Einzelzell-RNA-Seq von definierten Subsets von Retinal-Ganglion-Zellen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir einen kombinatorischen Ansatz zur Klassifizierung von neuronalen Zelltypen vor der Isolierung und für die anschließende Charakterisierung von einzelligen Transkriptomen. Dieses Protokoll optimiert die Probenvorbereitung für eine erfolgreiche RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) und beschreibt eine Methodik, die speziell für das verbesserte Verständnis der zellulären Vielfalt entwickelt wurde.

Zusammenfassung

Die Entdeckung von zelltypspezifischen Markern kann Einblicke in die zelluläre Funktion und die Ursprünge der zellulären Heterogenität geben. Mit einem jüngsten Push für das verbesserte Verständnis der neuronalen Vielfalt ist es wichtig, Gene zu identifizieren, deren Ausdruck verschiedene Subpopulationen von Zellen definiert. Die Netzhaut dient als hervorragendes Modell für die Untersuchung der zentralen Nervensystem-Vielfalt, da sie aus mehreren Hauptzelltypen besteht. Die Untersuchung jeder Hauptklasse von Zellen hat genetische Marker ergeben, die die Identifizierung dieser Populationen erleichtern. Allerdings gibt es mehrere Subtypen von Zellen innerhalb jeder dieser großen retinalen Zellklassen, und wenige dieser Subtypen haben genetische Marker bekannt, obwohl viele durch Morphologie oder Funktion charakterisiert wurden. Eine Kenntnis von genetischen Markern für einzelne retinale Subtypen würde die Untersuchung und Kartierung von Hirnzielen ermöglichen, die sich auf spezifische visuelle Funktionen beziehen und auch einen Einblick in die Gennetze vermitteln könnenPflegen zelluläre Vielfalt. Die gegenwärtigen Wege, die verwendet wurden, um die genetischen Marker von Subtypen zu identifizieren, besitzen Nachteile, wie die Klassifizierung von Zelltypen nach der Sequenzierung. Dies stellt eine Herausforderung für die Datenanalyse dar und erfordert rigorose Validierungsmethoden, um sicherzustellen, dass Cluster Zellen der gleichen Funktion enthalten. Wir schlagen eine Technik zur Identifizierung der Morphologie und Funktionalität einer Zelle vor der Isolierung und Sequenzierung vor, die eine leichtere Identifizierung von subtypspezifischen Markern ermöglicht. Diese Technik kann auf nicht-neuronale Zelltypen sowie auf seltene Populationen von Zellen mit geringfügigen Variationen erweitert werden. Dieses Protokoll liefert hervorragende Daten, da viele Bibliotheken Lese-Tiefen von mehr als 20 Millionen Lesungen für einzelne Zellen zur Verfügung gestellt haben. Diese Methodik überwindet viele der Hürden, die von Single-Cell RNA-Seq präsentiert werden, und kann für Forscher geeignet sein, die darauf abzielen, Zelltypen auf einfache und hocheffiziente Weise zu profilieren.

Einleitung

Die neuronale Diversität wird im gesamten Zentralnervensystem beobachtet, insbesondere in der Wirbeltierhaut, ein hochspezialisiertes Gewebe, bestehend aus 1 glialen und 6 neuronalen Zelltypen, die aus einer Population der Netzhautvorläuferzellen ^{1 , 2 , 3} entstehen. Viele Subtypen von Zellen können funktionell, morphologisch und genetisch klassifiziert werden. Ziel dieses Protokolls ist es, die genetische Variabilität von Zelltypen an ihre identifizierbaren funktionellen und / oder morphologischen Eigenschaften zu binden. Eine Reihe von Genen wurden für die Klassifizierung von Zellen identifiziert, aber viele Subtypen gehen weiterhin uncharakterisiert, da sie einen kleinen Bruchteil der Gesamtbevölkerung darstellen. Die Identifizierung von Genen innerhalb dieser spezifischen Subtypen wird ein besseres Verständnis der neuronalen Vielfalt innerhalb der Netzhaut ermöglichen und kann auch die Diversifizierung der neuralen Zellen anderswo beleuchten. FuDarüber hinaus erlauben Single-Cell-Studien die Aufdeckung neuer Zelltypen, die aufgrund ihrer geringen Repräsentation unter der Gesamtbevölkerung ^{4 , 5 , 6 , 7} übersehen werden ^können .

Einer der Vorteile der Single-Cell-Transkriptomik ist, dass einzigartige Marker oder Kombinationen von Markern, die einen bestimmten zellulären Subtyp definieren, entdeckt werden können. Diese können dann verwendet werden, um genetischen Zugang zu diesem Zelltyp für verschiedene Manipulationen zu gewinnen. Zum Beispiel verwenden wir dieses Protokoll zur Charakterisierung der zelltypspezifischen Gene einer Untergruppe von retinalen Ganglienzellen, die das Photopigment Melanopsin exprimieren. Die Verwendung eines fluoreszierenden Markers in Melanopsin-exprimierenden retinalen Ganglienzellen ermöglicht die Untersuchung dieser Zellen, da sie aufgrund ihrer Expression eines bekannten Gens zusammengehäuft sind. Interessanterweise gibt es fünf bekannte Subtypen dieser Zelle PopuLation in der Maus Retina ⁸ . Um also RNA aus Zellen jedes Typs zu isolieren, haben wir im Rahmen des transgenen Modells etablierte morphologische Klassifikationen verwendet, um jeden Subtyp vor der Zellisolation zu identifizieren. Diese Technik ermöglicht sowohl die Charakterisierung von Zellen als auch für ihre Isolierung direkt aus der Netzhaut, ohne die Notwendigkeit einer Gewebedissoziation, die eine Stressreaktion innerhalb von Zellen und eine Kontamination aufgrund von abgetrennten Dendriten verursachen kann ⁹ .

