Der Chip-exo-Methode: Ermittlung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit Near-Basenpaar Precision

Zusammenfassung

Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.

Zusammenfassung

Chromatinimmunpräzipitation (Chip-) ist ein unverzichtbares Werkzeug in den Bereichen Epigenetik und Genregulation, die spezifische Protein-DNA-Wechselwirkungen isoliert. ChIP gekoppelt Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq) wird allgemein die genomische Lage von Proteinen zu bestimmen, die mit Chromatin in Wechselwirkung treten. Allerdings ChIP-seq wird durch eine relativ geringe Abbildungsauflösung von mehreren hundert Basenpaaren und hohen Hintergrundsignal behindert. Der Chip-exo-Methode ist eine verfeinerte Version von ChIP-seq, die auf sowohl Auflösung und Rauschen wesentlich verbessert. Der Hauptunterschied der ChIP-exo-Methodik ist die Einarbeitung von lambda-Exonuclease-Verdauung in der Bibliothek Vorbereitungsarbeitsablauf, um effektiv die linke Standfläche und rechts 5 'DNA-Grenzen des Protein-DNA-Vernetzungsstelle. Der Chip-exo-Bibliotheken werden dann einer Hochdurchsatz-Sequenzierung unterzogen. Die resultierenden Daten können genutzt werden, um eine einzigartige und extrem hochauflösende Einblicke in die funktionelle Organisation of das Genom. Hier beschreiben wir die ChIP-exo-Methode, die wir optimiert und rationalisiert für Säugetier-Systeme der nächsten Generation Sequenzierung-durch-Synthese-Plattform.

Einleitung

Chromatinimmunpräzipitation (Chip-) ist eine leistungsfähige Methode Mechanismen der Genregulation zu untersuchen, indem selektiv für die DNA-Fragmente zu bereichern, die in lebenden Zellen mit einem bestimmten Protein in Wechselwirkung treten. Nachweisverfahren von ChIP angereicherte DNA - Fragmente haben sich weiterentwickelt , wie die Technologie verbessert, von der Erfassung eines einzelnen Locus (Standard ChIP-qPCR) zur Hybridisierung an Oligonukleotid - Mikroarrays (ChIP-Chip) auf Hochdurchsatz - Sequenzierung (ChIP-seq) ^1. Obwohl ChIP-seq weit verbreitete Anwendung, Chromatin Heterogenität und unspezifischer DNA-Wechselwirkungen Datenqualität gesehen haben, was zu falsch-positive erschwert und ungenau Mapping. Um diese Einschränkungen zu umgehen, entwickelte Dr. Frank Pugh dem Chip-exo - Methode ^2. Das hervorstechendste Merkmal von ChIP-exo ist, dass es eine 5 'zu 3' Exonuklease enthält, effektiv Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen Footprinting. Im Ergebnis erreicht der Chip-exo-Methodik höhere Auflösung, größeren Dynamikbereich von detection und unteren Hintergrundgeräusche.

Obwohl ChIP-exo technisch schwer zu meistern ist als ChIP-seq ist es weithin angenommen wird , wie Studien einzigartige , ultrahochauflösende Einblicke mit verschiedenen biologischen Systemen ^3-8 gewinnen wollen. Tatsächlich ChIP-exo wurde auf Bakterien, Hefe, Maus, Ratte und menschlichen Zellsysteme erfolgreich eingesetzt. Als Beweis für das Prinzip wurde ChIP-exo ursprünglich verwendet , um die genaue Bindungsmotiv für eine Handvoll von Hefe - Transkriptions zu identifizieren ² Faktoren ab . Die Technik wurde auch in Hefe verwendet , um die Organisation des Transkriptions Präinitiationskomplex zu studieren, und subnucleosomal Struktur verschiedener Histone ^9,10 zu dechiffrieren. In jüngerer Zeit, Leveraged wir ChIP-exo benachbarten TFIIB und Pol II an menschlichen Promotoren Bindungsereignisse zu lösen, und zeigte , dass weit verbreitete divergente Transkription entsteht aus verschiedenen Initiations ¹¹ - Komplexe.

