific	P35G-0-14-C
Active Dried Yeast	Fisher Scientific	ICN10140001
Confocal Microscope	Carl Zeiss	LSM 700
Dumont #5 Forceps	Fine Science Technologies	11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Technologies	26016-12
Minutien Pins	Fine Science Technologies	26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	Bloomington Stock Center	7194
Fly Pad	Fly stuff	59-118
Blowgun	Fly stuff	54-104
Blowgun needle	Flystuff	54-119
Dissecting Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000
Analyses software	Carl Zeiss	Zen
Analyses software	Open source	Image J
Research Macro Zoom Microscope	Olympus	MVX10
QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono	QImaging	QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1	QImaging