Großflächige Rekonstruktionen und Independent, Unvoreingenommene Clustering Basierend auf Morphologische Metriken Klassifizieren Neurons in Selective Populations

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt groß angelegte Rekonstruktion selektiver neuronaler Populationen, etikettiert folgende retrograden Infektion mit einem modifizierten Tollwutvirus Fluoreszenzmarker exprimieren, und unabhängig, unvoreingenommen Clusteranalysen, umfassende Charakterisierung der morphologischen Metriken unter verschiedene neuronale Subklassen ermöglichen.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt groß angelegte Rekonstruktion von Neuronen, die mit der Verwendung von unabhängigen und unvoreingenommenen Clustering kombiniert Analysen einen umfassenden Überblick über die morphologischen Merkmale unter einer selektiven neuronalen Population beobachtet zu schaffen. Die Kombination dieser Techniken stellt einen neuartigen Ansatz für die Sammlung und Analyse von Daten neuroanatomischen. Gemeinsam ermöglichen diese Techniken in großem Maßstab, und damit umfassendere, Probenahme selektiver neuronaler Populationen und unvoreingenommene quantitative Methoden etablieren zur Beschreibung morphologisch eindeutige neuronale Klassen innerhalb einer Population.

Das Protokoll beschreibt die Verwendung von modifizierten Tollwutvirus, selektiv Neuronen etikettieren. G-gelöscht Tollwut-Virus wirkt wie ein retrograden Tracers folgende stereotaktische Injektion in eine Zielgehirnstruktur von Interesse und dient als Vehikel für die Lieferung und die Expression von EGFP in Neuronen. Eine große Anzahl von Neuronen verwenden diese infiziertTechnik und Express GFP während ihrer Dendriten "Golgi-like" vollständige Füllungen von einzelnen Neuronen zu erzeugen. Dementsprechend verbessert sich die Virus-vermittelte retrograden Tracing Verfahren auf traditionelle farbstoffbasierte Rückverfolgungstechniken durch vollständige intrazelluläre Füllungen erzeugen.

Einzelne gut isolierte Neuronen quer durch alle Regionen des Gehirns untersuchten Bereich sind für den Wiederaufbau, um eine repräsentative Stichprobe von Neuronen zu erhalten ausgewählt. Das Protokoll beschreibt Verfahren Zellkörper zu rekonstruieren und dendritischen arborization Muster von markierten Neuronen über mehrere Gewebeschnitte vollenden. Morphologische Daten, einschließlich der Positionen jedes Neuron in der Gehirnstruktur, werden zur weiteren Analyse extrahiert. Standard-Programmierfunktionen wurden verwendet, um unabhängige Cluster Analysen durchzuführen und Cluster-Auswertungen auf Basis von morphologischen Metriken. Um die Nützlichkeit dieser Analysen statistische Auswertung einer Clusteranalyse perfo verifizierenRMED auf 160 Neuronen im Nucleus reticularis des Thalamus (TRN) von Makaken rekonstruiert wurde gemacht. Sowohl die ursprünglichen Cluster-Analyse und die statistischen Auswertungen hier durchgeführt zeigen, dass TRN Neuronen in drei Subpopulationen getrennt werden, jede mit einzigartigen morphologischen Eigenschaften.

Einleitung

Neuroanatomie ist eine der Grundlagen der Neurowissenschaften ¹ und aktuelle Interesse an der "connectomics" Begeisterung für das Verständnis der morphologischen Vielfalt neuronaler Populationen und die Verbindungen zwischen bestimmten Neuronen ² erneuert. Verfahren zur Markierung und Rekonstruktion Neuronen stark mit den jüngsten Innovationen verbessert, einschließlich der genetischen und Virus-vermittelte Schaltung Tracing nähert ^{3, 4} und ermöglicht umfassendere morphologische Untersuchungen neuronaler Populationen ^5. Neben Verbesserungen bei der Markierung einzelner Neuronen wurden quantitative Datenanalysetechniken entstanden auch , dass ermöglichen unabhängige und unvoreingenommene Klassifizierung von Neuronen in verschiedene Subpopulationen basierend auf morphologischen Daten ^{5, 6.} Diese unvoreingenommene Techniken sind eine Verbesserung auf mehr traditional qualitative Klassifikationsverfahren, die den Standard im Bereich gewesen sind seit mehr als einem Jahrhundert. Das Ziel dieser Studie zu skizzieren ist, Schritt-für-Schritt wird die Kombination von virusvermittelten Kennzeichnung von Neuronen in einem selektiven Bevölkerung Groß Rekonstruktionen eines umfassenden Probe dieser Neuronen und quantitative Datenanalyse auf der Grundlage unabhängiger clustering mit statistische Auswertung. Durch die Kombination dieser Methoden beschreiben wir einen neuen Ansatz in Richtung auf die Sammlung und Analyse von Daten neuroanatomischen umfassenden Probenahme und unvoreingenommene Klassifizierung von morphologisch einzigartigen neuronalen Typen innerhalb eines selektiven neuronalen Population zu erleichtern.

