Die Bestimmung Glucose Metabolism Kinetics Verwendung<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG Micro-PET / CT

Zusammenfassung

This study describes a protocol that uses ¹⁸F-FDG and positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) imaging, together with kinetic modelling, to quantify the in vivo, real-time uptake of ¹⁸F-FDG into tissues.

Zusammenfassung

This paper describes the use of ¹⁸F-FDG and micro-PET/CT imaging to determine in vivo glucose metabolism kinetics in mice (and is transferable to rats). Impaired uptake and metabolism of glucose in multiple organ systems due to insulin resistance is a hallmark of type 2 diabetes. The ability of this technique to extract an image-derived input function from the vena cava using an iterative deconvolution method eliminates the requirement of the collection of arterial blood samples. Fitting of tissue and vena cava time activity curves to a two-tissue, three compartment model permits the estimation of kinetic micro-parameters related to the ¹⁸F-FDG uptake from the plasma to the intracellular space, the rate of transport from intracellular space to plasma and the rate of ¹⁸F-FDG phosphorylation. This methodology allows for multiple measures of glucose uptake and metabolism kinetics in the context of longitudinal studies and also provides insights into the efficacy of therapeutic interventions.

Einleitung

Der Zweck dieser Studie war es, eine Positronen - Emissions - Tomographie / Computertomographie (PET / CT) basierend Methodik zu entwickeln , die in - vivo - Echtzeit - Aufnahme von Glucose aus dem Blutstrom in spezifische Gewebe in Mäusen zu quantifizieren. Dies wurde unter Verwendung erreicht ¹⁸ F-markierten fluorodeoxyglucose (FDG) Glukoseaufnahme und kinetische Modellierung zur Messung der Raten von ¹⁸ F-FDG - Aufnahme aus dem Plasma zu dem intrazellulären Raum zu schätzen, die Geschwindigkeit des Transports von intrazellulären Raum zu Plasma und die Rate der ¹⁸ F-FDG - Phosphorylierung.

Bei Nagetieren ^18F-FDG ist in der präklinischen Bewertung zahlreicher Krebstherapien ^1, Studien der Tumorprogression ² und Tumor - Stoffwechsel ³ sowie Abbildung von braunen Fettdepots ^4, neuroinflamation ⁵ und dem Stoffwechsel im Gehirn ⁶ verwendet .

Traditionelle Methoden verwendet , um die Gewebe - spezifische Aufnahme von Glucose in Mäusen zu untersuchen (und Ratten) In der Regel beinhaltet die Behandlung mit 2-Desoxyglucose radiomarkiert mit entweder ³ H oder ¹⁴ C , gefolgt von Euthanasie, Gewebeentnahme und Messung der Radioaktivität in jedem Gewebe ^7. Die Verwendung von PET / CT ermöglicht eine nicht-invasive Bestimmung der Glukoseaufnahme und Stoffwechsel in mehreren Organen und Regionen gleichzeitig in lebenden Tieren. Zusätzlich ist, wie Euthanasie nicht erforderlich ist, ist diese Technik für den Einsatz in Langzeitstudien geeignet.

Typ 2 Diabetes mellitus (T2DM) durch gestörte Glukosestoffwechsel und Hyperglykämie sekundär zu reduzierte Gewebe Ansprechbarkeit auf Insulin (Insulinresistenz) und die Unfähigkeit von pankreatischen -Cells gekennzeichnet ausreichenden Mengen von ⁸ Insulin zu produzieren. Die kinetische Analyse der Glukoseaufnahme und Stoffwechsel kann wichtige Einblicke inder Mechanismus der Wirkung und Wirksamkeit von therapeutischen Interventionen sowie für erweiterte Überwachung des Krankheitsverlaufs ermöglichen.

Protokoll

Alle in dieser Studie beschriebenen Verfahren wurden von dem Sydney Local Health District und University of Sydney Tierethikkomitees und folgten den NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, Achte Auflage (2011) genehmigt.

