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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von murinen orthotope Blasentumoren in weiblichen C57BL / 6J-Mäusen und für die Überwachung des Tumorwachstums.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von Blasentumoren in weiblichen Mäusen C57BL / 6J der murinen Blasenkrebs-Zelllinie MB49 verwendet, die menschliche Prostataspezifischen Antigen (PSA), und das Verfahren für den Nachweis der Tumorimplantation abzusondern modifiziert wurde. Kurz gesagt, werden die Mäuse mit injizierbaren Medikamenten betäubt und in der Rückenlage zu legen hat. Urin aus der Blase geräumt und 50 ul Poly-L-Lysin (PLL) wird langsam mit einer Geschwindigkeit von 10 & mgr; l / 20 s unter Verwendung einer 24 G IV-Katheter instilliert. Es wird 20 min in der Blase links durch den Katheter Stopfen verschlossen. Der Katheter wird entfernt und PLL wird durch sanften Druck auf die Blase verlassen. Dies wird durch Instillation des murinen Blasenkrebs - Zelllinie (1 x 10 5 Zellen / 50 & mgr; l) mit einer Geschwindigkeit von 10 & mgr; l / 20 s folgte. Der Katheter wird zugestöpselt vorzeitige Entleerung zu verhindern. Nach 1 h werden die Mäuse mit einer Umkehrung Droge wieder auf, und die Blase verlassen wird. Die langsame Einträufeln Rate ist wichtig,wie es reduziert vesico-ureteral Reflux, die Tumoren in der oberen Harnwege und in den Nieren auftreten verursachen können. Die Zelllinie sollte auch wieder ausgesetzt werden Verklumpung von Zellen zu reduzieren, da dies zu einer ungleichmäßigen Tumorgrößen nach der Implantation führen kann.

Diese Technik induziert Tumoren mit hohem Wirkungsgrad. Das Tumorwachstum wird durch Urin-PSA-Sekretion überwacht. PSA Marker Überwachung ist zuverlässiger als Ultraschall oder Fluoreszenzabbildung für den Nachweis der Anwesenheit von Tumoren in der Blase. Tumoren in Mäusen im Allgemeinen eine maximale Größe, die einen negativen Einfluss auf die Gesundheit von etwa 3 erreichen - 4 Wochen, wenn sie unbehandelt. Durch die Überwachung des Tumorwachstums ist es möglich, Mäuse zu unterscheiden, die von den ausgehärteten wurden, die nicht erfolgreich mit Tumoren implantiert. Mit nur Endpunktanalyse, kann der letztere fälschlicherweise angenommen, dass durch Therapie geheilt wurden.

Einleitung

Das Ziel dieser Methode ist murine orthotope Blasentumoren zu erzeugen und die implantierten Tumore so genau wie möglich zu überwachen, so dass Mäuse ohne Tumorimplantation an Endpunktsanalyse nicht gedacht, um geheilt wurden. Insgesamt reduziert das Verfahren die Notwendigkeit für experimentelle Analyse für eine große Anzahl von Mäusen gezeigt, und eine höhere Genauigkeit sicherzustellen therapeutische Ergebnisse bei der Bestimmung.

Die Entwicklung eines orthotopischen Modell für Krebs ist wichtig, da die Implantation von Tumorzellen nicht subkutan nicht die Umgebung der klinischen Erkrankung rekapitulieren oder die Entwicklung von therapeutischen Strategien ermöglichen. Die Architektur der Blase ermöglicht die Instillation von Blasenkrebstherapien direkt in die Blase mit minimaler systemischer Wirkungen. So Tiermodelle, die diese Umgebung, wie orthotop Modell rekapitulieren, sind wichtige neue Therapien zu bewerten. Die Schlussfolgerungen aus jedem Versuchsaufbau gezogen werden dependent von den Grenzen des Modells.