Als ein Beispiel dieser Methoden beschreiben wir unsere Analyse einer großen Population von Neuronen innerhalb eines einzelnen Sektors des Nucleus reticularis (TRN) des Makaken-Affen. Diese Daten stammen aus einer früheren Studie ^7. Verfahren zur selektiven Markierung von Neuronen TRN Projizieren auf die dorsale lateral geniculate Thalamuskern (dCGL) chirurgische Injektion von modifizierten Tollwutvirus mit EGFP kodiert , ^{4, 8} (siehe Tabelle spezifischer Materialien / Ausrüstung, Zeile 2) skizziert. Dieses modifizierte Tollwutvirus fehlt das Gen, das ein wesentlicher Hüllprotein kodiert, trans-synaptischen Bewegung des Virus zu eliminieren. Sobald das Virus Axonterminalen an der Injektionsstelle eintritt, wirkt es wie ein herkömmlicher retrograder Tracer mit dem wichtigen Vorteil der Fahr EGFP - Expression während der gesamten dendritischen arborization von infizierten Neuronen ^{5, 9, 10.} Dementsprechend wurde dieser G-gelöscht Tollwutvirus selektiv genutzt werden, um zu infizieren und alle neuronalen Population beschriften der Injektion und retrograden Transport.

Um eine umfassende Analyse eines spezifischen neuronalen Population durchzuführen, ist es wichtig, aus zu probiereneine breite Verteilung von Neuronen in der Bevölkerung. Weil das Virus-vermittelte Markierungstechnik vollständige intrazellulär produziert ", Golgi-like" füllt vieler Neuronen mit Neuriten bei dem Virus Injektionsstelle ist es möglich, eine sehr große Stichprobe von Neuronen innerhalb des vollen Ausmaß einer Hirnstruktur zu rekonstruieren. Darüber hinaus, da das modifizierte Tollwutvirus zu infizieren und Beschriften große Anzahl von Neuronen, so wirksam ist, ist es möglich, Hunderte von Neuronen pro Tier zu rekonstruieren. Verfahren zur Probenahme 160 Neuronen im gesamten visuellen Sektor der TRN ^11, um eine umfassende Stichprobe von dCGL ragende TRN Neuronen zu erzeugen , werden skizziert. Der Prozess einzelnen Neuronen der Rekonstruktion eines Neurons Rekonstruktionssystem mit einem Mikroskop, Kamera und Rekonstruktionssoftware beschrieben. Ebenfalls beschrieben sind Verfahren Positionen einzelner Neuronen innerhalb einer Hirnstruktur (in diesem Fall innerhalb des TRN) zu bestimmen, und der Virusinjektion sit zu überprüfene und ihren Standort innerhalb einer Struktur (in diesem Fall innerhalb der dCGL) Volumenkontur Rekonstruktionen. Schritte morphologischen Daten zu exportieren und unabhängige Cluster Durchführung von Analysen auf Basis von morphologischen Metriken für jedes Neuron gemessen beschrieben werden. Es gibt Einschränkungen Clusterverfahren und es gibt auch eine Vielzahl von verschiedenen Clustering-Algorithmen zur Verfügung. Dementsprechend diese Optionen und die Vorteile einiger der häufiger verwendeten Algorithmen werden beschrieben. Die Clusteranalyse liefert keine statistische Überprüfung der Eindeutigkeit von Clustern. Daher sind zusätzliche Schritte skizziert sowie optimale Clustering, um zu überprüfen, wie die Beziehungen zwischen den morphologischen Daten innerhalb und zwischen den Clustern. Statistische Methoden für die Cluster für die TRN-Datensatz bewerten, die TRN Neuronen zu bestätigen sind in drei einzigartige Cluster basierend auf 10 unabhängige morphologische Metriken beschrieben werden.

Somit wird durch Schritte zum selektiven Kennzeichnung umreißt, Rekonstruktion und morphologischen Daten aus einer bestimmten neuronalen Population zu analysieren, beschreiben wir Methoden für die innerhalb einer Population morphologische Unterschiede zwischen den Neuronen zu quantifizieren. Vor Ergebnisse verschiedener neuronaler Typen innerhalb des visuellen Bereichs des Makaken TRN mit separaten statistischen Auswertungsverfahren bestätigt. Gemeinsam hoffen wir, diese Techniken zu neuroanatomischen Datensätze breit anwendbar sein und dazu beitragen, quantitative Klassifizierung der Vielfalt neuronaler Populationen durch das Gehirn etablieren.

Protokoll

Hinweis: Die in dieser Studie untersuchten Gewebe als Teil einer separaten Studie ⁵ hergestellt. Daher können alle der Versuchsmethoden die Verwendung von Tieren beteiligt sind ausführlich in der Experimental Methods Abschnitt von Briggs et al. (2016). Alle Verfahren mit Tieren als Teil des Standes der Studie wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüsse genehmigt. 2 - Die Schritte zur Injektion des Virus in die dCGL und histologische Verarbeitung von Gehirngewebe werden in den Abschnitten 1 unten kurz beschrieben.