1. Vorbereitung der Tiere

HINWEIS: In diesem Protokoll männlichen db / db - Mäuse (BKS.Cg- Dock7 ^m + / + Lepr ^db / J) wurden in Gruppenhaltung mit ad libitum Zugang zu Futter und Wasser bis zum Alter von 6 Wochen gehalten. Zum Zeitpunkt der Bildgebung, Mäuse gewogen ~ 30 g. Alle Mäuse in diesem Protokoll verwendet hatten Nüchternblutzuckerspiegel zwischen 10 und 14 mmol / L.

1. Bei Bedarf schnell die Mäuse. In dem vorliegenden Beispiel schnell die Mäuse für 5 Stunden vor dem experimentellen Verfahren.
2. Behandlung von Mäusen mit dem gewünschten Wirkstoffe (zB Medikament, Protein, Peptid) vor dem Beginn der Bilderzeugung. In diesem Beispiel verabreicht eine subkutane Injektion von Insulin (3U / kg Humaninsulin) oder äquivalente Volumen PBS 30 min vor dem Beginn der Bildgebung.

2. Richten Sie Workflows

Hinweis: Dieses Protokoll auf einem PET / CT-Scanner durchgeführt wurde. Erwerben PET-Daten zunächst durch Akquisition von CT-Daten gefolgt.

1. PET - Einstellungen:
   1. Select - Isotop wie ¹⁸ F, eingestellte Scandauer bis 3.600 s, und die obere und untere Ebene Energiediskriminierung bis 350 keV - 650 keV (default) mit einem Koinzidenzzeitfenster von 3,432 ns (Standard). Histogram list-Modus-Daten in 16 Rahmen (6 x 10 s, 4 x 60 s, 1 x 300 s, 5 x 600 s) für den Zeitraum 0-60 min nach Tracerinjektion. Rekonstruieren Emission Sinogramme mit Hilfe von 2D-FBP mit einem Zoom-1.5.
      HINWEIS: Die rekonstruierten Bilder bestanden aus 16 dynamischen Rahmen, die jeweils mit 128 × 128 × 159 Voxel und eine Voxel - Größe von 0,52 × 0,52 × 0,796 mm ^3.
2. CT - Einstellungen:
   1. Zumeine Ganzkörper-CT-Scan, stellte den Strom bei 500 A, Spannung bei 50 kV, Belichtungszeit von 500 ms und 200 Projektionen über eine Umdrehung 360. Stellen Sie das Detektorsichtfeld (FOV) zu 30.722.048, Anzahl der Bettpositionen bis 3 (zur Deckung volle PET FoV Bereichs), Überlappung zwischen Bettpositionen = 30,234713% und Detektor Binning bis 4.
      HINWEIS: CT-Rekonstruktion wurde mit Kegelstrahl-Tomographie-Bildrekonstruktionssoftware mit HU-Kalibrierung, bilinearer Interpolation und Shepp-Logan-Filter durchgeführt.
3. ¹⁸ F-FDG:
   1. Um ein ausreichenden ¹⁸ F-FDG (zum Beispiel 450 MBq in 0,5 ml) von einem lokalen Provider ankommen ~ 30 min vor der ersten Injektion. Aliquot und verdünnt den ¹⁸ F-FDG so dass Tiere erhalten ~ 10 MBq von ¹⁸ F-FDG in einem Endvolumen von 0,1 ml.