Der Workflow hier präsentiert wird optimiert und streamlined für Säugetier ChIP-exo (Abbildung 1). Erstens leben primäre oder Gewebekulturzellen mit Formaldehyd behandelt in vivo Protein-DNA - Wechselwirkungen durch eine kovalente Vernetzungs zu erhalten. Die Zellen werden lysiert und Chromatin abgeschert ~ 100-500 Basenpaar Größe Fragmente. ChIP dann reichert selektiv für DNA an das Protein von Interesse vernetzt Fragmente. An diesem Punkt ChIP-seq-Bibliotheken werden typischerweise hergestellt, die von Natur aus begrenzt die Detektionsauflösung auf die durchschnittliche Fragmentgröße von wenigen hundert Basenpaaren. Jedoch ChIP-exo überwindet diese Einschränkung durch die linken und rechten 5'-DNA Grenzen der Protein-DNA-Vernetzungsstelle mit Lambda-Exonuklease Trimmen. Sequencing Bibliotheken werden dann aus Exonuklease verdaut DNA konstruiert, wie unten beschrieben. Die resultierenden verschachtelten 5 'Grenzen stellen eine in vivo Footprint des Protein-DNA - Interaktion (Abbildung 1, Schritt 14) und werden durch Hochdurchsatz - Sequenzierung nachgewiesen. Although der Chip-exo-Methodik mehr beteiligt als ChIP-seq ist, Übergänge zwischen den meisten Schritten erfordert einfache Perle Waschen, die Probenverlust und experimentelle Variabilität minimiert. Wichtig ist, dass da ChIP-exo ist eine verfeinerte Version von ChIP-seq, jede Probe, die mit ChIP-seq sollte auch erfolgreich sein, mit ChIP-exo erfolgreich ist.

Die in - vivo - Fußabdrucks von Protein-DNA - Wechselwirkungen mit ChIP-exo Ergebnisse in einer grundlegend unterschiedliche Datenstruktur von ChIP-seq. Obwohl häufig vorkommend ChIP-seq Anrufern ChIP-exo-Daten angewendet werden kann, die präzisesten Spitzen Anrufe zu erhalten, empfehlen wir die Bioinformatik Tools, die speziell mit der einzigartigen Struktur von ChIP-exo-Daten im Auge behalten. Dazu gehören Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla und ExoProfiler ^12-15.

Protokoll

Hinweis: Doppelt destilliertes H ₂ O oder UPW Äquivalent für alle Puffer und Reaktionen Mischungen empfohlen.

Tag 0: Materialvorbereitung und Zellernte

1. Puffer Vorbereitung

1. Bereiten Sie Lysepuffern 1-3 (Tabellen 1 - 3) und mit 100 & mgr; l vollständige Protease - Inhibitor Lager (CPI) auf 50 ml jeder Puffer unmittelbar vor der Verwendung. Bereiten CPI Lager durch Auflösen einer Tablette in 1 ml UPW H ₂ O.
2. Bereiten Sie ChIP Puffer (Tabellen 4 - 7). 100 l CPI Lager zu 50 ml Blocking und RIPA-Puffer. Nicht CPI Tris und ChIP Elutionspuffer hinzufügen.

2. Ausglühen Adapter Oligonucleotides

Hinweis: Spezifische Oligonukleotid-Sequenzen können in Abschnitt Zusätzliche Informationen zu finden.

1. Bereiten Sie Adapter Ausglühen Mischungen (Tabellen 8 - 9). Vortex mischen und kurzSpin-Röhren Inhalt zu sammeln. Aliquot 100 ul jeder Mischung in 0,5-ml-Röhrchen.
2. Hybridisieren die Oligonukleotide durch das Programm (Tabelle 10) in dem Thermocycler ausgeführt wird .
   Store annelierten Oligonucleotiden bei -80 ° C.

3. In - vivo - Chromatin Crosslinking mit Formaldehyd

HINWEIS: Für einen typischen ChIP Experiment Ausgangsmaterial sollte etwa 50 Millionen Zellen enthalten.

1. Fügen Sie frisches 37% Methanol-freies Formaldehyd-Stammlösung zu gepufferte Salzlösung Phosphat (PBS) gewaschen Zellkultur bis zu einer Endkonzentration von 1% (v / v), gründlich mischen, und lassen Sie sich für 10 Minuten bei Raumtemperatur sitzen.
   HINWEIS: Zum Beispiel, wir in der Regel addieren 1,4 ml 37% iges methanolfreies Formaldehyd zu Zellen in 50 ml PBS Raumtemperatur. Auch vermeiden Formaldehyd in Medien Vernetzungs da Proteine ​​in dem Medium wird ein Teil des Formaldehyds quenchen.
2. Quench Vernetzungsreaktion durch Zugabe von 2,5 M Glycine für eine Endkonzentration von 125 mM. Gründlich durchmischen.
3. Übertragen Zellen zu 50 ml Röhrchen auf Eis. Spin-Zellen 5 min bei 1000 × g bei 4 ° C. Überstand dekantieren.
4. 1 ml eiskaltem 1x PBS auf Zellpellet resuspendieren durch Pipettieren. Transfer zum 1,5-ml-Röhrchen.
5. Spin-Zellen für 3 min bei 2000 × g bei 4 ° C. Überstand entfernen.
6. blinken sofort Zellpellets in 1,5-ml-Röhrchen mit flüssigem Stickstoff einfrieren. Bei -80 ° C. Vernetzte Zellen sind unbegrenzt stabil bei -80 ° C.