1. stereotaktische Injektion

1. Führen Sie alle chirurgischen Verfahren in einer sterilen Umgebung unter aseptischen Bedingungen. Dampfsterilisieren alle Metall chirurgische Instrumente, Gaze und Abdeckmaterial in Autoklaven. Sterilisieren alle Materialien , die durch Dampf mit chemischen Sterilisation (zB Ethylenoxid) beschädigt werden.
2. Einleitung und Aufrechterhaltung einer Narkose nach tier- und protokoll spezifischen Anforderungen.
   1. Für Virusinjektion in Affen, induzieren Anästhesie mit Ketamin (10 mg / kg) und halten Tiere unter Voll chirurgische Anästhesie mit Isofluran (1 - 3% inhaliert in Sauerstoff) CO - Überwachung abgelaufen _2, EKG, Atemfrequenz und Temperatur kontinuierlich und periodisch überprüft für Kiefer Ton richtige Narkosetiefe zu gewährleisten.
3. Platzieren Tier in einem stereotaktischen Rahmen Kopfposition zu stabilisieren , und die Verwendung von stereotaktischen Koordinaten zu ermöglichen , die Injektions Struktur von Interesse (zB dCGL) zu lokalisieren. Wenn visuelle Antworten zu messen, statt Augentropfen (1% Atropin Augentropfen, wenn Pupillenerweiterung gewünscht wird, sonst Salzaugentropfen) und dann Kontaktlinsen in beiden Augen Trockenheit zu verhindern. Wenn nicht visuelle Reaktionen zu messen, stellen Augensalbe in die Augen.
4. Machen Sie eine Mittellinie Kopfhauteinschnitt und einfahren, die Haut und Muskeln.
5. Nach stereotaktischen Koordinaten für die Struktur von Interesse (dCGL) in einem hemisphere, eine kleine Craniotomie machen.
6. Nach und nach eine Aufzeichnungselektrode zu senken (zB Wolfram oder Platin / Iridium - Elektrode (siehe Tabelle spezifischer Materialien / Ausrüstung, Zeile 3) geklemmt zu einem Mikromanipulator, der manuell positioniert ist) durch die Kraniotomie in das Gehirn. Niedrigere Impedanz (<1 M & OHgr;) und etwas dickere (~ 250 & mgr; m Durchmesser) Elektroden können die Dura eindringen verwendet werden, falls gewünscht.
7. Notieren Sie sich die Manipulatorposition an der kortikalen Oberfläche und an dem Punkt, wo visuelle Antworten gemessen werden. Visuelle Antworten sind hörbar, zeit gesperrt neuronale Reaktionen auf Licht blitzte in den Augen mit einem Ophthalmoskop oder kleine LED / Taschenlampe.
8. Bestimmen Sie den Speicherort und die Dicke des dCGL mit der Feststellung Manipulator Positionen am Anfang, Mitte und Ende der visuellen Antworten und die kortikale Oberfläche Position von diesen Werten subtrahiert wird. Notieren Sie die Tiefen für jede entworfen Injektionsstelle innerhalb des dCGL.
   HINWEIS: Ähnliche procedures kann durch den Einsatz geeigneter Sinnesreize zum Auffinden von nicht-visuellen Strukturen verwendet werden. Zusätzlich gekoppelt Aufzeichnungs- / Einspritzsysteme können auch gezielt kleine Gehirnstrukturen verwendet werden.
9. Sobald die optimale Injektionsstellen festgestellt werden, entfernen Sie die Aufzeichnungselektrode und legen Sie eine Injektionspipette (Glaspipette oder Injektionsspritze) gleichzeitig stereotaxische Position und niedriger auf die entsprechende Tiefe für jede Injektion, mit dem tiefsten Injektionsstelle beginnt und mit dem flachsten fortfahren, mindestens 1 min wartet nach der Injektion vor der Elektrodenposition zu verändern. Glaspipetten mit Außendurchmesser von ~ 50 & mgr; m kann Rückfluss von Virus im Vergleich zu Spritzenspitzen (~ 200 & mgr; m Durchmesser) reduzieren.
10. Unter Verwendung einer Injektionssystem (siehe Tabelle der spezifischen Materialien / Equipmen t, Zeile 4), Picospritzer oder Spritzenpumpe, injizieren kleine Volumina (1 - 5 ul, siehe Anweisungen des Herstellers für Injektionsverfahren) modifizierter Tollwut - Virus über mehrere (3 - 10) Tiefenmit einer Rate von ~ 100 nL / min innerhalb der Zielstruktur (dCGL). Hinweis: Getrennte Injektion Durchdringungen können in größeren Zielstrukturen hergestellt werden (zB Affen dCGL). Passen Gesamtinjektionsvolumen nach Zielstrukturgröße.
11. Pause von mindestens 5 min vor der Injektionspipette zurückgezogen wird. Wenn die Injektionspipette entfernt wird, füllen Sie die Kraniotomie mit Schutzmaterial (Kleber Knochenstück an Ort und Stelle, Knochenwachs oder Gelfoam anwenden), dann die Muskeln Naht und die Haut wieder zusammen.
12. Verabreichen Analgetika (zB Ketoprofen) und Antibiotika vor dem Ende der Operation und zu überwachen Tier kontinuierlich bis Tier ambulanten ist.
13. Für mindestens 3 Tage und bis zu 10 Tage nach der Operation folgen, überwachen Tier täglich Nähte sauber, trocken sind, um sicherzustellen, und intakte und Tier zeigt keine Anzeichen von Schmerzen oder Beschwerden. Verwalten täglich Analgetika und Antibiotika, wie erforderlich. Beginnen Sie den sozialen Wohnungsbau von postoperativen Tier nach Tier vollständig von der Operation erholt hat.