Verschiedene Techniken wurden zur Herstellung von orthotope Blasentumoren in Mäusen entwickelt. Diese stützen sich auf eine Beschädigung des Glycosaminoglycans Schicht der Blase, so dass Tumorzellen implantiert werden. Die verwendeten Techniken umfassen Elektrokauterisation, die in einem einzigen Punkt der Beschädigung in der Blasenwand führt, was zur Tumorentwicklung an einer Stelle in der Blase 1,2. Allerdings ist die Erfolgsrate der Tumorimplantation Elektrokauterisation unter Verwendung von betreiberabhängig von 10 unterschiedlichen - 90%, und es schließt die Gefahr, dass die Blasenwand durchstochen wird, was zu Tumoren in der Bauchhöhle zu entwickeln. Chemische Kauter wird unter Verwendung von Silbernitrat durchgeführt, welche Schäden die Blasenwand 3. In ähnlicher Weise wurde Säure 4 der Blasenwand zu beschädigen. Trypsin hat auch die Blase als auch zu beschädigen 5 verwendet. Diese Verfahren können bei der Entwicklung von mehr als einem Tumor in der Blase führen.Darüber hinaus besteht die Gefahr von schweren Schäden an der Blase, wenn die Chemikalien zu lange in Kontakt mit der Blasenwand verbleiben. Die Methode von Ninalga et al. verwendet die sich positiv auf die Blasenwand zu beschichten geladene Moleküle poly-L-Lysin (PLL) 6; Dies ermöglicht die geladenen Tumorzellen negativ auf die Glycosaminoglycan Schicht der Blase zu halten. Dieses Verfahren führt im allgemeinen zu mehr als einem Tumor in der Blase entwickeln, aber der Tumorimplantation ist bei 80-100% 4,7. Technisch ist es auch die einfachste Verfahren auszuführen. Um sicherzustellen, dass die Tumoren, die ziemlich auch in der Größe zu entwickeln, ist es wichtig, dass die Tumorzellen nicht in großen Klumpen vor der Implantation gruppiert.

Um die therapeutische Wirksamkeit zu bewerten, ist es am besten, diese Studie an Mäusen mit ziemlich ähnlich großen Tumoren durchzuführen. Somit kann eine gute Erkennungssystem, das die Tumorgröße bald nach der Implantation zu quantifizieren kann, ist wichtig. Mehrere Strategien haben Bienen verwendet Tumoren zu evaluieren. Dazu gehören die Magnetresonanztomographie (MRI) 8-10, Fluoreszenz 11, Biolumineszenz 12,13, Ultraschall 14 und enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 15,16. Während MRI und Ultraschall keine Modifikationen der Tumorzellen erforderlich ist, besteht ein Bedarf für empfindliche Geräte und Kontrastmittel für die MRI. Die Fluoreszenz-, Lumineszenz- und ELISA-basierten Assays erfordern Modifikation der Tumorzellen Markerproteine ​​zu exprimieren, die mit diesen Methoden nachgewiesen werden können. Für Lumineszenz wird ein Substrat für den Nachweis der Luciferase-Aktivität erforderlich ist; Somit gibt es einen zusätzlichen Schritt und höhere Kosten. Sowohl Lumineszenz und Fluoreszenz erfordern spezielle Ausrüstung. Zur Herstellung von Fluoreszenz, grün fluoreszierendes Protein (GFP) Cyclisierung, die durch molekularen Sauerstoff katalysiert wird, erforderlich. Somit kann die GFP-Expression innerhalb einer Tumormasse auf Zugang zu Sauerstoff abhängig variabel sein, so dass dies ein ziemlich unzuverlässig Marker 17. Die Modifikation der murinen Zelllinie Blasenkrebs MB49 menschlichen Prostata - spezifisches Antigen (PSA) 15,16 absondern als Surrogat - Marker eine andere Strategie. Diese Marker stellen auch ein alternatives Mittel zur Bestätigung Tumor Anwesenheit bei der Beendigung des Versuchs, so dass sie eine Alternative zu Immunhistochemie. Diese Studie berichtet über die PLL Verfahren orthotope Tumorimplantation und stellt einen Vergleich der Tumordetektionssysteme, nämlich ELISA, Fluoreszenz und Ultraschallbildgebung.

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Protokoll

Alle Tier Arbeit auf die Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) Leitlinien für Tiernutzung eingehalten und Handhabung (Protokollnummer 084/12) an der National University of Singapore.