Tag 1: Zelllyse, Ultraschall-Behandlung, und ChIP

4. Zellyse

HINWEIS: Bei allen Zelllyse Abschnitte müssen die Proben auf Eis oder bei 4 ° C gehalten werden, vernetzen Umkehr zu minimieren.

1. Kurz auftauen vernetzte Zellpellet. Gründlich resuspendieren jedes Pellet in 0,5 ml Lysis Buffer 1 und verbinden sich mit 4,5 ml Lysis-Puffer 1 in einem 15 ml Polystyrol-Röhrchen.
2. Rock Röhrchen für 10 min bei 4 ° Cfür auf einer Schwingplattform. Spin für 4 min bei 2000 × g bei 4 ° C. Überstand dekantieren.
3. Gründlich resuspendieren jedes Pellet in 0,5 ml Lysispuffer 2 und fügen Sie 4,5 ml Lysispuffer 2 einmal suspendiert.
4. Schaukeln für 5 min bei 4 ° C auf einem Schüttler. Spin für 5 min bei 2000 × g bei 4 ° C. Dekantieren Überstand und klopfen Sie leicht Überschuss auf Papiertuch.
5. Gründlich resuspendieren jedes Pellet in 0,5 ml Lysispuffer 3 und 1 ml Lysepuffer 3 einmal suspendiert. Halten Kern Lysaten auf Eis und sofort Beschallung gehen.

5. Ultraschall-Behandlung von Kern Lysate

HINWEIS: Bei allen Beschallungs Abschnitte müssen die Proben auf Eis gehalten werden, vernetzen Umkehrung zu minimieren. Das spezifische Modell der Beschallungsgerät in Verbindung mit dem verwendeten Protokoll unten kann in der Tabelle der Materialien gefunden werden. Einzelheiten über konkrete Beschallungsgerät Nutzung und Richtlinien für andere Instrumente können in Abschnitt Zusätzliche Informationen zu finden.

1. PlAss Resonanz Adapter in 15 ml Polystyrolröhrchen Kernextrakten (die Metallstange sollte die Wand der Röhre nicht berühren).
2. Beschallen Kern Lysate in einem eiskalten Wasserbad für 2 x 15 min Sitzungen mit 30 sec / 30 sec OFF bei mittlerer Leistung. Nur beschallen zwei 15-ml-Röhrchen zu einem Zeitpunkt. Diese Einstellungen arbeiten auf einem breiten Spektrum von Zelllinien und Primärzelltypen, aber weitere Optimierung kann erforderlich sein, wenn das Chromatin Scher unvollständig ist.
3. Beschallungsergebnisse, den Transfer 2 x 10 & mgr; l-Proben von Lysat in 1,5-ml-Röhrchen zu überprüfen.
   1. Um Vernetzungen umkehren, kombinieren, um die ersten 10-ul-Aliquot mit 10 & mgr; l TE-RNase A und 0,2 ul Proteinase K bei 37 ° C für 30 min. In 4 ul 6x Xylol DNA-Farbstoff.
   2. Zur Erhaltung Vernetzungen, kombinieren die zweite 10-ul-Aliquot mit 2 ul 6x Xylol DNA-Farbstoff.
   3. Führen beide Proben auf einem 1,5% Agarosegel bei 140 V für etwa 30 - 45 min, bis der Bromphenol-Farbstoff in der Leiter i¾ der Weg nach unten das Gel.
4. Wenn Beschallen erfolgreich war (die meisten DNA und 100 abgeschert fragments - 500 bp), Transfer beschallt Lysate bis 2-ml-Röhrchen, enthaltend 150 ul 10% Triton X-100. Vortex mischen.
5. Zu pelletieren unlösliches Chromatin und Schutt, Spin beschallt Kern Lysat für 10 min bei 20.000 × g bei 4 ° C.
6. Überstand in ein neues 2-ml-Tube. Fahren Sie direkt mit Chip- oder Lagerung von Proben bei -80 ° C auf unbestimmte Zeit. Beschallt Extrakte sollten nicht mehr eingefroren und wieder aufgetaut werden, als einmal.

6. Kupplung Antikörper gegen Beads

HINWEIS: Niemals Wirbel oder Frost / Tau-magnetische Kügelchen, da sie zerspringen und Hintergrundsignal zu erhöhen.