In den vergangenen Jahren ist eine Vielzahl neuer Techniken aufgetaucht, da sich die RNA-Seq-Methode weiterentwickelt. Diese Werkzeuge ermöglichen eine maximierte Zellaufnahme und eine höhere Kosteneffizienz bei Annäherung an die Frage ^{4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13} . Doch währendDiese Techniken waren hervorragende Stepping-Steine, gibt es eine Reihe von Hürden noch begegnet, dass dieses Protokoll in der Lage ist, Adresse. Zuerst isolieren viele der gegenwärtigen Verfahren Zellen aus dissoziiertem Gewebe und versuchen, entweder Hauptkomponentenanalyse oder hierarchische Clustering Post-hoc zu verwenden, um die Zellklassifizierung zu bestimmen. Das Verlassen auf diese Werkzeuge, um Subtypen zu klassifizieren, kann keine zuverlässigen Ergebnisse liefern und kann dazu führen, dass man neue Wege findet, um diese Daten für die Korrelation eines genetischen Markers zu einem funktionellen Zelltyp zu validieren. Das Erfordernis der Dissoziation in anderen Protokollen kann manchmal zu Gewebeschäden führen und kann dazu führen, dass neuronale Prozesse abgetrennt werden, was zu einem möglichen Verlust an mRNA führt. Weiterhin können in den dissoziierten Zellpräparaten die Stressreaktionen beginnen, die Transkriptome dieser Zellen zu beeinflussen ¹⁴ . Dieses Protokoll überwindet diese Herausforderungen durch die Bestimmung der funktionellen Zelltyp vor der Isolierung, und es hält besser die hDie Fähigkeit, das Netzhautgewebe intakt zu halten.

Eine Technik wurde im Jahr 2014 eingeführt und bestand aus der in vivo Analyse des Transkriptoms der lebenden Zellen ¹⁵ . Während diese Technik die Untersuchung des Transkriptoms mit minimaler mechanischer Störung des Gewebes ermöglicht, fehlt es an der Fähigkeit, spezifische Zelltypen innerhalb des Gewebes zu klassifizieren, bevor sie ihre Transkriptome untersuchen, ohne eine sehr spezifische Reportermaus zu verwenden. Unser Protokoll erfordert keinen spezifischen Reporter, da wir die Zellfüllung und die Elektrophysiologie nutzen, um Zellen vor ihrer Isolation zu charakterisieren. Eine weitere Einschränkung dieses früheren Protokolls besteht darin, dass es eine spezifische Wellenlänge benötigt, um das photoaktivierbare Element anzuregen, während unser Protokoll die Verwendung eines fluoreszierenden Reporters und eines fluoreszierenden Farbstoffs ermöglicht, die leicht verfügbar sind oder von jedem Labor einzeln ausgewählt werden können. Dennoch haben andere Laboratorien die beiden Methoden der Elektrizität geheiratetOphysiologie und Transkriptomik für das Studium der Zellvielfalt. Die Verwendung von Patch-Clamp-Aufnahmen zur Charakterisierung der Funktion einer Zelle vor ihrer Isolation wurde auf dissoziierten Neuronen durchgeführt ¹⁶ und in einigen Fällen ist sie der Verwendung der Mikroarray-Analyse ¹⁷ für diese Studien vorausgegangen. Die gleichen Komplikationen treten bei jenen Ansätzen auf, da sie eine Gewebedissoziation oder die Verwendung von Mikroarray-Technologie erfordern, die auf der Hybridisierung von Proben auf verfügbare Sonden beruht. Einer der jüngsten Fortschritte war die Entwicklung von Patch-Seq, einer Technik, die den Einsatz von Patch-Clamp-Aufnahmen und RNA-Seq-Technologie kombiniert, um Zellen aus Ganzhirn-Scheiben zu verstehen. Während diese Technik ihre Ähnlichkeiten mit dem hier vorgestellten Protokoll hat, ist es wieder wichtig zu beachten, dass unser Ansatz es dem Gewebe ermöglicht, für die Gesundheit der Zellen intakt zu bleiben. Hier stellen wir ein Protokoll für die optimizat vorIon dieser Allianz, die qualitativ hochwertige Single-Cell-Bibliotheken für den Einsatz von RNA-Seq generiert, um eine hohe Lesetiefe und Mapping-Abdeckung zu erhalten.

Protokoll

Alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Northwestern University genehmigt.