2. Die Gewebe Ernten, Sectioning und Anfärben

1. Erlauben 7 - 14 Tage für retrograden Transport von Viren, einschläfern dann das Tier durch eine Überdosis von Euthanasie - Lösung (zB Euthasol) und perfuse das Tier transcardial mit 0,1 M phosphatgepufferter Salzlösung, 4% Paraformaldehyd, dann 4% Paraformaldehyd mit 10% Saccharose.
2. Entfernen Sie das Gehirn (siehe ¹² für analoge Schritte in einem Nagetier - Modell) und in 20 - 30% Saccharose mit 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer und im Kühlschrank lagern für 1 - 2 Tage.
3. Wenn das Gehirn an den Boden des Behälters abgesunken ist, es zu entfernen , und das Gewebe in Blöcke geschnitten die Gehirnregion mit retrograd markierten Neuronen (zB visual cortex) und die Einspritzzielstruktur (z dCGL) enthält. Schneiden Sie die gleichen Blöcke von Gewebe aus der nicht injizierten Hemisphäre - diese werden als Steuerabschnitte dienen. histologischen Verfahren immediatel Für die besten Ergebnisse beginneny auf frisch geschnittene Gewebe.
4. § Gewebe koronal bei einer Dicke von 50 & mgr; m pro Abschnitt enthält eine Gefriermikrotom (siehe Tabelle spezifischer Materialien / Ausrüstung, Zeile 5).
5. Stain alle Abschnitte für Cytochrom - Oxidase - Aktivität (siehe Tabelle spezifischer Materialien / Ausrüstung, Zeilen 5 bis 8) ¹³ kortikalen Schichten und subkortikalen Strukturen sichtbar zu machen. Hinweis: Abschnitte über Nacht im Kühlschrank in der letzten Spülung werden kann im Anschluss an die Cytochrom-Oxidase-Fleck gespeichert.
6. Beschriften Sie alle Abschnitte mit einem primären Antikörper gegen GFP (1: 1000 Verdünnung, ~ 12 h Inkubation; siehe Tabelle spezifischer Materialien / Ausrüstung, Zeile 9) , gefolgt von einem sekundären Antikörper passend zum primären Host und markiert mit Biotin ⁵ (1: 500 - Verdünnung , 2 - 4 h Inkubation; Tabelle spezifischer Materialien / Ausrüstung sehen, Zeile 10). Es wird empfohlen, Abschnitte in dem sekundären Antikörper über Nacht inkubiert.
7. Label - Abschnitte mit einem Avidin / Biotin - Komplex reagieren dann mit DAB und Peroxid permanent alle markierten Neuronen ⁵ färben.
8. Montieren Sie Abschnitte auf substrierten Glasplättchen und über Nacht trocknen lassen.
9. Defat Abschnitte eine Reihe von Alkohol und Xylol mit Spülungen dann bedecken Schlupf ^14.

3. Neuronale Wiederaufbau

HINWEIS: Alle Rekonstruktionen für Original - Experimente wurden unter Verwendung eines Neurons Rekonstruktionssystem besteht aus einem Mikroskop (siehe Tabelle spezifischer Materialien / Ausrüstung, Zeile 14), angeschlossene Kamera (siehe Tabelle spezifischer Materialien / Ausrüstung, Zeile 13) und Rekonstruktionssoftware Paket (siehe Tabelle spezifischer Materialien / Ausrüstung, Zeilen 11 - 12). Softwaregestützte neuronale Rekonstruktion ermöglicht die Visualisierung von Gewebeschnitten überlagert mit computerbasierten Zeichnungen von neuronalen Prozessen. Wichtig ist, dass die Software digitalisiert morphologische Rekonstruktiontion Daten in drei Dimensionen, so dass die Extraktion von positionsspezifische morphologische Information. Die zugehörige Datenextraktion Programm (Tabelle spezifischer Materialien / Ausrüstung sehen, Zeile 12) ermöglicht die Extraktion von einem umfangreichen Satz von morphologischen Daten von jedem gespeichert Wiederaufbau.