1. Growing MB49-PSA Zellen in vitro und PSA Secretion Mess

  1. Pflegen murine Blasenkrebszellen MB49-PSA 15 in vollständigen Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt, 2 mmol / L L-Glutamin und 0,05 mg / ml Penicillin-Streptomycin in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. Mit 200 & mgr; g / ml Hygromycin B den Selektionsdruck der PSA-sezernierenden Zellen zu erhalten.
  2. Zu PSA - Sekretion, Platte 1 x 10 6 Zellen in einer 6-Well - Kulturplatte bestimmen , und Inkubieren bei 37 ° C in Gegenwart von 5% CO 2 für 48 h.
  3. Zwei Tage später, sammeln Sie den Überstand für die PSA-Messung.
    1. mit einer Pasteurpipette, übertragen Sie die supernatant in ein Zentrifugenrohr 15 mL.
    2. Zentrifuge für 5 Minuten bei 250 xg in Fließzellen und Debris zu entfernen. Wenn der PSA-Test an einem anderen Tag durchgeführt wird, Speichern der Überstand bei - 30 ° C in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Falls nicht, gehen direkt zum nächsten Schritt.
    3. Bestimmen Sie die PSA - Konzentration eine Mensch-freies PSA ELISA - Kit 7 verwenden.
  4. Auflisten der plattierten Zellen.
    1. Mit Hilfe einer Pasteur-Pipette, waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 1 ml DMEM. Absaugen und vollständig die Medien zu entfernen.
    2. 1 ml frisches Medium und kratzen vorsichtig mit einem Zellschaber, die Zellen aus dem Bohrloch zu entfernen.
    3. Transfer der Zellen in ein Mikrozentrifugenrohr und resuspendieren sie gründlich eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten.
    4. Mischen Sie gleiche Volumina der Zellsuspension und einer 0,4% Trypanblau Lösung. Zählen Sie die lebenden Zellen (die nicht den Farbstoff aufnehmen) unter Verwendung einer Zählkammer.
  5. Berechnen Sie die PSA-Expression als ngvon PSA / ml Medium / 10 6 Zellen. Der PSA - Expression von MB49-PSA - Zellen für die Implantation in Mäuse ist 80 bis 120 ng / ml / 10 6 Zellen.

2. Bestimmung der Empfindlichkeit von PSA-Messungen mittels ELISA und Real-time PCR-Analyse

  1. Platte MB49-PSA - Zellen in komplettem DMEM - Medium in einer 6-Well - Kulturplatte mit unterschiedlichen Mengen an elterlicher MB49 - Zellen , so dass es ein Maximum von 1 x 10 6 Zellen pro Vertiefung ( das heißt, 10 0, 10 1, 10 2, 10 4 3, 10, 10 5 oder 10 6 MB49-PSA - Zellen werden mit 10 6, 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10 1 oder 10 0 MB49 - Zellen).
  2. Einen Tag später, zur Erhebung der Überstand für PSA-Messung, wie in Schritt 1.3 beschrieben. Bestimmen Sie die PSA - Konzentration eine Mensch-freies PSA ELISA - Kit 7 verwenden.