1. Vorbereitung von Lösungen für die Elektrophysiologie (4 h)

1. Mischen Sie 0,1% DEPC-behandeltes H ₂ O durch Zugabe von 1 ml Diethylpyrocarbonat (DEPC) zu 999 ml Umkehrosmose-gereinigtem H ₂ O. Mischen Sie gründlich und lassen Sie das Gemisch 1 h bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Dann das DEPC-gemischte H ₂ O für 15 min auf einem Flüssigkeitszyklus autoklavieren. Lassen Sie das DEPC-behandelte H ₂ O bei RT kühlen.
2. Machen Sie die extrazelluläre Lösung durch Mischen einer Flasche Ames 'Medium und 1,9 g (23 mM) Natriumbicarbonat in 1 l H ₂ O. Blasen Sie die extrazelluläre Lösung mit
   95% O ₂ /5% CO ₂ und halten sie bei einem pH-Wert von 7,3-7,4 auf.
3. Generieren Sie die intrazelluläre Lösung durch Kombinieren von 125 mM K-Gluconat, 2 mM MgCl ₂ , 10 mM EGTA, 10 mM HEPES und 0,1% DEPC-behandeltes H₂ O. In 1 ml Aliquots bei -20 ° C aufbewahren. Füge 10 μM Fluoreszenz-Tracer zu Beginn eines jeden Experiments hinzu.
4. Machen Sie die Enzymlösung durch Zugabe von 10.000 Einheiten Collagenase und 83 mg Hyaluronidase zu 4,15 ml extrazellulärer Lösung. Die Enzymlösung sollte in 50 μl Aliquots bei -20 ° C gelagert werden.

2. Vorbereitung des Netzhautgewebes (2 h)

HINWEIS: Alle Vorgehensweisen in diesem Abschnitt sollten unter düsterer Beleuchtung durchgeführt werden

1. Dunkel-anpassende Tiere für mindestens 1 Stunde vor der Sektion. Führen Sie alle Eingriffe unter düsterer Beleuchtung aus.
2. Euthanasieren Sie die Tiere durch CO ₂ -Aphydiierung und entkern die Augäpfel in eine Petrischale mit vorher sauerstoffhaltiger extrazellulärer Lösung.
3. Stacheln Sie die Hornhaut mit einer Nadel und schneiden Sie sie ab, indem Sie mit ophthalmischer Schere an der Grenze der Hornhaut und der Sklera schneiden.
4. Entfernen Sie das Objektiv mit# 5 Pinzette. Sanft in der Sklera mit der Pinzette reißen und den Sehnerv abtrennen, wo sich die Netzhaut und die Sklera treffen. Sorgfältig beenden, die Sklera aus der Netzhaut zu entfernen.
5. Entfernen Sie die transparente Glaskörper mit # 5 Pinzette; Einmal entfernt, erscheint der Glaskörper als eine gallertartige Substanz, die an der Pinzette festhält. Scheibe die Retinas in der Hälfte (so dass es 4 Stück / Tier) und speichern sie in sauerstoffhaltige extrazelluläre Lösung bei RT bis zum Einsatz.
6. Wenn es bereit ist, das Gewebe in der Aufzeichnungskammer zu montieren, legen Sie ein Stück Retina in eine Enzymlösung ein, die in 500 & mgr; l einer mit Sauerstoff angereicherten extrazellulären Lösung verdünnt ist. In einer Petrischale für 2 min bei RT auf einem Shaker inkubieren.
   1. Waschen Sie das Stück der Netzhaut in der mit Sauerstoff angereicherten extrazellulären Lösung und legen Sie das Gewebe in eine Glasboden-Aufzeichnungskammer; Verwenden Sie eine Plastik-Transferpipette, wobei die Spitze abgeschnitten ist, damit die Netzhaut übertragen werden kann, ohne dass das Gewebe beschädigt wird.
7. Verwenden fürUm das Gewebe sorgfältig zu glätten, wobei die Photorezeptorschicht nach unten zeigt. Entfernen Sie überschüssiges Fluid mit einer Pipette. Verankern Sie das Gewebe mit einem Platinring mit Nylongewebe.
   ANMERKUNG: Diese Methode könnte auch verwendet werden, um das Gewebe für die Isolierung von RNA aus markierten Amacrin- und Bipolarzellen herzustellen.
8. Füllen Sie die Kammer mit sauerstoffhaltiger extrazellulärer Lösung und montieren Sie sie auf eine Mikroskopstufe. Perfuse Gewebe mit sauerstoffhaltiger extrazellulärer Lösung bei 2-4 ml / min.

3. Visualisierung und Targeting von GFP + Retinal-Ganglion-Zellen (10 min)

HINWEIS: Alle Vorgehensweisen in diesem Abschnitt sollten unter düsterer Beleuchtung durchgeführt werden