1. Legen Sie eine Folie in der Folienhalter Mikroskop und konzentrieren sich auf einen einzigen Abschnitt von Interesse ein schwach vergrößerndes Objektiv (zB 2X oder 10X). Stellen Sie sicher, dass das Kamerabild durch geeignete Positionierung der Kamera-Auslöser in der Software-Ansicht sichtbar ist.
2. Wählen markierten Neuronen im Gehirn Struktur von Interesse (zB TRN) , die vernünftigerweise isoliert sind, um eindeutig so viel von der dendritischen arborization wie möglich zu rekonstruieren. Bevorzugt Neuronen wählen, ob der Zellenkörper vollständig in einem einzigen Abschnitt ist, um die größte Ausdehnung jeder Zellenkörper und genau abzuschätzen seiner Fläche und Rundheit zu erfassen. Verwenden Sie 10X Mikroskop Zielzelle b zu identifizierenody in Heim Abschnitt.
3. Sobald ein gut gefärbt, gut isolierte Neuron identifiziert wird, fügen Sie den "Home", um die Zellkörper auf den Abschnitt Manager, indem Sie auf "Neuer Abschnitt" Taste enthält. Geben Sie die Anzahl der Abschnitte enthalten (empfohlen 2 - 3 Abschnitte zu beginnen). eine Schnittdicke von 50 & mgr; m Weisen Sie bei Aufforderung (Schritt 2.3 zu sehen).
4. Verfolgen Sie die Konturen der relevanten Hirnstrukturen in der Heimat Abschnitt mit dem Zellkörper. Verwenden des 2X-Ziel / Vergrößerung für Konturverfolgung.
   1. Zuerst wählen Sie "Kontur" aus dem Drop-Down - Menü auf der oberen Symbolleiste und wählen Sie dann die Kontur Typ aus dem Dropdown-Menü (zB "LGN" oder "TRN").
   2. Trace Konturen der Zielstruktur (zB TRN) sowie benachbarte Strukturen, falls gewünscht, indem Sie auf Punkte entlang der Kontur Anklicken mit der Maus als Ziehwerkzeug.
   3. Wählen Sie "Close Contour" mit der rechten Maustaste darauf klicken und die Auswahl dieser Optionaus dem Menü jede erfasste Kontur zu vervollständigen und umschließen.
5. Legen Sie eine Markierung in der Mitte der Zielstruktur, indem Sie auf der rechten Symbolleiste auf das gewünschte Markersymbol klicken und dann auf die gewünschte Stelle in der Rekonstruktion Klick auf den Marker an dieser Stelle zu platzieren. Verwenden den gleichen Typ von Markierung, um die Mitte der Zielstruktur in allen Rekonstruktionen zu markieren.
6. Sobald die Konturen abgeschlossen sind, verfolgen Sie die Kontur der Körperzelle unter Verwendung von 40 - 60X Ziele / Vergrößerung. Dazu wählen Sie zunächst "Neuron" aus dem Drop-Down-Menü auf der oberen Symbolleiste und wählen Sie dann das Neuron Struktur zu verfolgen, in diesem Fall "Zell Body". Spuren Weiter, um den Zellkörper wie in 3.4.
7. Setzen Sie einen anderen Stil Marker in der Mitte des Zellkörpers, im Anschluss an die Schritte, die in 3.5.
8. Verfolgen Sie alle Dendriten an der Zellkörper beginnt.
   1. Wählen Sie zuerst "Dendrite" aus dem Drop-Down-Menü. Dann verfolgen jedes Dendriten an der Zelle bod Starty und die Maus als Ziehwerkzeug. Achten Sie darauf, die Z-Tiefe in der gesamten Verfolgung einzustellen genau den Winkel und die Richtung des Dendriten zu erfassen.
   2. Legen Sie einen Knoten an jedem Verzweigungspunkt entlang der Dendriten durch mit der rechten Maustaste klicken und "gegabelt Knoten" oder "Trifurcating Knoten" aus dem Drop-down-Menü auswählen. Verwenden Sie 40 - 60X Ziel / Vergrößerung für alle Dendriten Rekonstruktionen.
