der Anbau von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In drei Dimensionen im Labor

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine einfache Methode 3D Nematode Anbausysteme NGT-3D und NGB-3D genannt zu konstruieren. Diese können verwendet werden Nematoden Fitness und Verhaltensweisen in Lebensräume zu studieren , die mehr sind ähnlich wie natürliche Caenorhabditis elegans Lebensräume als die Standard - 2D - Labor C. elegans Kulturplatten.

Zusammenfassung

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Einleitung

The study of the nematode Caenorhabditis elegans in the laboratory has led to seminal discoveries in the field of biology over the last five decades¹. C. elegans was the first multicellular organism to have its genome sequenced in 1998², and it has been invaluable in understanding the contributions of individual genes to the development, physiology, and behavior of a whole organism. Scientists now are looking to further understand how these genes may contribute to the survival and reproductive fitness of organisms in their natural environments, asking questions about ecology and evolution at the genetic level^3-5.

C. elegans once again can provide an excellent system to answer these questions. However, little is known about C. elegans biology in natural nematode habitats, and there are no current methods to simulate controlled natural conditions of C. elegans in the laboratory. In the lab, C. elegans is cultivated on the surface of agar plates seeded with E. coli bacteria⁶. In nature, however, C. elegans and related nematodes can be found sparsely inhabiting soils throughout the globe, but they are specifically found thriving in rotting fruits and vegetative matter^7,8. These three-dimensional (3D) complex environments are quite different from the simple 2D environments to which worms are exposed to in the laboratory.

To begin to answer questions about the biology of nematodes in a more natural 3D setting, we have designed a 3D habitat for laboratory cultivation of nematodes we called Nematode Growth Tube 3D or NGT-3D for short⁹. The goal was to design a 3D growth system that allows for comparable growth, development, and fertility to the standard 2D Nematode Growth Media (NGM) plates¹⁰. This system supports the growth of bacteria and nematodes over their entire life cycles in 3D, allows worms to move and behave freely in three dimensions, and is easy and inexpensive to manufacture and employ.

In the current study, we provide a step-by-step method to manufacture NGT-3D and evaluate worm development and fertility. In addition to assessing worm fitness in 3D, we sought to image, video, and assess worm behavior and physiology in 3D cultivation. Thus, in addition to NGT-3D, we present here an alternate method called Nematode Growth Bottle 3D or NGB-3D, for the microscopic imaging of C. elegans during 3D cultivation. This will be especially important for the study of known behaviors identified in 2D, and the identification of novel behaviors unique to 3D cultivation.

Protokoll

1. Bereiten Sie Lösungen für NGT-3D und NGB-3D

1. Bereiten Sie die folgenden sterilen Lösungen: 1 L von 0,1454 M NaCl - Lösung, 1 l 1 M CaCl _2, 1 l 1 M MgSO _4, LB-Medium (LB), 1 L 1 M KPO & _sub4 ; -Puffer (108,3 g KH & _sub2 ; PO ₄ und 35,6 g K ₂ HPO ₄ und füllen H ₂ O auf 1 L). Die Produktion von NGM den Einsatz dieser Lösungen können in einem früheren Protokoll ^10.
2. Autoklaven-Lösungen bei 121 ° C, 15 min.
3. Vorbereitung 50 ml einer sterilen 5 mg / ml Cholesterinlösung. In einem 50 ml konischen Röhrchen, mischen 0,25 g Cholesterin und 50 ml 99,99% Ethanol und gut mischen. Sterilisieren nicht. Sterilisieren des Cholesterinlösung mit einer 50 ml-Spritze mit einer 0,45 um-Spritzenfilter. Dies wird auch jegliche ungelösten Cholesterol entfernen.
4. (Optional) Bereiten Sie 10 ml einer 150 mM von 2'-Desoxy-5-fluoruridin (FUdR) Lager. In einem 15 ml konischen Röhrchen, mischen 0,3693 gvon FUdR und 10 ml destilliertem Wasser. Gut schütteln.

2. Bereiten Sie Bakterienkultur für NGT-3D und NGB-3D

1. Impfen 10 ml LB-Brühe mit Bakterien. Die Standard - Bakterien für C. elegans verwendet Fütterung ist E. coli - Stamm OP50.
2. Kultur der Bakterieninokulation bei 37 ° C in einem Schüttelinkubator über Nacht.
3. In Vorbereitung für eine serielle Verdünnung Aliquot 9 ml der NaCl-Lösung in sterile 15 ml konischen Röhrchen. Zum Beispiel aliquoten 9 ml in insgesamt 7 Röhren 10 ^-7 Verdünnung von OP50 Stamm E. coli zu machen.
4. Mit einem sterilen 1000 ul Pipette Pipette 1 ml der Bakterienkultur oder verdünnte Bakterienkultur in das sterile neues Röhrchen mit 9 ml NaCl-Lösung und Vortex gut die 10 ml Mischung. Wiederholen, bis die gewünschte Bakterien Verdünnung erreicht ist.
   HINWEIS: Die gewünschte Bakterien Verdünnung hängt von der Art und den Zustand der Bakterien sowie die genauen experimentellen Bedingungen.Zum Beispiel kann eine 10 ^-6 - 10 ^-8 Verdünnung von OP50 Stamm E. coli war ausreichend von 1 zu produzieren - 200 Bakterienkolonien pro 6,5 ml NGT-3D - Röhre. Worms zuverlässig entwickelt und reproduziert werden normalerweise , wenn die Anzahl der Kolonien über 60 war, das bei einer Verdünnung von 10 ^-6 aufgetreten - 10 ^-7. Für NGB-3D, eine Verdünnung von 10 ^-8 verwenden.