1. Nach gründlichem Mischen Lager, aliquoten Y ul Kügelchenaufschlämmung in 1,5-ml-Röhrchen, wobei Y = 1,1 x 2,5 ul x (Anzahl der Chip-Proben). Bindungskapazität für 2,5 ul Kügelchenaufschlämmung ist bis zu 13 & mgr; g IgG. Waschen Sie gepoolt Perlen 3x mit 1 ml BlockingPuffer.
2. Für konsistentere Aliquotierung von Perlen nach Wäschen, resuspendieren Perlen in 10x ursprünglichen Schlammes Volumen (25 ul / Chip) mit Blocking-Puffer. Aliquot 25 ul pro Chip Probe in 1,5-ml-Röhrchen.
3. In 5-10 ug Antikörper zu aliquote Menge von resuspendieren Perlen entspricht. Bringen endgültige Volumen von bis zu 250 & mgr; l mit Blockierungspuffer. Inkubieren Proben für 4 Stunden (alternativ über Nacht 16 h) auf einer rotierenden Plattform bei 4 ° C.
4. Überstand entfernen. Um ungebundene oder überschüssige Antikörper zu entfernen, waschen Perlen einmal mit 1 ml Blockierungspuffer.
5. Nach dem letzten Wasch Absaugen, fügen Sie sofort 50 Millionen Zelläquivalente von beschallten Extrakte (~ 1,6 ml) auf Antikörper: Perle-Konjugate. Wenn beschallten Extrakte nicht bereit sind, resuspendieren Perlen in 100 & mgr; l Blockierungspuffer, bis sie bereit sind. Es ist wichtig, niemals die Perlen trocknen lassen.

7. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP)

1. Für jeden Chip Probe kombinieren 1,5 ml beschallted Extrakte mit Antikörper: Perle-Konjugate in 1,5 ml oder 2 ml-Röhrchen.
2. Röhrchen auf einem Mini-Rohr-Rotator über Nacht (etwa 16 Stunden) bei Geschwindigkeitseinstellung von 9 bei 4 ° C. Überprüfen Sie nach ein paar min Proben, um sicherzustellen, sind nicht undicht und mischen richtig.

Tag 2: ChIP Wäscht und On-Harz enzymatischer Reaktionen

8. ChIP Wäscht

HINWEIS: Kreuzkontamination zu minimieren, kurz drehen Röhren zwischen jedem Waschen. Für die erste Bestrebung, ändern Spitzen zwischen jeder Probe. Bei der anschließenden Wäschen kann die gleiche Spitze so lange verwendet werden, da es nicht die Perlen berührt hat. Siehe Weitere Informationen Abschnitt nach dem Weg zur richtigen ChIP Waschen.

1. Sehr kurz Rohre Spin einer Mikrozentrifuge (~ 3 sec bei 500 xg) unter Verwendung von Flüssigkeit, die in Kapseln zu sammeln und für 1 min auf dem magnetischen Gestell schalten. Während noch auf dem Magnetträger, aspirieren Extrakt.
2. Hinzufügen 0,75 ml RIPA-Puffer zu jedem Röhrchen. Entfernen Sie Rohre aus magnetischen Rackund mehrmals umdrehen zu mischen. Ersetzen Sie Rohre auf Magnet Rack und absaugen Überstand. Wiederholen Sie 7x.
3. Hinzufügen 0,75 ml 10 mM Tris HCl (pH 7,5) zu jedem Röhrchen. Entfernen Sie Rohre aus magnetischen Rack und mehrmals umdrehen zu mischen. Ersetzen Sie Rohre auf Magnet Rack und absaugen Überstand. Repeat 2x.
4. Nach dem Absaugen letzten Wäsche, gehen Sie zu Polieren.
   Hinweis: Nach jeder Inkubation Reaktion in den Abschnitten 9.3, 10.3, 11.3, 12.3, 13.3, 14.3 und 15.3, Spin-Röhrchen kurz und Platz gegen Magnetträger für 1 min und absaugen Überstand. Waschen Sie 2x mit 0,75 ml RIPA-Puffer und 2x mit 0,75 ml Tris-HCl (pH 7,5).

9. Polieren Reaction

1. Füllen Sie Polier Master - Mix Berechnungen (Tabelle 11). Machen Sie in 1,5 ml Röhrchen auf Eis Poliermischung. Pipettieren zu mischen.
2. Unmittelbar nach dem letzten Wasch ChIP angesaugt wird, werden 50 & mgr; l jeder Probe Harz während immer noch auf dem magnetischen Gestell Poliermischung. Inkubiere die Proben für 30 min bei 3 xgbei 30 ° C in einem Thermomixer.
3. Nach dem Absaugen letzten Wäsche zu A-Tailing gehen in der Note nach Abschnitt 8.4, beschrieben.