   3. Am Ende jedes Dendriten der rechten Maustaste klicken und wählen Sie "Beenden" aus dem Drop-Down-Menü.
9. Identifizieren dendritischen Endungen, die in den benachbarten Abschnitt wahrscheinlich fortsetzen und bringen diese in den Fokus bei der entsprechenden z-Tiefe im Mikroskopbild. Fügen Sie den wichtigsten Sehenswürdigkeiten in der Nähe, wie Blutgefäße oder leicht erkennbar Dendriten Muster oder Bündel im Mikroskopbild.
   1. Reduzieren Sie die Vergrößerung zu 20X oder 10X auf dem Mikroskop (wählen Sie die Vergrößerung, die größte Wahrzeichen Visualisierung erlaubt), und nehmen Sieein Bild des Bild Mikroskop eine Digitalkamera (zB Handy, Tablet) Hand auf dem Computer - Bildschirm verwendet wird .
10. Bewegen Sie zum benachbarten Abschnitt auf der Folie und zeichnen die Konturen des zuvor verfolgt Abschnitt mit den Grenzen des dCGL und TRN in dem neuen Abschnitt auf.
11. Bringen Sie das Sichtfeld auf den allgemeinen Bereich des Zellkörpers (basierend auf Konturen und den wichtigsten Sehenswürdigkeiten) und bringen Sie die Vergrößerung wieder bis zu 10 - 20X.
12. Verwenden Sie das Foto der Dendriten Endungen von dem zuvor verfolgt Abschnitt bei der Ausrichtung der Enden mit den Anfängen der Dendriten in dem neuen Abschnitt zu unterstützen.
    1. Um die Verfolgung zu drehen und verschieben Sie sie Dendriten auszurichten, verwenden Sie den Pfeil-Werkzeug, den Wiederaufbau zu wählen, der rechten Maustaste und wählen Sie "Move" aus dem Drop-Down-Menü.
    2. Alternativ können Sie die "Match" Werkzeug dendritische Endungen Anfänge zu entsprechen. Wählen Sie das Spiel Werkzeug aus der oberen Symbolleiste und wenn Sie dazu aufgefordert, klicken Sie auf das Endein den Wiederaufbau und die entsprechende Fortsetzung Punkt im Bild. Wiederholen Sie dies für 3 oder mehr Endungen.
13. Nachdem die Verfolgung aus dem vorherigen Abschnitt wird mit den Dendriten in dem neuen Abschnitt aufgereiht, stellen sicher, dass die entsprechenden neuen Abschnitt im Abschnitt Manager ausgewählt ist, indem Sie auf den aktuellen Abschnitt klicken. Oder einen neuen Abschnitt zu Abschnitt Manager hinzufügen, wie in 3.3 oben beschrieben, die Anpassung der z-Tiefe und Position eines jeden neuen Abschnitt in Bezug auf die Heimat Abschnitt entsprechend Vorgang und wenn die Schnittdicke bis 50 mm (siehe Schritt 2.3).
14. Erhöhen Sie die Vergrößerung auf 40 - 60X und verfolgen die Dendriten Fortsetzungen durch einen Rechtsklick mit der Maus auf das Ende des Dendriten aus den Wiederaufbau und die Auswahl von "In den Ending" aus dem Drop-down-Menü, dann die Dendriten Tracing die Maus als mit ziehen Werkzeug. Folgen Sie prompt angeben, ob die Fortsetzung im neuen Abschnitt ist.
15. Folgen Dendriten durch mindestens drei benachbarte Abschnitte (eine auf jeder Seitedie Heimat Abschnitt) folgende Schritte 3,8-3,15. In der Rekonstruktion bis mindestens 3 insgesamt Abschnitte für das Neuron zurückgeführt, oder bis die Dendriten nicht mehr verfolgt werden kann oder gefunden. Verfolgen Sie Konturen in benachbarten Abschnitten im Anschluss an die oben genannten Schritte, falls gewünscht.