3. Herstellung NGT-3D und NGB-3D (200 ml)

1. Nachdem die Bakterienkultur vorbereitet, in einem 500 ml Kolben 0,6 g NaCl, 1 g granulierter Agar und 0,5 g Pepton mischen. Legen Sie eine Rührfisch in den Kolben.
2. In 195 ml destilliertem Wasser und bedecken Mund des Kolbens mit Aluminiumfolie.
3. Autoklaven 121 ° C für 15 min.
4. Setzen Sie den heißen autoklaviert Kolben auf einer Rührplatte, und rühren Sie mit mäßiger Geschwindigkeit für mindestens 2 Stunden. Kühlen des Kolbens auf 40 ° C. Achten Sie darauf, ausreichend zu kühlen, wie hier bei hohen Temperaturen weiter zu Trübungen des fertigen Agar führen kann.Jedoch niedrigere Temperaturen zu einer vorzeitigen Aushärtung des Agar führen kann.
   1. (Optional) Um den Kühlprozess, der Kolben wird in einem 40 ° C Wasserbad 15 Minuten vor dem Aufsetzen auf einer Rührplatte beschleunigen.
5. Wenn die Temperatur des Agarmedien 40 ° C erreicht, wird mit 200 & mgr; l 1 M CaCl _2, 200 & mgr; l von 5 mg / ml Cholesterin - Lösung, 200 & mgr; l 1 M MgSO ₄ und 5 ml 1 M KPO ₄ Puffer , wenn die Lösung zu rühren weiterhin bis zu Endkonzentrationen von 1 mM CaCl _2, 5 & mgr; g / ml Cholesterin, 1 mM MgSO _4, 1 mM KPO _4.
   1. (Optional) für NGT-3D - Lebensdauer - Test hinzuzufügen 80 ul 150 mM FUdR bis zu einer Endkonzentration von 120 uM ^12.
6. In 6 ml der 10 ml verdünnt Bakterienkultur aus Schritt 2.4 in den Kolben direkt.
   1. (Optional) Für NGT-3D, entfernen Sie 6 ml Agar-Medien vor dem Schritt 3.6 und halten Sie sie separat warm. Diese Medien werden für die verwendet werden, bakterienfreioberste Schicht.
7. Mit einer sterilen Verfahren verzichtet werden die Medien in eine sterile Kulturkammer. Stellen Sie sicher, dass die Abdeckung der Kammer dicht schließt.
   1. (Optional), um Bakterienkolonien zu verhindern an der oberen Oberfläche des Agars aus, Ausbilden einer Schicht aus bakterienfreien Agarmedium aus Schritt 3.6.1 auf der Oberseite, bevor die Medien aus Schritt 3.7 vollständig aushärtet. Dies wird eine bakterienfreien Zone an der Oberseite der NGT-3D erstellen.
   2. Für NGT-3D, gießen Sie 6,5 ml Medium in die 8 ml durchsichtigen Kunststoff-Teströhrchen eine Bakterien-Agar-Schicht zu machen, und vorsichtig 200 ul der bakterienfreien Medien auf der Oberseite der halbgehärteten 3D-Medien verzichtet werden, um eine dünne bakterien- machen freie Schicht an der Spitze.
   3. Für NGB-3D, gießen 65 ml Medium in die 25 cm ² durchsichtigen Kunststoff - Zellkulturflasche. Dieser Betrag sollte den Körper der 25 cm ² Zellkulturflasche füllen.
8. Verlassen Kammern vertikal bei Raumtemperatur für eine Woche Bakterienkolonien wachsen zu lassenzu einer erheblichen Größe von mindestens 1 mm Durchmesser.
   1. (Optional) für Lebensdauer-Test in NGT-3D, Abdeckung Kammern mit Aluminiumfolie Licht Abbau von FUdR zu verhindern.