  3. Extrahieren Sie die RNA aus den Zellen.
    1. Lyse derZellen direkt in der Platte durch Zugabe von 1 ml RNA-Extraktion Reagenz.
    2. Inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur und übertragen das Zelllysat in ein Mikrozentrifugenröhrchen. In 0,2 ml Chloroform und verwirbeln die Proben 15 s kräftig. Inkubieren sie für 3 min bei Raumtemperatur.
    3. Zentrifugiere die Proben bei 12.000 xg für 15 min bei 4 ° C. übertragen Sie vorsichtig die obere wässrige Phase (0,5 ml) in ein frisches Röhrchen, ohne die Interphase zu stören.
    4. 0,5 mL Isopropylalkohol. Inkubieren für 10 min bei Raumtemperatur. Zentrifugiere die Proben bei 12.000 xg für 10 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand vollständig, ohne Störung der RNA Niederschlag am Boden des Röhrchens.
    5. Waschen Sie das Pellet einmal mit 1 ml 75% Ethanol. Zentrifuge bei 7.500 xg für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie das gesamte Ethanol und erlauben das Pellet an der Luft trocknen für 10 min.
    6. Lösen Sie die RNA in 30 ul Nuklease-freies Wasser. Inkubieren Sie für 5 min bei 60 ° C, die so zu erhöhen,lubility.
    7. Quantifizieren der RNA durch Messung der Extinktion ultraviolettem (UV) -Spektroskopie bei 260 nm (A260) gemessen. Um RNA Reinheit beurteilen zu können, messen die Absorption bei 280 nm (A280) und berechnen Sie die A260 / A280-Verhältnis, das über 1,6 sein sollte.
  4. Revers transkribieren cDNA von 2 ug RNA.
    1. Bereiten Sie das Reaktionsgemisch auf Eis und überträgt es auf 0,2 ml-Röhrchen.
    2. Zentrifuge kurz die Rohre um den Inhalt des Abschaltens und Luftblasen zu beseitigen.
    3. Laden die Rohre in den Thermocycler und durchzuführen, die reverse Transkription bei den folgenden Bedingungen: 60 min bei 37 ° C, gefolgt von 5 min bei 95 ° C. Nachdem der Lauf beendet ist, halten die cDNA-Proben bei 4 ° C.
    4. Lagern Sie die Proben bei - 30 ° C für die langfristige Lagerung.
  5. Führen Sie eine Echtzeit-PCR-Analyse für PSA und Cytoplasma-beta-Actin. Beta-Actin verwendet, um die Proben zu normalisieren. Führen des Assays auf 100 ng revers transkribierter RNA in einer 96-well plate. Assay alle Proben in dreifacher Ausfertigung. Führen 40 Zyklen mit den folgenden Parametern: 2 min bei 50 ° C, 10 min bei 95 ° C, 15 s bei 95 ° C für die Denaturierung und 1 min bei 60 ° C. Stellen Sie die niedrigste Nachweisgrenze bei einem Zyklus Schwellenwert (CT) von 35; Somit wird jede Probe mit einem CT-Wert über 35 wird als nicht nachweisbar.