10. A-Tailing-Reaktion

1. Füllen Sie A-Tailing Master Mix Berechnungen (Tabelle 12). Make A-Tailing-Mix in einem 1,5-ml-Röhrchen auf Eis. Pipettieren zu mischen.
2. Unmittelbar nach Abschnitt Polieren, werden 50 & mgr; l der A-Tailing-Mix Harz zu jeder Probe, während immer noch auf dem Magnet Rack. Inkubieren Proben für 30 min bei 3 × g bei 37 ° C in einem Thermomixer.
3. Nach dem Absaugen letzten Wäsche zu P7 Adaptorligation gehen in der Note nach Abschnitt 8.4, beschrieben.

11. P7 Adaptorligation Reaction

1. Füllen Sie Ligatur Master - Mix Berechnungen (Tabelle 13). Machen Sie Ligatur in 1,5 ml Röhrchen auf Eis mischen. Pipette zu mischen.
2. Unmittelbar nach dem Abschnitt A-Tailing, fügen Sie 48 ul P7 Ligatur Master-Mix und 2 ul eines anderen Adapter Index to Jede Probe Harz während immer noch auf dem Magnethalter. Inkubieren Proben für 2 Stunden bei 3 · g bei 25 ° C in einem Thermomixer.
   Anmerkung: Die Verwendung unterschiedlicher Indizes für jede Probe ermöglicht, mehrere Proben in einer einzelnen Strömungszelle sequenziert werden.
3. Nach dem Absaugen letzten Wäsche zu Φ-29 Nick Repair gehen in der Note nach Abschnitt 8.4, beschrieben.

12. Phi-29 Nick Repair Reaction

1. Füllen Sie Φ-29 Master - Mix Berechnungen (Tabelle 14). Machen Φ-29-Mix in 1,5 ml Röhrchen auf Eis. Pipettieren zu mischen.
2. Unmittelbar nach P7 Ligierung Abschnitt fügen 50 ul Φ-29 Mischung zu jeder Probe Harz während immer noch auf dem Magnethalter. Inkubieren Proben für 20 min bei 3 × g bei 30 ° C in einem Thermomixer.
3. Nach dem Absaugen letzten Wäsche zu Kinase-Reaktion gehen in der Note nach Abschnitt 8.4, beschrieben.

13. Kinase-Reaktions

1. Füllen Sie Kinase Master-Mix Berechnungen ( Tabelle 15). Machen Sie Kinase in 1,5 ml Röhrchen auf Eis mischen. Pipettieren zu mischen.
2. Unmittelbar nach Φ-29 Abschnitt fügen 50 ul Kinase zu jeder Probe Harz mischen, während immer noch auf dem Magnethalter. Inkubieren Proben für 20 min bei 3 × g bei 37 ° C in einem Thermomixer.
3. Nach dem Absaugen letzten Waschen wie zu Lambda Exonukleasereaktion gehen in der Note nach Abschnitt 8.4, beschrieben.

14. Lambda Exonuclease Reaction

1. Füllen Sie Lambda Exonuclease Master - Mix Berechnungen (Tabelle 16). Machen Lambda Exonuclease in 1,5 ml Röhrchen auf Eis mischen. Pipettieren zu mischen.
2. Unmittelbar nach Abschnitt Kinase, fügen 50 ul Lambda Exonuclease zu jeder Probe Harz mischen, während immer noch auf dem Magnethalter. Inkubieren Proben für 30 min bei 3 × g bei 37 ° C in einem Thermomixer.
3. Nach dem Absaugen letzten Waschen wie zu RecJ _f Reaktion gehen in der Note nach Abschnitt 8.4, beschrieben.

15. RecJ _fNukleasereaktion

1. Füllen Sie RecJ _f Master - Mix Berechnungen (Tabelle 17). Machen Sie RecJ _f Mix in 1,5 ml Röhrchen auf Eis. Pipettieren zu mischen.
2. Unmittelbar nach Lambda Exonuclease Abschnitt fügen 50 ul RecJ _f mix Harz zu jeder Probe , während immer noch auf dem Magnethalter. Inkubieren Proben für 30 min bei 3 × g bei 37 ° C in einem Thermomixer.
3. Nach dem Absaugen letzten Wäsche zu ChIP Elution gehen in der Note nach Abschnitt 8.4, beschrieben.

16. Elution und Cross Reversal

1. Vorbereitung Master Mix: Anzahl der Abtastwerte x 1,1 x (200 ul ChIP Elutionspuffer + 1 & mgr; l 20 mg / ml Proteinase K) in 1,5 ml Röhrchen. In 200 ul ChIP Elutionspuffer + Proteinase K Master-Mix zu jeder Probe Harz.
2. Inkubieren Proben über Nacht (etwa 16 Stunden) bei 3 × g bei 65 ° C in einem Thermomixer mit einem beheizten Deckel Kondensation zu vermeiden.