1. Bevor Sie beginnen, ziehen Sie Glas-Mikropipetten (OD: 1,2 mm, ID: 0,69 mm) für elektrophysiologische Aufnahmen mit einem Mikropipetten-Abzieher. Verwenden Sie für die Elektroden das folgende Protokoll: Bitte beachten Sie, dass die Parameter entsprechend angepasst werden müssen, um den gewünschten Widerstand zu erreichenVariieren über Abzieher und mit unterschiedlichem Glas): Hitze: Rampe +10; Pull: 0; Vel: 23; Verzögerung: 1; Druck: 500; Programmschleife: 5 mal. Stellen Sie sicher, dass die Spitzen einen Durchmesser von 1 μm haben, mit Widerständen von 2-4 MΩ für die Ausrichtung auf große Zellen und 5-7 MΩ für die Ausrichtung auf kleinere Zellen.
2. Beobachten Sie die Ganglienzellschicht mit Hilfe der Infrarot-Differential Interference Contrast (IR-DIC) -Optik (Abbildung 1A ). Identifizieren Sie GFP + Retinal-Ganglion-Zellen (RGCs) unter Verwendung von Epifluoreszenz (~ 480 nm) (Abbildung 1B ).
3. Finden Sie die Pipette mit intrazellulärer Lösung in DIC gefüllt. Tragen Sie leichten positiven Druck und null irgendwelche Spannung Offsets auf dem Verstärker.
4. Drücken Sie die Glas-Mikropipette gegen eine GFP + -Zelle und wenden Sie einen Unterdruck an, um eine GΩ-Dichtung zwischen der Pipette und der Zellmembran zu bilden. Tragen Sie Prüfspannungsbefehlsschritte ( zB 5 mV) auf, um den Dichtwiderstand zu überwachen. Nach dem Bilden einer stabilen Dichtung, brechen die Membran durch die Anwendung von kurzen Impulsen von nEifriger Druck, um den ganzen Zelle zu gewinnen.
5. Warten Sie 1-2 min für die Dendriten der Zelle mit fluoreszierenden Tracer zu füllen.
   ANMERKUNG: Die Zelle kann morphologisch typisiert werden, indem man die Morphologie in Epifluoreszenz untersucht (Abbildung 1C ). Im Falle von Melanopsin-exprimierenden RGCs wird die dendritische Schichtung in der inneren plexiformen Schicht durch Untersuchung der mit fluoreszierendem Tracer gefüllten Dendriten unter epifluoreszierender Beleuchtung sichtbar gemacht und bestimmt, ob sie weit von dem Soma in der AUS-Subamina (M1 ipRGCs) nahe dem Ganglion stratifizieren Zellschicht in der ON-Subamina (M2 & amp; M4 ipRGCs) oder beide (M3 ipRGCs). Diese Beobachtung, kombiniert mit Soma-Größe (M4s haben deutlich große Somas im Vergleich zu allen anderen ipRGC-Subtypen), erlauben die Identifizierung des Zelltyps ^{20 , 21 , 22} . Somit ermöglicht diese Technik die Identifizierung des Zelltyps in vitro vor RNA isoLation Diese Methode könnte für andere Zelltyp-Identifikations-Protokolle, die entweder dendritische Morphologie oder zelluläre Physiologie, modifiziert werden.

4. Zellisolation (2 min)

1. Bevor Sie beginnen, stellen Sie die Tabletop-Mikrozentrifuge auf 2.000 x g ein. Bereiten Sie eine Probe-Vertreibung Gerät durch Anschluss Schlauch (OD: 3/32 in, ID: 1/32 in) mit einer 1 cc Spritze.
2. Platzieren Sie 0,2 ml PCR-Röhrchen mit 10 μl Lysepuffer und 1% β-Mercaptoethanol auf Eis. Bereiten Sie eine 1-cm-Spritze vor, die DEPC-behandeltes H ₂ O enthält, um die Pipettenspitzen zu spülen. Bereiten Sie einen Behälter mit Trockeneis vor, um den Lysepuffer nach der Probenahme einzufrieren.
3. Den zytoplasmatischen Gehalt der Zellpipette sorgfältig extrahieren, indem ein Unterdruck unter Verwendung einer 10 ml-Spritze angewendet wird; Alle zytoplasmatischen Inhalte, einschließlich Organellen, sollten nach Möglichkeit extrahiert werden.
   1. Überwachen Sie die Extraktion in DIC durch die Visualisierung der Zellkörper abnehmen in Größe. Nach dem extrahieren Den zytoplasmatischen Inhalt, die Pipette vorsichtig vom Gewebe abheben und die Pipette schnell aus der Lösung entfernen.
4. Entfernen Sie die Pipette schnell aus dem Kopfstufenhalter und spülen Sie die Pipettenspitze kurz mit DEPC-behandeltem H ₂ O mit einer 1 mL Spritze ab. Verbinden Sie die Pipette mit einer 1-ml-Spritze über eng anliegende Schläuche, um die Probe zu vertreiben.
5. Die Zellen sofort in 10 μl Lysepuffer 1, enthaltend 1% β-Mercaptoethanol, in 0,2 ml PCR-Röhrchen ausstoßen.
   HINWEIS: Das gesamte Aspirat mit den Zellen sollte sanft ausgestoßen werden, um keine Blasen einzuführen.
   1. Die Röhre kurz in einer Tabletop-Minizentrifuge bei 2.000 xg für 10 s zentrifugieren. Sofort die Proben für 5 min auf Trockeneis einfrieren lassen. Nach dem Einfrieren lagern sie bei -80 ° C für bis zu zwei Wochen für beste Ergebnisse; Die Proben können länger dauern, aber es wird empfohlen, dass sie so schnell wie möglich verarbeitet werden.