3. Die Aufrechterhaltung der Tumorigenität des MB49-PSA-Zelllinie

HINWEIS: Längerer Wachstum in vitro führt zu einem Verlust von tumorigenicity. Zur Aufrechterhaltung der tumorigenicity, die MB49-PSA-Zelllinie wird durch die Maus mindestens einmal alle 2 Jahre agiert.

  1. Zellen.
    1. Ernte exponentiell wachsenden Zellen, indem sie vorsichtig mit einem sterilen Zellschaber. Mischen Sie gleiche Volumina der Zellsuspension und einer 0,4% Trypanblau Lösung. Zählen Sie die lebenden Zellen mit einer Zählkammer. Sie nicht implantiert werden, wenn mehr als 20% der Zellen tot sind.
    2. Berechne die Menge an lebenden Zellen erforderlich (1 x 107 Zellen / ml) und sie auf ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 250 xg für 5 min bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. Re-suspend das Zellpellet in DMEM leere Medien. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal alle Spuren von FBS vor der Implantation zu entfernen.
    3. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis, bis die Mäuse für die Implantation bereit sind.
  2. Implantieren subkutan die Tumorzellen in Mäusen auf der Rückenflanke.
    1. Anästhesieren einen 4- bis 6-Wochen alten C57BL6 / J-Maus eine Mischung aus dem Anästhetika Ketamin und Medetomidin (75 mg / kg und 1 mg / kg, jeweils), intraperitoneal mit 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht verwendet.
    2. Rasieren Sie die rechte Flanke, die Haut zu belichten.
    3. Mit einer Pinzette, heben Sie die Haut und macht sie von der darunter liegenden Muskeln zu trennen und zu injizieren 0,1 ml der Zellsuspension (1 × 10 6 Zellen) subkutan mit einer 24 G - Nadel. Während die Nadel entfernt wird, kneifen die Injektionsstelle für 5 bis 10 s, so dass die Tumorzellen tunnicht aus der Injektionsstelle austreten.
    4. Beleben Sie die Maus mit einer subkutanen Injektion von Atipamezol (1 mg / kg) bei 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht.
  3. Überwachen Sie das Tumorwachstum alle zwei Tage durch Messen des Tumordurchmesser mit Sätteln. Das Tumorvolumen wird berechnet mit der Formel mit v = (ab 2) / 2, wobei "a" die längste Abmessung und "b" ist die senkrechte Breite, die beide in mm.
  4. Wenn das Tumorvolumen mindestens 50 mm 3 (ungefähr 7 Tage) ist, euthanize die Maus mit CO 2. Excise die Tumormasse mit einem Paar von einer sterilen Pinzette und Schere unter aseptischen Bedingungen und in DMEM.
  5. In einer 6-Well-Kulturplatte, Hackfleisch, den Tumor in kleine Stücke mit sterilen Skalpellen. Verwenden Sie eine 1 ml Spritzenkolben als "Stößel", um die Tumor aufzuschlüsseln.
  6. 3 ml vollständigem DMEM und aufrechtzuerhalten , die Zellen in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2.
  7. Sobald haften die Zellen an die plate (zwischen einem und zwei Tage), entfernen Sie die Medien, Schmutz und nicht haftenden Zellen, indem sie mit einer sterilen Pasteur-Pipette vorsichtig abgesaugt. Waschen Sie zweimal mit DMEM. Achten Sie darauf, nicht die Zellen stören.
  8. In 1 ml DMEM und die Zellen ernten, indem sie mit einem Zellschaber. So wählen und einzelne Kolonien zu erweitern, um die Zellen zählen eine Hämozytometer und Platte 1 Zelle pro Vertiefung in einer 96-Well-Kulturplatte verwendet. Kulturzellen in DMEM mit 200 ug / ml Hygromycin B bei 37 ° C und 5% CO 2.
  9. Ändern Sie die Medien und Antibiotika alle 4 - 5 Werktage. Überwachen Sie die Zellen, bis sie bei etwa 80-90% konfluent sind. Re-Platte die Zellen auf einer 24-Well-Kulturplatte durch Pipettieren Zellen aus dem Bohrloch zu entfernen.
  10. Sobald die Zellen in der 24-Well-Kulturplatte konfluent sind, lösen sie durch mit einem Zellschaber und sie in einer 6-Well-Kulturplatte Platte.
  11. Bildschirm, um die verschiedenen Klone für PSA-Sekretion, wie in Schritt 1 beschrieben Cryo-Erhaltung der Klon mit der höchsten PSA GeheimnisIon und verwenden Sie es für die zukünftige Mausexperimenten.