Tag 3: DNA-ExtraktIon und Adaptorligation

17. Elution und Cross Reversal (Fortsetzung)

1. Nach Inkubation über Nacht bei 65 ° C, Spin kurz Proben Kondensat zu sammeln. Prüfmuster auf Magnetträger für 1 min.
2. Transfer 200 & mgr; l Überstand in neue 1,5 ml-Röhrchen, enthaltend 200 & mgr; l TE-Puffer (pH 7,5).

18. Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (PCIAA) Extraktion

1. In 400 ul Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol zu jeder Probe. Vortex für 20 Sekunden zu mischen.
2. Zentrifuge für 10 min bei 20.000 xg bei Raumtemperatur (RT). Transfer vorsichtig 325 ul der oberen wässrigen Schicht in ein frisches Röhrchen.
   Hinweis: Achten Sie darauf, dass keine der organischen (untere Schicht) zu übertragen in die neue Röhre.
3. Hinzufügen 1/10 Volumen 3 M NaOAc (pH 5,5) und 1 ul 20 mg / ml Glykogen auf jede Probe. Bei mehreren Proben, bereiten einen Master-Mix.
4. Hinzufügen 3 Volumen eiskaltem 100% igem Ethanol zu jeder Probe. Wirbelmischen. Inkubieren für 15 min bei -80 ° C.
5. Zentrifuge für 15 Minuten bei 20.000 × g bei 4 ° C. umfüllen Überstand vorsichtig und achten Sie darauf, um nicht das Pellet stören.
6. fügen Sie vorsichtig 500 ul frisch eiskaltem 70% Ethanol hergestellt, um sicherzustellen, um nicht das Pellet stören. Zentrifuge für 5 min bei 20.000 × g bei 4 ° C. Vorsichtig dekantieren Überstand.
7. Trocknen des Pellets für ca. 20 min (oder bis es trocken ist) in einer Geschwindigkeit Vakuum bei 45 ° C.
   Hinweis: Dies ist eine Pause Punkt im Protokoll. Trockene DNA-Pellets können bei -20 ° C gelagert werden.
8. Resuspendieren Pellets in 10 & mgr; l ddH ₂ O. Pipettieren wiederholt über den Bereich , wo die DNA pelletiert, obwohl das getrocknete Pellet nicht gesehen werden kann.
9. Übertragen Sie 10 ul jeder Probe in ein frisches 0,3 ml PCR-Röhrchen oder 8-Rack, je nach Anzahl der Proben.

19. P7 Primer-Verlängerungsreaktion

1. Füllen Sie P7 Primer Erweiterung Master - Mix Berechnungen (Tabelle 18). Make-Erweiterung in 1,5 ml Röhrchen auf Eis mischen. Pipettieren zu mischen.
2. In 10 ul Extension Mix (minus Φ-29-Polymerase) zu je 10 & mgr; l Probe. Pipettieren zu mischen.
3. Führen Proben im Thermocycler mit dem Programm (Tabelle 19) zu tempern Primers an die Matrize bis zum 30c "halten" Schritt.
4. 1 & mgr; l Φ-29-Polymerase während der 30 ˚C "halten" Schritt im Programm. Pipettieren zu mischen. Fortsetzen der Rest des Programms (Tabelle 19).

20. A-Tailing-Reaktion

1. Füllen Sie A-Tailing Master Mix Berechnungen (Tabelle 20). Make A-Tailing-Mix in einem 1,5-ml-Röhrchen auf Eis. Pipettieren zu mischen.
2. In 10 ul des A-Tailing-Mix zu jeder Probe. Pipettieren zu mischen.
3. In der Thermocycler, Inkubation Proben für 30 Minuten bei 37 ° C und dann für 20 min bei 75 ° C inaktivieren Wärme.

21. P5 Adaptorligation Reaktion

1. Fill aus P5 Adaptorligation Master - Mix Berechnungen (Tabelle 21). Machen Sie Ligatur in 1,5 ml Röhrchen auf Eis mischen. Pipettieren zu mischen.
2. In 20 ul P5 Ligatur zu jeder Probe mischen. Pipettieren zu mischen.
3. In der Thermocycler, Inkubation Proben für 2 Stunden bei 25 ° C.

22. Bead Aufräum

Hinweis: Bitte beachten Sie Abschnitt Materialien für Hersteller Details zu Wulst aufzuräumen.