E "> 5. RNA-Reinigung (30 min)

1. Bevor Sie beginnen, richten Sie eine magnetische Trennvorrichtung ein, indem Sie den oberen Teil eines umgekehrten P20- oder P200-Spitzenhalters an den 96-well-Magnetständer 23 anschlagen.
2. Frische 70% Ethanol (EtOH) vorbereiten - ca. 1 mL pro Probe genügt. Entfernen Sie die RNA-Magnetperlen aus 4 ° C Lagerung und tauen Sie sie bei RT für mindestens 30 min auf.
   HINWEIS: Es sollten nicht mehr als 8 Proben gleichzeitig verarbeitet werden, da viele Schritte in diesem Protokoll auf Effizienz und schnelle Handhabung angewiesen sind.
3. Sobald die magnetischen Perlen bei RT sind, für 30 s vortexen, um sicherzustellen, dass die Lösung gut vermischt ist.
   HINWEIS: Die Perlen verwenden einen RNA-spezifischen Puffer, um selektiv RNA zu binden, und sie erlauben die Entfernung von anderen zellulären Abfällen, wenn sie mit einem Magnetplattenständer verwendet werden.
4. Tau-Zellen bei RT für 1 min auftragen und dann 5 & mgr; l RNase-freies H ₂ O zu jeder Probe hinzufügen; Pipette auf und ab. Füge 22 μl RNA-Kügelchen zu jedem Röhrchen hinzu und pipettierenE gründlich zu mischen. Die Proben bei RT für 5 min inkubieren, um die RNA zu interagieren und mit den magnetischen Kügelchen zu binden.
5. Legen Sie die Rohre auf eine magnetische Trennvorrichtung und lassen Sie für 8 min sitzen; Bevor sie fortfahren, stellen Sie sicher, dass der Überstand klar ist. Beobachten Sie die Perlen von einem Pellet und achten Sie darauf, es nicht während des Pipettierens zu lösen.
6. Den Überstand aus den Proben entfernen und 150 μl 70% EtOH zugeben. Entfernen Sie die EtOH und wiederholen Sie die Wäsche noch zweimal.
7. Lassen Sie die Proben 6 Minuten lang an der Luft trocknen. Überprüfen Sie intermittierend, ob mehr EtOH an der Unterseite des Tubus gesammelt hat. Entfernen Sie es entsprechend.
8. Während die Proben trocknen, wird 10X Reaktionspuffer durch Kombinieren von 19 & mgr; l Lysepuffer 2 und 1 & mgr; l RNase Inhibitor (40 U / & mgr; l) hergestellt. Spinnen Sie es kurz und halten Sie es auf Eis.
9. Sobald die Proben trocken sind und die Perlenpellets nicht mehr glänzend erscheinen, entfernen Sie die Röhrchen aus dem Magnetabscheider und fügen Sie 9,5 μl RNase-freies H ₂ O hinzuUm die Proben zu rehydrieren. Legen Sie die Proben auf Eis und fügen Sie 1 μl 10x Reaktionspuffer zu jeder Probe hinzu.

6. Reverse Transkription (10 min)

ANMERKUNG: Vor Beginn des Testens die notwendigen Reagenzien für die reverse Transkription (RT, mit Ausnahme des Enzyms) auf Eis auftauen. Dazu gehören: Primer II, Puffer 1, Oligonukleotid und RNase-Inhibitor.

1. Zu jedem Röhrchen werden 2 μl Primer II (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT ₍₃₀₎ N _-1 N, für die N _-1 A, C oder G sein kann und N A, C, G oder T, 12 μM sein können. Legen Sie die Röhrchen in einen Thermocycler, der bei 72 ° C für 3 min vorgewärmt wurde.
2. Bei der Inkubation den RT-Master-Mix vorbereiten. Für jede Reaktion werden 4 & mgr; l Puffer 1 (250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KCl und 30 mM MgCl ₂ ), 1 & mgr; l Oligonukleotid (48 & mgr; M) und 0,5 & mgr; l RNase-Inhibitor (40 U / ΜL).
3. Unmittelbar nach der Inkubation legen Sie die Röhrchen aufEis für 2 min.
4. Zugabe von 2 μl pro Reaktion der reversen Transkriptase (100 U / μL) zum Mastermix und Pipette sorgfältig. 7,5 μl Mastermischung zu jedem Röhrchen geben und durch vorsichtiges Pipettieren mischen. Drehen Sie kurz die Röhrchen, um den Inhalt an der Unterseite zu sammeln und legen Sie sie in einen vorgeheizten Thermocycler mit folgendem Programm: 42 ° C für 90 min, 70 ° C für 10 min und einem Halt bei 4 ° C.
5. Lagern Sie die Röhrchen bei -20 ° CO / N, bevor Sie fortfahren, obwohl es empfohlen wird, dass die Proben durch den Verstärkungsschritt getragen werden, bevor sie für längere Zeit gelagert werden; Andere Quellen deuten darauf hin, dass O / N-Speicher bei 4 ° C auch in diesem Schritt ²⁴ akzeptabel wäre.

7. cDNA Amplifikation (2,5 h)

HINWEIS: Vor dem Beginn Tau-PCR-Puffer und PCR-Primer auf Eis und drehen die Röhrchen unten in einer Tischplatte Mini-Zentrifuge, bevor die PCR-Master-Mix.