4. Das Implantieren der Tumor

HINWEIS: Jede Maus ist mit 1 x 10 5 MB49-PSA - Zellen in 50 & mgr; l DMEM leere Medien in der Blase implantiert. Durch den toten Raum in dem Katheter, bereiten immer mehr Volumen (mindestens 100 & mgr; l extra pro Maus). Ein alternativer Ansatz wäre es , eine Luftspritze zu verwenden , wie von Kasman et al. 5 anstelle einer Spritze.

  1. Zellen.
    1. Einen Tag vor der Implantation, wenn die Zellen etwa 80% konfluent, passage die MB49-PSA Tumorzellen in vollständigem DMEM-Medium (ergänzt mit 10% FBS, 2 mmol / l L-Glutamin, 0,05 mg / ml Penicillin-Streptomycin und 200 & mgr; g / ml Hygromycin B) bei 37 ° C und 5% CO 2 bei einem Teilungsverhältnis von 1: 2.
    2. Am Tag des Verfahrens, ernten die Zellen, indem sie vorsichtig mit einem sterilen Zellschaber. Mischen Sie gleiche Volumina der Zellsuspension undeine 0,4% Trypanblau Lösung. Zählen Sie die lebenden Zellen mit einer Zählkammer. Sie nicht implantiert werden, wenn mehr als 20% der Zellen tot sind.
    3. Berechne die Menge an lebenden Zellen erforderlich (2 x 10 6 Zellen / ml) und übertragen sie in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 250 xg für 5 min bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. Re-suspend das Zellpellet in DMEM leere Medien. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal alle Spuren von FBS vor der Implantation zu entfernen.
    4. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis, bis die Mäuse für die Implantation bereit sind.
  2. Lassen Sie das 4- bis 6-Wochen alten weiblichen C57BL / 6J-Mäuse für eine Woche vor dem Eingriff zu akklimatisieren. Alle tierischen Arbeiten müssen in einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten.
    1. Wiegen jeder Maus und injizieren Anästhesie (75 mg / kg Ketamin und 1 mg / kg Medetomidin) intraperitoneal mit 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht. Das Körpergewicht zwischen 17 und 22 g betragen. Bestätigen anesthetization durch keine respo Beobachtungnse nach einer Zehe Prise.
    2. Zur Identifizierung, markieren Sie das Ohr einen Ohr Stempel verwenden.
    3. Injizieren Hartmann-Lösung oder Verbindung Natriumlactat intraperitoneal in 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht jedes 1 bis 2 h für Feuchtigkeit.
    4. Bewerben sterile Augensalbe für beide Augen mit einem sterilen Watte Lampe verwenden, da die Blinzelreflexes unter Narkose verloren geht und die Augen austrocknen. Erneute wenn nötig.
    5. Legen Sie die Mäuse in Rückenlage auf dem Papier Handtücher auf einem Wärmepackung (durch den Kontakt mit Luft aktiviert) Körpertemperatur und kleben Sie die Hinterbeine nach unten zu halten.
  3. Mit einem Finger gelten sanften Druck auf den unteren Bauchbereich und sammeln Urin aus der Blase in ein Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 ml. Diese Probe dient als Grundwert von Harn-PSA.
  4. Ziehen Sie sterile Poly-L-Lysin (PLL) in einen 1-ml-Spritze und befestigen Sie eine 24-Gauge-IV-Katheter, mit der Nadel Stilett entfernt. Schmiermittel auf der Spitze des Katheters und insert der Katheter durch die Harnröhre in die Blase Zange mit der Katheterisierung zu führen. Stoppen Sie, wenn Sie Widerstand spüren. HINWEIS: Die Forscher mit ihren Tierärzten über die Notwendigkeit der Verwendung eines Gleitgel mit Anästhetikum für intravesikale Instillationen und die Verwendung von post-Verfahren Analgetika diskutieren sollten.
  5. Instill 50 ul PLL langsam, mit einer Geschwindigkeit von 10 & mgr; l alle 20 s, zu vermeiden vesico-ureteral Rückfluß 18. Lassen Sie den Katheter in die Blase für 20 min mit einem Anschlag zu verhindern out-Flow.
  6. Nach 20 min den Katheter zu entfernen und die Blase von Inhalten durch leichten Druck auf den unteren Bauchbereich räumen. Mit einem leeren 1-ml-Spritze, spülen Sie alle verbleibenden Inhalte aus dem Katheter.
  7. Mix MB49-PSA-Zellen gründlich durch Pipettieren und ziehen sie in eine 1-ml-Spritze. Bringen Sie den Katheter und mit Schmiermittel. Instill 50 ul 1 x 10 5 Zellen mit einer langsamen Geschwindigkeit von 10 & mgr; l alle 20 s. Setzen Sie den Anschlag aufder Katheter. Geben Sie Kontrollmäuse 50 & mgr; l Kochsalzlösung.
  8. Nach 1 h die Katheter entfernen und die Blase von allen Inhalten räumen. Entfernen Sie das Klebeband an den Hinterbeinen und legen Sie die Mäuse auf ihre ventralen Seiten. Revive die Mäuse durch subkutane Injektion der Umkehrung Arzneimittel (1 mg / kg Atipamezol) bei 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht.
  9. Überwachen Sie die Mäuse bis Motilität beobachtet wird. Bringen Sie die Mäuse in ihre Käfige.
  10. Nach Abschluss eines Tumordetektion Protokoll (§§ 5, 7 oder 8), einschläfern die Mäuse mit CO 2. Post-mortem Tumordetektion wird in Abschnitt 6 beschrieben.

5. Überwachung Tumorwachstum mit ELISA

HINWEIS: Tumor Präsenz und Wachstum in Mäusen überwacht durch PSA-Sekretion im Urin zu messen. Die Forscher sollten auf die Überwachung der Tiergesundheit mit ihren Tierärzten beraten und Wohlbefinden nach der Tumorimplantation und humane Endpunkte.