1. Bringen Sie jede 50 ul Probe in ein neues 1,5-ml-Röhrchen.
2. aufzuräumen resuspendieren Perlen auf einem Mini-Rohr Rotator bei Geschwindigkeitseinstellung von 15 für 15 min bei RT. Lassen Sie sich nicht Perlen vor dem Pipettieren begleichen.
3. In 60 ul aufzuräumen Perlen auf Probe (1,2: 1 aufzuräumen Perlen Verhältnis zur Probe ist entscheidend DNA zu entfernen, die kürzer als 200 Basenpaare ist). Pipettieren für 20 Sekunden zu mischen.
4. aufzuräumen resuspendieren Perlen auf einem Mini-Rohr Rotator bei Geschwindigkeitseinstellung von 15 für 3 min bei RT. Kurz Spin Röhren.
5. Die Röhrchen auf dem Magnetträger für 1 min.Pipettieren aus und den Überstand verwerfen.
   HINWEIS: NICHT Vakuumaspiration in diesem Abschnitt verwendet werden, da es die Clean-up-Perlen saugen.
6. In 400 ul frisch hergestellt RT 70% Ethanol zu jeder Probe, während sie auf magnetische Rack sind. Nicht vermischen. Überstand entfernen. Repeat 2x.
7. Trocknen Sie die Clean-up-Perlen für 10 min bei RT. Die Farbe der Perlen werden dunkel bis hellbraun und sehr kleine Risse in der Harz-Pellet sichtbar sein, wenn Perlen trocken sind.
8. Zum Eluieren DNA, dann werden 40 & mgr; l 10 mM Tris (pH 7,5). Gründlich pipettieren für 20 Sekunden zu mischen.
9. Legen Sie die Proben auf dem Magnetträger für 1 min. pipettieren Langsam und übertragen direkt 36 ul Eluat bis 0,3 ml PCR-Röhrchen.
10. Direkt in die PCR-Reaktion oder zu speichern Eluaten bei -20 ° C.

Tag 4: PCR und Gel-Analyse

23. PCR

1. Füllen Sie PCR - Master - Mix Berechnungen (Tabelle 22). Machen Sie PCR-Mix. Pipettieren sehr sanft zu vermeiden, mischenBlasen.
2. In 14 ul PCR zu jeder 36 & mgr; l DNA-Probe zu mischen. Pipettieren zu mischen. Halten Sie die Proben auf Eis, bis sie bereit in Thermocycler zu setzen.
3. Für die positive PCR-Kontrolle umfassen eine zuvor vorbereitete Bibliothek. Für die negative PCR-Kontrolle umfassen Wasser. Führen Proben im Thermocycler unter Verwendung von PCR - Programm (Tabelle 23).

24. Gel Vorbereitung, DNA Excision und Visualisierung

1. Gründlich reinigen und spülen Sie eine geeignete Größe Gel-Box mit entsalztem Wasser. Bereiten Sie eine 1,5% Agarose-Gel (enthaltend 0,5 mg / ml Ethidiumbromid) mit dicken, breiten gut kämmen, die 60 & mgr; l aufnehmen kann.
   HINWEIS: Ethidiumbromid (EtBr) ist ein Karzinogen und müssen mit Vorsicht behandelt werden.
2. Spin down PCR Probenröhrchen kurz Kondensation zu sammeln.
3. In 1/5 Volumen 6x Xylol DNA Farbstoff kombiniert Probe. Nicht Bromphenolblau in DNA-Farbstoff verwendet werden, da es an der gleichen Stelle wie die Probe DNA wandert.
4. Laden gesamte Probe into jede Vertiefung, vorzugsweise mit leeren Brunnen in zwischen den Proben.
   Anmerkung: Die Bibliotheken mit den gleichen Indizes müssen nicht im selben Gel laufen gelassen werden.
5. Last 7 & mgr; l 100 bp Leiter auf beiden Seiten der Proben. Führen Gel bei 140 V ca. 30-45 min für bis Bromphenol Farbstoff in Leiter ist ¾ Weg nach unten das Gel.
6. Bild und Visualisierung von Gel auf einem Durchleuchtungs bei einer niedrigen UV-Einstellung. Auszuschneiden die Abschnitte aus Agarose enthaltenden DNA-Fragmente von 200 bis 500 bp. Seien Sie sehr vorsichtig Ausschneiden Adapter Dimerenbande zu vermeiden, die bei 125 bp läuft.
7. Legen Sie jedes ausgeschnittenen Gelstück in einen 15-ml-Tube. Nehmen Nettogewicht jeder Gelschnitte. Schreiben Sie dieses Gewicht direkt auf dem Rohr.
8. Bild, speichern und mit Anmerkungen versehen excised Gel richtige Größenbereich ausgewählt, um zu bestätigen.

25. Gel Purification

1. Reinige DNA von exzidierten Gelstück entsprechend den Anweisungen des Herstellers mit den folgenden Modifikationen.
2. Man löst das Gelstück durch Schaukelnbei RT auf der Plattform zu schaukeln. Es dauert ungefähr 20 Minuten aufzulösen nehmen.
3. Um hochgereinigte DNA zu erhalten, waschen Säulen mit 0,5 ml Puffer QG nach gelösten Gel wurde durch die Säule geleitet.
4. Nach Puffer PE waschen, lassen Sie Spalten für 2 bei RT sitzen - 5 min. Spin für 1 min bei 13.000 × g bei RT.
5. Damit Raum für die PCR-Reaktion Master-Mix, elute Proben mit 40 ul EB-Puffer in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen.