3. Imaging Protocol

1. Abwischen Induktionskammer und Aufnahmebett mit 80% (v / v) Ethanol aseptische Bedingungen aufrechtzuerhalten. PlaCE, um die Maus in einer Ansaugkammer und anästhesieren mit 5% Isofluran in Sauerstoff.
2. Platzieren Sie die Maus auf ein Aufnahmebett mit einem elektrischen Heizkissen angebracht auf Körpertemperatur und einen Präzisions Verdampfer Bugkonus zu halten liefern Isofluran (Wartung, 1,5 bis 2%) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 l / min. Bewerben Augensalbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
3. Bewegen Sie die Maus in Bauchlage auf einem Sensorfeld, um die Atmung zu überwachen und sicherzustellen, dass eine angemessene Ebene der Narkose gehalten wird.
4. Erwärmen Sie den Schwanz unter Verwendung einer Wärmepackung für 1 bis 2 min, um die laterale Schwanzvene aufzuweiten. Katheterisieren die laterale Schwanzvene eine 30-Gauge-Nadel in die laterale Schwanzvene durch Einfügen. Sichern die Nadel an Ort und Stelle mit chirurgischem Klebstoff und den Katheter sichern.
5. Last Bildgebung in die Scanner-Bett und das Bett durch die Maschine bewegen, so dass der Katheter von der Rückseite der Maschine zugegriffen werden kann.
6. Befestigen des Katheters an der ¹⁸ F-FDG Spritze in einer SYRinge Fahrer. Berechnen die genaue ¹⁸ F-FDG - Dosis (10 MBq) , basierend auf der Aktivität in der Spritze vor der Injektion und das Volumen verabreicht werden (<100 ul, injizierte über 10 s).
7. Um die Auswirkungen der Narkose auf der Variabilität der Glukoseaufnahme zu minimieren, um eine konstante Zeit zwischen der Einleitung der Narkose und der Injektion von ¹⁸ F-FDG (zB 30 min) sicherzustellen.
8. Commence die PET - Scan unmittelbar vor der Injektion von ¹⁸ F-FDG. Nach Abschluss des PET-Scan (3,600 s), einen CT-Scan (~ 10 min) durchführen für die Co-Registrierung von Radiotracer-Aufnahme mit Geweben zu ermöglichen.
9. Bewegen des Aufnahmebetts in die Ausgangsposition, entfernen Sie das Tier aus dem Bett.
10. An diesem Punkt das Tier einschläfern oder lassen Sie es sich erholen:
    1. Für Euthanasie, Genickbruch, während noch unter Narkose durchführt und Organe von Interesse für eine spätere Analyse sammeln.
    2. Wenn so dass die Maus zu erholen, legen Sie die Maus in einzelnen Gehäusen auf einem Heizkissen odervor einer Heizlampe. Überwachen Sie die Maus, bis es genügend Bewusstsein wiedererlangt Brustlage zu halten. Lassen Sie die Maus für 1 h erholen, bevor auf Gruppenhaltung zurück.

4. PET Bildverarbeitung

HINWEIS: Die Bildrekonstruktion wurde mit Erwerb Arbeitsplatzsoftware v1.5.0.28 und Analyse in der Forschung am Arbeitsplatz Software v4.2 durchgeführt.

1. Co-Register Bilder CT und PET und stellen Sie sicher, dass die Ausrichtung in allen drei Dimensionen korrekt ist.
   1. Im Menü ‚Datei‘, wählen Sie ‚Ordnersuche / Import‘ und wählen Sie den Ordner mit den Daten enthalten. Wählen Sie die gewünschten PET und CT-Daten ein und klicken Sie auf den ‚General Analysis‘ Tab.
   2. Sortieren Sie die Daten, so dass die CR bezeichnet ist ‚Quelle‘ und PET bezeichnet ‚Ziel‘. Im Menü ‚Arbeitsablauf‘, wählen Sie ‚Registrierung‘. Wenn die Bilder angepasst werden müssen richtig zusammen registriert, verwenden Sie die Werkzeuge in th seine 'Registration' Menü.
2. Im Menü ‚Arbeitsablauf‘, wählen Sie ‚ROI Quantifizierung‘.
   1. Verwenden Sie die ‚Pan‘ und ‚Zoom‘ Funktionen in der Registerkarte ‚Bild‘ die gewünschte Region zu suchen. Im Menü ‚Extras‘, wählen Sie die ‚Erstellen‘ Registerkarte und klicken Sie auf das Pinsel-Symbol. Zeichnen Sie den ROI auf das Bild
3. Extrahieren Zeitaktivitätskurven von ‚Save ROI Quantifizierung‘ von den ‚Speichern‘ Menü auswählen. Speichern Sie die Daten als CSV-Datei.
4. Quantifizieren Radioaktivität Aufnahme als Bq pro cm ³ des Gewebes. Konvertieren Werte in Prozent der injizierten Dosis pro cm ³ (% ID / cm ³⁾ durch die CSV in eine Tabellenkalkulationsdatei lädt.