  1. Es gibt zwei Verfahren Urin von Mäusen zu sammeln.
    1. Sammeln Sie Urin über Nacht durch eine einzige Maus in einem individuellen metabolischen Käfig platzieren entworfen Urin von Fäkalien zu trennen. Wenn der Setup-Kühlung nicht hat, ein Protease-Inhibitor (100 & mgr; l) in den Urinsammelröhrchen geben über Nacht Abbau von PSA zu verhindern. Jedoch begrenzt die Anzahl der verfügbaren metabolischen Käfigen die Nützlichkeit dieser Methode der Urinsammlung.
    2. Wo es logistisch unmöglich ist Stoffwechselkäfigen (wie in den ABSL2 Zimmer) zu verwenden, sammeln einen Finger Fleck Urin von mit leichtem Druck auf den unteren Bauchbereich auszuüben, während die Mäuse betäubt werden, wie in Schritt 4.2.1 beschrieben. Dies erfolgt in der Regel vor der Therapie eingeflößt wird. Aus unserer Erfahrung können mindestens 150 & mgr; l Urin 1 h nach der Anästhesie gesammelt werden.
  2. Ab sofort stellen die gesammelten Urin auf Eis. Hämaturie kann ab der zweiten Woche nach der Tumorimplantation sichtbar. Stark hämolytische Proben können ELISA-Analyse beeinflussen. Daher Urinsmuss auf Eis und verarbeitet schnell nach der Sammlung platziert werden.
  3. Zentrifugieren der Urinröhrchen bei 6.700 xg für 5 min bei 4 ° C Zellen oder Zelltrümmer zu entfernen.
  4. Um die Differenz in Urinmenge zwischen den Mäusen, aliquoten der Urin in neue Schläuche zu normalisieren und lagern Sie sie bei -30 ° C bis die Analysen für PSA Durchführung eines ELISA - Kits 7 und Kreatinin unter Verwendung eines Assay - Kit 7 verwenden. Obwohl Mäuse PSA nicht produzieren, gibt es geringe Mengen an nicht-spezifische Bindung nachgewiesen, die unter Verwendung von ELISA. Für Proben als positiv betrachtet werden, muss der Schwellenwert auf Werte eingestellt werden , größer ist als in normalen Mäusen + 3 Standardabweichungen (SD) 15.

6. Nachweis von Tumor Präsenz mit Real-time PCR

  1. Bei Beendigung der Bauchhöhle der Maus sezieren und die Blase zu lokalisieren. Excise die Blase und legen Sie sie in eine Cryovial. Gefriert sofort in flüssigem Stickstoff.
  2. Extrahieren Sie die RNA durch das Gewebe in einer RNA-Extr HomogenisierenAktion Reagenz.
  3. Führen der reversen Transkription und Echtzeit-PCR-Analyse für PSA, wie oben in Abschnitt 2 beschrieben.

7. Monitoring Tumorwachstum mit Fluoreszenz-Imaging

  1. Etikett 1 x 10 7 MB49-PSA - Zellen mit einem Nahinfrarot-Fluoreszenzfarbstoff 19.
  2. Re-Platte und ernten die markierten Zellen an den Tagen 4, 7, 11, 14, 18 und 21 zu überprüfen , ob Zellen behalten Lebensfähigkeit und Fluoreszenz mittels Durchflusszytometrie 20.
  3. Implantieren Sie die markierten MB49-PSA-Zellen in Mäusen Blasen, wie in Abschnitt 4 oben beschrieben.
  4. Überwachen Sie den Tumorwachstum eines Fluoreszenz-Imaging-System alle zwei Tage verwenden.
  5. Am Tag der Bildgebung, wiegen und die Mäuse mit einer Mischung der Anästhetika Ketamin und Medetomidin (75 mg / kg und 1 mg / kg, jeweils), intraperitoneal mit 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht anästhesiert.
  6. Rasieren Sie den Bauchbereich, die Haut zu belichten.
  7. Platzieren Sie Mäuse in der Imaging-Kammer und erwerbenBilder der Blasen, die Software, die mit dem Abbildungssystem verwendet wird.
  8. Revive die Mäuse durch subkutane Injektion einer Umkehrung Medikament (1 mg / kg Atipamezol) bei 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht.