1. Für jede Reaktion, pEine PCR-Mastermischung mit 25 μl PCR-Puffer, 1 μl PCR-Primer (12 μM), 1 μl DNA-Polymerase und 3 μl nukleasefreies H ₂ O abgeben. Die DNA-Polymerase zuletzt kurz vor der Zugabe zugeben Von Master-Mix zu den Proben.
2. Füge 30 μl Master-Mix zu jedem Röhrchen hinzu und drehe bei 2.000 xg für 10 s, um den Inhalt an der Unterseite der Röhrchen zu sammeln.
3. Die Röhrchen in einen vorgeheizten Thermocycler mit folgendem Programm stellen: 95 ° C für 1 min; 34 Zyklen von 98 ° C für 10 s, 65 ° C für 30 s und 68 ° C für 3 min; 72 ° C für 10 min; Und einen Halt bei 4 ° C.
   HINWEIS: Die Anzahl der Zyklen für diese PCR wurde auf 34 erhöht, abweichend von den Anweisungen des Herstellers. Nach dem Wiederholungsversuch wurde festgestellt, dass diese Zyklusnummer konsequent zuverlässige Ergebnisse liefert.
4. Lagern Sie die Röhrchen bei -20 ° C bis zu einem Jahr, bevor Sie fortfahren.

8. Reinigung des amplifizierten cDNA (30 min)

1. Vor Beginn der Reinigung die DNA-Kügelchen und den Elutionspuffer mindestens 30 min lang auf RT bringen. Frische 80% EtOH zubereiten; 1 ml pro Probe sollte ausreichen. Füge 1 μl 10X Lysepuffer zu jeder Probe hinzu.
2. Vortex der DNA-Perlen für 30 s und füge 50 μl DNA-Kügelchen zu jeder Probe hinzu. Mischen Sie gründlich durch Pipettieren, und dann kurz spinnen sie sie bei 2.000 xg für 10 s. Inkubieren Sie die Röhrchen bei RT für 8 min.
3. Legen Sie die Röhrchen für 5 min auf die magnetische Trennvorrichtung. Den Überstand vorsichtig zweimal nach oben und unten pipettieren und die Proben für 2 min sitzen lassen. Während die Proben auf dem magnetischen Gerät sind, entfernen Sie den Überstand und entsorgen.
4. Füge 150 μl frisch hergestellter 80% EtOH zu jeder Probe hinzu und lasse sie 30 Sekunden lang bei RT sitzen. Entfernen Sie die EtOH und wiederholen Sie die EtOH einmal waschen.
5. Die Proben kurz drehen und 1 min auf den Magnetabscheider legen. Entfernen Sie alle verbleibenden EtOH und lassen Sie die Proben 5 Minuten lang an der Luft trocknen.
6. Prüfen Sie die Proben intermittierend, um zu sehen, ob EtOH gesammelt hat und entfernen Sie es mit einer Pipette.
7. Sobald das Perlenpellet nicht mehr glänzend erscheint, aber bevor Risse auftreten, entfernen Sie das Röhrchen aus dem Magnetabscheider und fügen Sie 17 μl Elutionspuffer hinzu. Vorsichtig pipettieren, um die Perlen vollständig zu resuspendieren.
8. Inkubieren Sie die resuspendierten Proben bei RT für 2 min.
9. Drehen Sie kurz die Proben, um alle Flüssigkeit an der Unterseite zu sammeln und legen Sie sie auf den magnetischen Separator für 2 min. Übertragen Sie 15 μl klarer Überstand auf ein 1,5 mL RNase-freies Röhrchen und lagern Sie es bei -20 ° C.
10. Untersuchen Sie die Qualität und die Größe der cDNA-Bibliothek mit einem hochempfindlichen Bioanalyton-Chip mit 1 μl cDNA. Die ideale Größe einer cDNA-Bibliothek beträgt 0,3-2 Kb mit einer Konzentration von mindestens 10 ng / μL (Abbildung 2 ).
    HINWEIS: Sie können sich entscheiden, PCR als eine Möglichkeit zu verwenden, um Proben zu scannen, um den Ausdruck bekannter Marker zu gewährleisten, bevor Sie mit dem Beispiel prEparation