4. Unabhängige Clustering

Hinweis: Unabhängige Clusteranalysen unvoreingenommene Analysen von großen, mehrdimensionalen Datensätzen ermöglichen, die sonst schwierig sein könnte, zu visualisieren und, was wichtig ist, bieten eine quantitative Bewertung der morphologischen Vielfalt. Eine matrixbasierte Programmierplattform ist sehr nützlich für die Analyse der mehrdimensionalen Datensätzen und ermöglicht ausgeklügelte Datenmanipulationen und statistische Analysen. Die aufgeführten Funktionen in den Schritten 4 - 6 in der Programmier - Plattform in der Tabelle der spezifische Materialien / Geräte aufgelistet definiert sind, Zeile 15.

1. Extrahieren Sie morphologischen Daten von jedem einzelnen neuronalen Rekonstruktion unter Verwendung eines extraction Programm mit dem Neuron Rekonstruktionssystem verbunden sind (siehe Tabelle spezifischer Materialien / Ausrüstung, Zeilen 11 - 12).
   1. Wählen Sie zuerst die morphologischen Daten für jede Rekonstruktion gewünscht , einschließlich: Konturinformation, Markierungsinformation, morphologische Daten der Zellkörper und dendritischen arborization usw.
   2. Aus dem Edit-Drop-Down-Menü in der oberen Werkzeugleiste, wählen Sie "Alle Objekte auswählen". Wählen Sie dann "Verzweigte Strukturanalyse" aus der Analyse Dropdown-Menü in der oberen Symbolleiste und klicken Sie auf den einzelnen Registerkarten und wählen Sie die gewünschten Analysemöglichkeiten in den einzelnen Registerkarten.
   3. Extrahieren Sie alle gewünschten Daten, die durch die Schaltfläche "OK" im Analysefenster anklicken und in ein Tabellenkalkulationsformat, das von der rechten Maustaste auf den Ausgabefenster und wählen Sie "Export in Excel" zu speichern.
2. Erstellen Sie eine Master - Tabelle (siehe Tabelle spezifischer Materialien / Ausrüstung, Zeile 16) , in der jede morphologische Variable / metrischen wird durch einen einzigen numerischen Beobachtungs pro Neuron dargestellt. In diesem Master-Kalkulationstabelle, halten eine Aufzeichnung der Zeilenkennung für jedes Neuron.
3. Stellen Sie sicher , dass alle Variablen in der Clusteranalyse enthalten (zB morphologische metrics) sind voneinander unabhängig. Zum Beispiel wird die Anzahl der Knoten mit der Anzahl der Verzweigungen in einem dendritischen oder axonale arborization korrelieren. Dementsprechend sollte nur eine dieser beiden Variablen in einer Cluster-Analyse einbezogen werden.
4. Machen Sie jede Messung sicher für jede Variable eine Beobachtung enthält, dh jedes Neuron (Messung), muss ein Datenpunkt (Beobachtung) entsprechend jeder morphologischen Metrik (Variable). Wenn Beobachtungen für eine bestimmte Variable (beispielsweise Axonlänge) für eine Untergruppe von Neuronen fehlen, diese Variable (Axon Länge) kann nicht in der Cluster-Analyse einbezogen werden.
5. Verwalten Sie die Daten auf dem Master-Kalkulationstabelle in eine einzige Matrix, in der jede Zeile ein Neuron und eac darstellth Spalte enthält numerische Daten für jede morphologische Metrik (Abbildung 1). Beispielsweise ein Datensatz einschließlich 100 Neuronen, für die es Beobachtungen für 5 unabhängige Variablen würden von einer 100 x 5 (Zeile-für-Spalte) Matrix dargestellt werden. Es ist nicht notwendig, jede Identifizierung für jedes Neuron in der Matrix enthalten - der Zeilenindex als jedes Neuron der eindeutigen Identifikator dient. Es sollte auch keine Lücken oder "NaN" s in der Matrix sein. Speichern Sie die Matrix als eine einzelne Variable (zB Daten = [100 x 5 Matrix], siehe Ergänzenden Code für Beispielcode - Datei).
6. Wähle einen Algorithmus zur Berechnung Abstände zwischen Punkten, die einzelne Neuronen in einem n-dimensionalen Raum, wobei n durch die Anzahl von Variablen definiert ist. Die 'pdist' Funktion ermöglicht Flexibilität zwischen Neuronen Entfernungen zu berechnen. Die Standard-Abstandsberechnung ist die euklidische Distanz und hat zuvor für ähnliche Analysen der neuronalen morphologica verwendet wordenl Daten ^{5, 6.}
7. Mit dem zwischen-Neuron-Ausgabe des 'pdist' Funktion distanziert, verwenden Sie die "Verknüpfung" Funktionscluster zu bilden. Auch hier sind mehrere clustering Optionen zur Verfügung. Ward-Verfahren und Schwerpunktabstand haben ergaben ähnliche Ergebnisse in Analysen von morphologischen Datensätze ^{5, 6.}
8. Falls gewünscht, verwenden Sie die Funktion 'KMeans' als Alternative Clustering Ansatz zu "pdist" und "Verknüpfung" Funktionen. 'KMeans' beschäftigt euklidischen Abstand zu berechnen zwischen Neuronen Abstände quadriert und dann Schwerpunktabstand Cluster zugeordnet werden.
9. Um eine hierarchische Clusterbaum sichtbar zu machen, verwenden Sie die 'dendrogram' Funktion am Ausgang des "Verknüpfung" Betrieb. Diese Funktion hat eine Standardeinstellung, die Visualisierung zu 30 Messungen begrenzt, aber es kann durch Angabe der Anzahl der Messungen überschrieben werden ( zB Neuronen) angezeigt. Das Dendrogramm zeigt die Kopplungsabstände auf der y-Achse für jedes der Neuronen durch ihre Zeilenindex auf der x-Achse identifiziert.
   HINWEIS: Die Ausgänge der "Verknüpfung" und "dendrogram 'definieren nicht die optimale Anzahl von Clustern. Der Ausgang von 'KMeans' nicht zuordnen Messungen zu Clustern, aber es nicht testen, ob diese Cluster optimal sind. Separate statistische Vergleiche und die Überprüfung der optimalen Clustering können (siehe unten) durchgeführt werden.

5. Prüfung der Clustering

Anmerkung: Wie oben erwähnt, sich die Cluster-Analyse nicht direkt eine statistische Einschätzung, ob die Cluster in der Cluster-Dendrogramm dargestellt sind einzigartig und repräsentativ für die Probe. Methoden für die Cluster aus der dendrogram Überprüfung haben ¹⁵ vorgeschlagen worden, aber diese bieten keine statistische Kontrolle der optimalen Clustering. Es gibt MehrB. Methoden zur optimalen Clustering zu überprüfen.