8. Überwachung Tumorwachstum mit Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung

  1. Implantat-Tumoren in Mäusen, wie oben in Abschnitt 4 beschrieben.
  2. Alle zwei Tage Tumorwachstum unter Verwendung von Ultraschall-Bildgebung zu überwachen.
  3. Am Tag der Bildgebung, wiegen und die Mäuse mit einer Mischung der Anästhetika Ketamin und Medetomidin (75 mg / kg und 1 mg / kg, jeweils), intraperitoneal mit 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht anästhesiert.
  4. Rasieren Sie den Bauchbereich, die Haut zu belichten.
  5. Instill 100 ul steriler 0,9% Salzlösung in die Blase mit einer 24-Gauge-IV-Katheter. Die Kochsalzlösung wird die Blase aufblähen und die Sichtbarkeit während der Ultraschall-Bildgebung zu verbessern.
  6. Platzieren Sie die Maus auf dem Ultraschall-Plattform und Anwendung leitendes Gel auf die lower Bauch.
  7. Senken Sie die Handsonde auf die Haut und erwerben B-Modus - Bilder der Blase auf dem Imaging - Plattform 21.
  8. Revive die Mäuse durch subkutane Injektions Umkehrung Medikament (1 mg / kg Atipamezol) bei 0,1 ml pro 10 g Körpergewicht.

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Ergebnisse

PSA Sekretion von MB49-Zellen wurde festgestellt, mit dem Wachstumsmedium zu variieren. MB49-PSA wird in DMEM - Medium gezüchtet , weil dies zu einer erhöhten PSA - Sekretion (1A). Um die Empfindlichkeit des PSA ELISA und Echtzeit-PCR, eine unterschiedliche Anzahl von MB49-PSA-sezernierenden Zellen wurden mit MB49 parentalen Zellen zu bestimmen. PSA ELISA detektiert ein Minimum von 1 x 10 5 PSA-sezernierenden Zellen / 1 x 10 6 Zellen (1B),...

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Diskussion

Die kritischsten Schritte in dem Protokoll sind 1) erfolgreich die Tumorigenität der Zelllinie beibehalten wird; 2) meßbar PSA Sekretion vor Implantation der Tumorzellen in Mäusen zu gewährleisten; 3) Erzeugen einer Einzelzellsuspension zur Implantation, um Variation der Tumorgröße zu verringern; und 4) Einträufeln Zellen mit einer langsamen Geschwindigkeit vesico-ureteral Reflux zu verhindern, was zu einer Implantation der Tumorzellen in der Niere.

Nach längerem Passage in vitro...

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Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Danksagungen

This work was funded by a grant from the National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) awarded to Professor Kesavan Esuvaranathan.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
MB49-PSA cellsN/AN/Aref (Wu QH, 2004)
RPMI 1640 mediaHyCloneSH30027.01 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mediaBiowestL0102
Fetal Bovine Serum (FBS) South AmericanBiowestS1810
Fetal Bovine Serum (FBS) South American, PremiumBiowestS181B
Fetal Bovine Serum (FBS)HyCloneSH30088.03 
L-glutamineBiowestX0550
Penicillin-StreptomycinBiowestL0022
Hygromycin BInvitrogen10687-010
free PSA (Human) ELISA kitAbnovaKA0209
TRIzol Reagent for RNA extraction Ambion15596026
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase InhibitorApplied Biosystems4374967
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
TaqMan Gene Expression Assay – Mouse ActbApplied Biosystems4331182Mm00607939_s1
TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3Applied Biosystems4331182Hs00426859_g1
C57BL/6J female miceIn Vivos4 - 6 wk old
Anesthesia (75 mg/kg Ketamine and 1 mg/kg Medetomidine)Local pharmacy
Reversal drug (1 mg/kg Atipamezole)Local pharmacy
Ear punchElectron Microscopy Sciences72893-01
Hartmann's solution or Compound sodium lactateB Braun
Ophthalmic ointment - Duratears sterile ocular lubricant ointmentAlcon
Heat pack - HotHands handwarmersHeatmax Inc
Introcan Certo IV catheterB Braun425130024 G x 3/4″
Aquagel Lubricating jellyLocal pharmacy
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Quantichrom Creatinine Assay KitBioAssay SystemsDICT-50 
Fluorescent dye - VivoTrack 680Perkin ElmerNEV12000 
RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition SolutionAmbion4427575
NameCompanyCatalog numberComments
Equipment and Software
7500 Realtime PCR SystemApplied Biosystems
7500 Software v2.3Applied Biosystems
Metabolic CageTecniplast Vertical type rack for 12 cages
BD FACSCanto I system BD Biosciences
BD FACSDiva software v7BD Biosciences
IVIS SpectrumCT in vivo imaging system Caliper Life Sciences 
Living Image Software v3.1Caliper Life Sciences 
Vevo 2100 imaging system VisualSonics 

Referenzen

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