26. DNA-Quantifizierung

1. Vorbereiten Proben gemäß den Anweisungen des Herstellers (Tabelle 24). Messen Proben in bestimmten Instrument mit optischen Röhren.
2. Sobald ChIP-exo - Bibliotheken quantifiziert werden, reichen für die Sequenzierung auf einer Plattform , die Sequenzierung-durch-Synthese verwendet Chemie ¹⁶ , die mit DNA - Adapter in diesem Protokoll kompatibel ist.
   HINWEIS: In der Regel 2 ul Probe ist ausreichend für die Quantifizierung, aber mehr können erforderlich sein, wenn die Probenkonzentration niedriger ist. DNA ergibt typischely Bereich zwischen 50 und 200 ng.
3. Nach Quantifizierung Proben bei -20 ° C.

Ergebnisse

Die folgenden Abbildungen zeigen repräsentative Ergebnisse aus dem Chip-exo-Protokoll hier vorgestellt. Im Gegensatz zu herkömmlichen ChIP-seq Methodologien mit wenigen enzymatischen Schritten, ChIP-exo erfordert elf sequentiell abhängigen enzymatischen Reaktionen (Abbildung 1). Somit muss darauf geachtet werden bei jedem Schritt unternommen werden, um sicherzustellen, dass jede Reaktionskomponente seiner jeweiligen Reaktions Mastermix zugesetzt wird. Wir empfehlen, e...

Diskussion

Wir präsentieren eine funktionelle Genom Protokoll die genaue Bindungsstelle für Chromatin-interagierende Proteine ​​in einer unvoreingenommenen, genomweite Weise in der Nähe von Basenpaar-Auflösung zu bestimmen. Der wichtigste Schritt in der Nähe von Basenpaar Abbildungsauflösung zu erreichen, ist die Exonuclease-Behandlung des ChIP angereicherte DNA während der Immunopräzipitat auf dem magnetischen Harz bleibt. Vordergründig könnte Proteinkomplexe möglicherweise blockieren in vivo Fußabd...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% formaldehyde, methanol free, 10 x 10 ml ampules	ThermoFisher Scientific	28908	Section 3
Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI)	Roche Life Science	11873580001	Sections 4, 8
Bioruptor sonicator	Diagenode	UCD200	Section 5
15 ml polystyrene tubes	BD Falcon	352095	Section 5
MagSepharose Protein G Xtra beads	GE Healthcare	28-9670-66	Section 6
DynaMag-1.5 ml Side Magnetic Rack	Invitrogen	12321D	Sections 6-17, 22
Mini-Tube Rotator	Fisher Scientific	05-450-127	Sections 7, 22
T4 DNA Polymerase	New England BioLabs	M0203	Section 9
DNA Polymerase I, Klenow	New England BioLabs	M0210	Section 9
10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2)	New England BioLabs	B7002	Sections 9-11, 13, 15, 20
Thermomixer C	Eppendorf	5382	Sections 9-16
ATP	Roche Life Science	010419979001	Sections 9, 11, 13
dNTPs	New England BioLabs	N0447	Sections 9, 12, 19, 23
T4 Polynucleotide Kinase	New England BioLabs	M0201	Sections 9, 13
dATP	New England BioLabs	N0440	Sections 10, 20
Klenow 3'-5' Exo Minus	New England BioLabs	M0212	Sections 10, 20
T4 DNA ligase	New England BioLabs	M0202	Sections 11, 21
Φ-29 DNA Polymerase	New England BioLabs	M0269	Sections 12, 19
10x Φ-29 Buffer	New England BioLabs	B0269	Sections 12, 19
Lambda Exonuclease	New England BioLabs	M0262	Section 14
10x Lambda Buffer	New England BioLabs	B0262	Section 14
RecJf Exonuclease	New England BioLabs	M0264	Section 15
Proteinase K	Roche Life Science	03115828001	Section 16
Glycogen	Roche Life Science	010901393001	Section 18
10x T4 Ligase Buffer	New England BioLabs	B0202	Section 21
AMPure XP (clean up) beads	Beckman Coulter	A63881	Section 22
Q5 Hot Start DNA Polymerase	New England BioLabs	M0493	Section 23
5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer)	New England BioLabs	B9027	Section 23
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Section 25
Qubit Fluorometer	Invitrogen	Q33216	Section 26
Optical Clear Qubit tubes	Invitrogen	Q32856	Section 26
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit	Invitrogen	Q32851	Section 26