9. Bestimmen Sie Konzentrationen und Tagment-cDNA (20 min)

1. Bevor Sie beginnen, bringen Sie das Assay Reagenz, Verdünnungspuffer und Standards auf RT für 30 min. Bereiten Sie eine Mastermischung mit 1 & mgr; l Assayreagenz und 199 & mgr; l Verdünnungspuffer pro Reaktion vor. Aliquot 199 & mgr; l dieser Mischung in 500 & mgr; l Teströhrchen 1 μl Probe zugeben und gut durchmischen.
2. Aliquotieren Sie 190 μl Mastermischung auf Röhrchen 1 & 2. Fügen Sie 10 μl Standard 1 zu Röhrchen 1 und 10 μl Standard 2 zu Röhre 2 hinzu. Vortex alle Probenröhrchen und Standardrohre für 5 s; Bei RT für 3 min inkubieren.
3. Bestimmen Sie die Konzentration der Proben mit einem hochempfindlichen Fluorometer. Stellen Sie sicher, dass die richtige Probenmenge eingegeben wurde, indem Sie die Option "Stammlösung berechnen" auswählen und "1 μL" markieren. Jede Probe in einem separaten 1,5 ml-Röhrchen bis zu einer Endkonzentration von 0,2 ng / μl in RNase-freiem H ₂ O verdünnen.
   HINWEIS:Während die Anweisungen des Herstellers darauf hindeuten, dass man mit 1 ng / μl Gesamtmenge an DNA beginnen sollte, haben wir einen kleineren Ausgangsbetrag verwendet und haben auch das Protokoll angepasst, um diese Änderung zu berücksichtigen.
4. In neuen 0,2-ml-PCR-Röhrchen pipettieren Sie 2,5 μl Puffer 2. Fügen Sie 1,25 μl cDNA zu dem entsprechenden Röhrchen für insgesamt 250 pg hinzu. Schließlich werden 1,25 & mgr; l Tagmentationsmischung zu jedem Röhrchen gegeben und die Pipette sorgfältig vermischt; Die Transposase innerhalb des Tagmentationsgemisches wird die DNA in kurze Stränge zerteilen und die Adaptoren an jedem Ende jedes Strangs anlagern, um sie später durch das Sequenzinstrument zu verwenden.
   HINWEIS: Die für die Tagmentierung und die Indexkopplung verwendeten Volumina sind ein Bruchteil der in den Anweisungen des Herstellers vorgeschlagenen Menge. Dies ermöglicht nicht nur die Konservierung von Reagenzien, sondern auch konsequent produzierte markierte Proben nach unserer Erfahrung.
5. Zentrifugieren Sie die Röhrchen auf einer Arbeitsplatte Mikrozentrifuge für 1 min.
6. Legen Sie die RohreIn einem vorgeheizten Thermocycler mit folgendem Programm: 55 ° C für 10 min und einem Halt bei 10 ° C.
   HINWEIS: Die Länge dieser Inkubation beträgt 10 min, im Gegensatz zu den vorgeschlagenen 5 min von den Anweisungen des Herstellers.
7. Unmittelbar nachdem dieses Programm abgeschlossen ist, entfernen Sie die Röhrchen und fügen Sie jeweils 1,25 μl Tagmentationsneutralisierungspuffer hinzu. Pipette gut zum Mischen und Inkubieren bei RT für 5 min. Führen Sie diesen Schritt sofort aus, da die Transposase aktiv bleibt, bis der Puffer das Enzym neutralisiert und die Reaktion stoppt.

10. Index Kopplung und Reinigung (1 h)

HINWEIS: Bevor Sie beginnen, bringen Sie die DNA Perlen und Resuspension Puffer auf RT für mindestens 30 min. Entscheiden Sie, welche Indizes für jede der Proben verwendet werden sollen.

HINWEIS: Diese Indizes werden an die jeweiligen 5'- und 3'-Enden der fragmentierten DNA zur Identifizierung von Proben nach der Sequenzierung angehängt. Stellen Sie sicher, dass keine zweiPaarungen sind die gleichen für Proben, die zusammen sequenziert werden können. Zum Beispiel, wenn Probe 1 Indizes weiß 1 und orange 1 verwendet, sollte Probe zwei weiß 1 und orange 2 oder weiß 2 und orange 2 verwenden, aber niemals die gleiche Kombination von Indizes. Dieses Kit enthält 4 verschiedene weiße und 6 verschiedene orangefarbene Indizes. Alle verschiedenen möglichen Kombinationen erlauben bis zu 24 Proben in einer Sequenzspur gepoolt werden. Obwohl wir in der Regel nur 10 Samples in einer Spur beherbergen, könnte man auch den Kit mit 24 Indizes verwenden, der das Bündeln von 96 Proben in einer einzigen Spur der Sequenzierung, falls gewünscht, ermöglichen würde.