4. Messen Fitness von Wurmpopulation auf NGT-3D (Relative Brood Größe Assay)

1. Wählen Sie eine L4-Stadium Wurm einen Platindraht auswählen und Transfer auf eine bakterienfreie NGM Platte verwenden. Lassen Sie Wurm, sich frei für ein paar Minuten bewegen Bakterien zu entfernen, um seinen Körper befestigt.
2. Wiederholen Sie Schritt 4.1 und stellen Sie sicher, dass der Wurm frei von Bakterien ist. Im Allgemeinen zwei Wiederholungen von 4.1 sind genug.
3. Legen Sie das saubere Wurm auf der Oberfläche des 3D-Medien mit einem Platindraht-Pick. Der Wurm sollte letztlich auch den Agar in die Agarmatrix 3D eingeben.
4. Schließen Sie die Abdeckung etwas Luft lose damit in das Rohr zu bekommen, aber der Agar-Medien zu verhindern Trocknen.
5. bei 20 ° C für 96 Stunden inkubieren.
6. Nach 4 Tagen schließen die Deckel verschließen und dieNGT-3D Kulturkammer in ein 88 ° C Wasserbad das Agar zu schmelzen. Die Hitze tötet Würmer aber ihre Körper intakt bleiben.
   HINWEIS: Bei Verwendung von 8 ml-Röhrchen für NGT-3D, 20 - 30 min Inkubation ist in der Regel ausreichend.
7. Unter Verwendung einer Glaspipette, übertragen Sie die geschmolzene Medien auf eine 9 cm Petrischale aus Kunststoff. Plastikpipetten werden nicht empfohlen, da Würmer oft bei ihnen bleiben kann.
8. Mit Hilfe eines Übertragungs Stereo Binokular, zählen die Anzahl der Würmer an der L3, L4 und adulten Stadien. Zählen Sie nicht Würmer, die L2-Stadium sind und jünger, als die F1 und F2 Generationen hier verwechselt werden kann. Somit ist dieser Test eine relative Brutgröße Assay anstatt insgesamt Brutgröße Assay.

5. Bild und Wurm Verhalten Record auf NGB-3D

1. Wählen Sie eine L4-Stadium Wurm mit einem Platindraht wählen, und entfernen Sie alle an der Oberfläche stecken Bakterien auf eine bakterienfreie NGM Platte übertragen und ermöglicht es, sich frei für ein paar Minuten zu bewegen.
2. Wiederholen Sie Schritt 5.1 sicherstellen, dass die WOrm ist frei von Bakterien.
3. Legen Sie das saubere Wurm auf die Mitte der Agar-Oberfläche des NGB-3D in der Nähe des Halses der Flasche mit einem Pick Platindraht. Der Wurm sollte letztlich auch den Agar in die Agarmatrix 3D eingeben.
4. Schließen Sie die Abdeckung etwas Luft lose damit in das Rohr zu bekommen, während das Trocknen der Agar-Medien zu verhindern.
5. Bild oder notieren Sie die Schnecke unter einem Transmissions-Stereo Binokular. Stellen Sie den Fokus wie der Wurm der 3D-Matrix bewegt sich durch.

Ergebnisse

Die Konstruktion von NGT-3D ist eine einfache und unkomplizierte Protokoll , das mit kleinen Bakterienkolonien in einem Agar gefüllte Reagenzglas führt ganzen agar (1A) angeordnet sind . Würmer können frei durch die Agarmatrix bewegen, zu finden und den Verzehr der Bakterienkolonien. Um zu bestätigen , ob C. elegans reproduzieren kann und wachsen normalerweise in NGT-3D, verglichen wir die Fruchtbarkeit und Larvenentwicklung in 3D mit Standardplatten 2D NGM...

Diskussion

Das Labor Anbau von C. elegans die klassischen Nematoden Nährmedien Platten mit entscheidend für die Hunderte von wichtigen Entdeckungen , die in C. elegans Forschung hat zur Verfügung gestellt. Hier präsentieren wir neue Methoden C. elegans in einer Umgebung zu pflegen , die genauer ihre natürliche dreidimensionale Lebensräume widerspiegelt. Obwohl auch andere Methoden verwendet wurden , ¹³ C. elegans in 3D zu beobachten, ist dies das erste Protokoll , das den Anbau ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB broth, Miller (Luria-Bertani)	Difco	224620
Sodium chloride	DAEJUNG	7548-4400	58.44 MW
Agar, Granulated	Difco	214530
Peptone	Bacto	211677
Calcium chloride, dihydrate	Bio Basic	CD0050	2*H2O; 147.02 MW
Cholesterol	Bio Basic	CD0122	386.67 MW
Ethyl alcohol	B&J	RP090-1	99.99%; 46.07 MW
Magnesium sulfate, anhydrous	Bio Basic	MN1988	120.37 MW
Potassium phosphate, monobasic, anhydrous	Bio Basic	PB0445	136.09 MW
2'-Deoxy-5-fluorouridine	Tokyo Chemical Industry	D2235	246.19 MW
Potassium phosphate, dibasic, anhydrous	Bio Basic	PB0447	174.18 MW
Multi-Purpose Test Tubes	Stockwell Scientific	ST.8570	8 ml
Test Tube Closures	Stockwell Scientific	ST.8575
Cell Culture Flask	SPL Lifescience	70125	25 cm2
Research Stereo Microscope	Nikon	SMZ18
High-Definition Color Camera Head	Nikon	DS-Fi2
PC-Based Control Unit	Nikon	DS-U3
NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software	Nikon	MQS32000