5. Eingangsfunktion

1. Um für das System Punktverwaschungsfunktion zu korrigieren, entfalten die geschätzte PSF System für 5 Iterationen die reblurred Van Cittert Entfaltungsverfahren unter Verwendung von wie zuvor ⁹ beschrieben.
   HINWEIS: Dies aufgrund der geringen Größe der Hohlvene in einer Maus erforderlich ist.
2. Verwenden Post Dekonvolution Bilder eine Bluteingangsfunktion zeitAktivitätsKurve zu erzeugen, wie oben beschrieben.

6. Kinetic Modeling

HINWEIS: Das FDG Zwei Gewebekompartiment Modell (1) erfordert die Plasmaeingangsfunktion.

1. Konvertieren der Bluteingangsfunktion in der CSV - Datei an die Plasmaeingangsfunktion unter Verwendung der folgenden Gleichung ^10: Input_plasma = Input_blood × (0,386 e ^{- 0.191t} + 1,165).
2. Bei dem kinetischen Modellierungstool klicken Sie auf die ‚Kinetic‘ klicken. Importieren Sie das Gewebe und Plasma-Gesamtaktivität zählen CSV-Dateien in das kinetische Modellierungswerkzeug von ‚Load Time Activity Curve‘ aus dem ‚Menü‘ auswählen.
3. Im ‚Model‘ Menü 2 Gewebekompartimenten wählen. Stellen Sie sicher, dass das Kästchen neben k4 nicht ausgewählt istund gibt einen Wert von 0. Für Erstmontage, deaktivieren die Box für vB (Blutvolumenanteil), und einen Wert von 2% ein.
4. Klicken Sie auf die "Fit aktuelle Region. Korrigieren der extrahierten interessierenden Bereich für die Dispersion ^{11, 12.} Sie erreichen dies durch den Chi-Quadrat-Wert für das FDG-Modell für verschiedene Dispersionszeiten zu minimieren.
5. Durchführen einer zweiten schwimmenden Sitz vB Wert mit (Kontrollkästchen neben dem Feld für vb) und den optimierten Dispersionswert der regionalen Geschwindigkeitskonstanten (k ₁ -k ₃₎ zu berechnen. Berechne den regionalen Zufluß konstant wie K _i = (k ₁ x k ₃₎ / (k ₂ + k _3).

Ergebnisse

Wir haben zuvor mithilfe der db / db - Maus - Modell die Auswirkungen der Erhöhung der Plasma - Apo-A-I - Spiegel auf die Kinetik der Glukoseaufnahme und Stoffwechsel ¹³ zu untersuchen. In dieser Studie verwenden wir db / db - Mäuse , die mit Insulin behandelt , um die Nützlichkeit von PET / CT - Bildgebung zu zeigen , die Aufnahme von ¹⁸ F-FDG aus dem Plasma in den Gastrocnemius - Muskel in Echtzeit zu überwachen.

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll stellt eine robuste, nicht-invasive Methode, die Kinetik der Glukoseaufnahme aus dem Blut in dem Gewebe und anschließenden Metabolismus bei Mäusen zu bestimmen.

Die db / db - Maus ist ein ist ein etabliertes Tiermodell von Diabetes Typ 2 , die ¹⁴ extensiv Insulinresistenz und entsprechende Eingriffe verwendet worden ist , zu untersuchen. Allerdings haben frühere Studien nur Endpunkt Aufnahme im Herzen quantifizierten

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PET/CT Scanner	Siemens	Inveon
18F-FDG	PETNET Solutions
Isoflurane	Pharmachem
30 guage needle	BD	305106
PMOD modelling software	PMOD Technologies
BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J mice	Jackson Laboratory	000642
Human insulin	Sigma-Aldrich