1. Methode 1: Auswertung Clustering:
   1. Verwenden Sie die 'evalclusters' Funktion die Methode Angabe für die Berechnung der Cluster verwendet werden, wie 'KMeans "oder" Verknüpfung ". Ein Gaussian Mixture Model Ausgang kann auch ausgewertet werden (siehe Schritt 5.2 unten, siehe Ergänzenden Code für Beispielcode - Datei).
   2. Geben Sie das Bewertungskriterium aus einer Reihe von Optionen (zB 'CalinskiHarabasz' - für Beschreibungen von Kriterium - Optionen finden Sie im Menü Hilfe die Suche nach "evalclusters").
   3. Geben Sie einen Bereich der optimalen Clusternummern zu testen (zB [1: 6] zu testen , ob 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 - Cluster optimal sind).
      Anmerkung: Die Ausgabe von 'evalclusters' ist eine optimale Anzahl von Clustern, die Clustering-Algorithmus und Kriteriums festgelegt.
2. Methode 2: Gaussian Mixture Model Clustering:
   HINWEIS: Gaussian Mixture Model Clustering algorithms (GVM) gehen davon aus, dass Beobachtungen für jede Variable aus einer Mischung von Gaußschen Verteilungen kommen jedes vermeintliche Cluster definieren, jede mit ihren eigenen Mittelwert und Kovarianz. Die GMM verwendet dann einen Erwartungsmaximierungsalgorithmus zu posterior Wahrscheinlichkeiten jeder Messung zuordnen, was die Wahrscheinlichkeit von ¹⁶ zu einem bestimmten Cluster gehören.
   1. Implementieren Sie eine GMM die "fitgmdist" Funktion durch die mutmaßliche Anzahl von Clustern zu beobachten in den Daten eingegeben werden. Alternativ a priori Zuordnung der Anzahl der Cluster, verwenden Hauptkomponentenanalyse (PCA) mit einer Reihe von verschiedenen optimalen Clusternummern zu vermeiden , dass die hier beschriebenen Schritte (siehe Ergänzenden Code für Beispielcode - Datei).
   2. Verwenden Sie die "PKA" -Funktion auf der ursprünglichen Datenmatrix und speichern Sie die Hauptkomponentenwerte als Ausgang.
   3. In einer Schleife beginnend bei 1 und gehen durch eine bestimmte Anzahl von mutmaßlichen optimalen Cluster verwenden the 'fitgmdist' Funktion auf den Hauptbestandteilswerte und erzeugen GVM für jede Anzahl von mutmaßlichen optimalen Cluster.
   4. Beurteilen Sie jede GMM durch die negative Log-Likelihood-Prüfung Kriterium Akaike Information und Informationskriterium Bayes. Die GMM mit den niedrigsten Kriterien optimal.
   5. Falls gewünscht, testen, ob die Mittelwerte für jeden Cluster signifikant verschieden sind, wenn die Anzahl der Cluster optimal ist (Mittel jedes Clusters in der "mu" Ausgang jedes GMM gespeichert).

6. Statistische Analysen von Clustered Daten

1. Sobald die optimale Anzahl von Clustern mit hierarchischen Clustering und ausgewertet bestimmt wird, kehren Sie zu den ursprünglichen Daten, getrennte Neuronen in Cluster und bestimmen, welche morphologischen Metriken zur Häufung von Neuronen in einzigartige Klassen beitragen.
2. Sortieren Sie die ursprünglichen morphologischen Metrikdaten, so dass Neuronen nach Cluster-Zuordnung gruppiert sind.
3. Um zu untersuchen, Beziehungen zwischen den morphologischen Daten in Neuronen (für alle Neuronen oder für Neuronen in Cluster getrennt), führen lineare Regression passt zu 2- und 3-Wege-Vergleiche von morphologischen Metrik Beobachtungen. Diese Anfälle können abgeschätzt werden unter Verwendung des "fit" Funktion und ausgewertet mit dem 'fitlm' Funktion , bei der Güte der Anpassung Ausgänge umfassen R ² und p - Werte für die Regression passt.
4. Um die statistischen Beziehungen zwischen den Neuronen in jedem Cluster, verwenden nicht-parametrischer zwei Stichproben (Wilcoxon-Rangsummentest) oder Mehrfachprobenvergleiche Tests (ANOVA), abhängig von der Anzahl der Cluster untersuchen. Wichtig ist, gewährleistet die Verwendung von mehreren Abtastwerten ANOVAs daß p-Werte für multiple Vergleiche korrigiert werden.

Ergebnisse

Wir haben zuvor gezeigt , dass große Rekonstruktionen von Neuronen in einem selektiven Population ist durchführbar nach der Injektion von modifizierten Tollwutvirus in den dCGL ^5. Vor kurzem wurde das gleiche Gewebe 160 Neuronen im visuellen Bereich des TRN zu rekonstruieren verwendet (Bragg et al, Revue;. 2A-B) nach den detaillierten Verfahrensschritte oben beschrieben wurde . In der TRN-Studie, drei einzigartige Cluster von TRN Neuronen wurden auf...

Diskussion

Neuroanatomische Studien haben eine Säule der Neurowissenschaft und aktuelle Interesse an connectomics und Struktur-Funktionsbeziehungen blieb die Begeisterung für detaillierte morphologische Charakterisierung von selektiven neuronalen Populationen erneuert. Traditionell haben die neuroanatomische Studien über qualitative Einstufungen von Neuronen in morphologisch unterschiedliche Klassen von Neuronen, die durch Experten Neuroanatomen definiert verlassen. Mit den Fortschritten in den Techniken für Neuronen zu rekons...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
SADΔG-EGFP	E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute		Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core
Recording electrode: platinum/iridium or tungsten	FHC	UEPSGGSE1N2M	Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications
Nanoject II	Drummod Scientific	3-000-204, 110V	Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe
Freezing microtome	Thermo Scientific
DAB	Sigma Aldrich	D5905-50TAB	3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen - must be bleached before discarding
Cytochrome C	Sigma Aldrich	C2037-100MG
Catalase	Sigma-Aldich	C9322-5G
Rabbit anti-GFP	Life Technologies/Thermo Fisher	#A-11122	Primary antibody
Biotinylated goat anti-rabbit	Vector Laboratories	#BA-1000	Secondary antibody
Neurolucida System	MicroBrightField		Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida
Neurolucida Explorer	MicroBrightField		Data export software
Microfire Camera	Optronics		2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf
Nikon E800 Microscope	Nikon Instruments Inc.		Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html
Matlab	The MathWorks Inc.		Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com
Microsoft Office Excel	Microsoft		Spreadsheet program