1. Zu jeder Röhre fügen Sie 1,25 μl des linken Indexes und 1,25 μl des rechten Index für diese spezifische Probe hinzu. Fügen Sie 3,75 μl PCR-Master-Mix und Pipette gut zu mischen.
2. Zentrifuge in einer Arbeitsplatte Mikrozentrifuge für 1 min.
3. Die Röhrchen in einen vorgeheizten Thermocycler mit folgendem Programm stellen: 72 ° C für 3 min; 95 ° C für 30 s; 12 Zyklen von 9576, C für 10 s, 50 ° C für 30 s und 72 ° C für 1 min; 72 ° C für 5 min; Und einen Halt bei 4 ° C.
   HINWEIS: Der erste 95 ° C-Schritt wurde von 98 ° C geändert, was nach den Anweisungen des Herstellers vorgeschlagen wurde. Auch wurden die Zyklusdetails so eingestellt, dass die Temperaturen und Zeitlängen für die optimale Etikettierung unserer Proben erlaubten. Die endgültige Inkubation von 72 ° C wurde ebenfalls zu unserem Protokoll hinzugefügt und war nicht in den Anweisungen des Herstellers enthalten.
4. Drehen Sie kurz die Röhren, um den Inhalt an der Unterseite zu sammeln. Vortex der DNA-Kügelchen für 30 s und füge dann 30 & mgr; l zu jedem Röhrchen hinzu und vermische sorgfältig durch Pipettieren.
5. Inkubieren Sie die Proben bei RT für 5 min.
6. Legen Sie die Proben 2 min auf einen Magnetabscheider. Den Überstand zweimal nach oben und unten pipettieren und die Proben für 1 min inkubieren.
7. Entfernen und entsorgen Sie den klaren Überstand. Zugabe von 150 μl 80% EtOH zu jeder Probe und entfernen. Wiederholen Sie die EtOH einmal waschen.
8. Erlauben thE Proben an der Luft trocknen für 10 min. Überprüfen Sie intermittierend, ob EtOH an der Unterseite der Rohre gesammelt und nach Bedarf entfernt wird.
9. Sobald ein Riss in dem DNA-Perlenpellet auftritt, entfernen Sie die Probe aus dem magnetischen Separator und fügen Sie 27,5 & mgr; l Resuspensionspuffer hinzu, um das Pellet zu rehydratisieren. Sicherstellen, dass das Pellet vollständig resuspendiert ist, und dann bei RT für 2 min inkubieren.
   HINWEIS: Das für den Resuspensionspuffer verwendete Volumen wurde modifiziert, um die geringere Menge an Ausgangsmaterial in unserem Protokoll zu berücksichtigen und unterscheidet sich von dem vorgeschlagenen Volumen in den Anweisungen des Herstellers.
10. Legen Sie die Röhrchen für 2 min auf den Magnetabscheider. 25 μl klarer Überstand in ein RNase-freies Röhrchen überführen und bei -20 ° C aufbewahren.
    HINWEIS: Fahren Sie nicht mit den Anweisungen des Herstellers fort, um die Normalisierung der Bibliothek zu beenden. Die Proben werden nach diesem Schritt erfolgreich vorbereitet und sind für die Sequenzierung so vorbereitet.
11. Analysiere die tAgmentation der Proben unter Verwendung eines Bioanalyse-Chips und 1 & mgr; l jeder Probe
    HINWEIS: Die Analyse der Abstriche wird wie früher durchgeführt. Jedoch sollte cDNA nun in einem Größenbereich von 0,2-1 Kb nachgewiesen werden (Abbildung 3 ). Abstriche unterhalb dieses Punktes stellen wahrscheinlich die Verschlechterung der Proben dar, während größere Abstriche eine unvollständige Markierung vorschlagen.

11. Pooling von Proben (10 min)

1. Erhalten Sie Konzentrationen von Tagmentationsproben mit dem hochempfindlichen Fluorometer von früher und bestimmen Sie die Konzentration in nM.
   HINWEIS: Diese Berechnung kann mit der Verwendung eines Internet-Konvertierungs-Tools berechnet werden und beruht auf der durchschnittlichen Fragmentlänge von der Bioanalyzer-Spur. Um die durchschnittliche Fragmentlänge zu bestimmen, beobachten Sie die Spur für jede Probe einzeln und bestimmen die Größe des durchschnittlichen DNA-Fragments. Dies kann auch bei der Untersuchung der Bioanalyzer-Spur berechnet werden, indem man den Bereich des Abstriches hervorhebt und untersuchtDie vom Programm berechnete Molarität.
2. Kombinieren Sie Proben, so dass der Pool die gleiche Konzentration jeder Probe enthält. Die Proben nicht verdünnen; Der Pool sollte nur so verdünnt sein wie die niedrigstkonzentrierte Probe und hätte idealerweise eine Gesamtkonzentration von mindestens 15 nM.
3. Die gepoolten Proben bei -20 ° C vor der Sequenzierung aufbewahren; Es wird vorgeschlagen, dass die Proben einer Sequenzierung innerhalb von 1 Woche nach dem Pooling unterzogen werden. Führen Sie gepaartes Ende, 100 bp Sequenzierung mit einer HiSeq Plattform.

Ergebnisse

Zelltypen werden nach der Farbstoffinjektion leicht klassifiziert

Abbildung 1 zeigt ein Beispiel eines GFP + RGC vor und nach der Fluoreszenz-Tracer-Füllung. Diese Zelle wurde anhand ihrer Expression von GFP in der transgenen Linie identifiziert (Abbildung 1A ). Eine dichte Abdichtung wurde mit einer feinen Spitze, gezogenen Glaselektrode auf dem Soma dieser Zelle gebildet. Um den Subtyp zu char...

Diskussion

Unser Protokoll demonstriert durch eine schnelle und einfach zu bedienende Anleitung eine Methode zur Vorbereitung einzelner Zellen identifizierter morphologischer Klassen für qualitativ hochwertige Sequenzierung mit wenig Verletzung der Probe. In dem vorliegenden Manuskript werden intrinsisch lichtempfindliche retinale Ganglienzellen morphologisch charakterisiert, isoliert und für RNA-Seq vorbereitet. Während der Netzhauthandhabung können zelluläre Spannungen auftreten Aus diesem Grund ersetzen wir jedes Stück Ge...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ames' Medium	Sigma Aldrich	A1420-10X1L
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S8875
K-gluconate	Spectrum Chemical	PO178
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758
Alexa Fluor 594 Hydrazide	Invitrogen	A10442
Collagenase	Worthington Biochemical	LS005273
Hyaluronidase	Worthington Biochemical	LS002592
Petri dish (35 mm diameter)	Thermo Fisher Scientific	153066
Ophthalmologic scissors	Fine Science Tools	15000-00
#5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
Microplate Shaker	Fisher Scientific	13-687-708
Glass Micropipette	Sutter	BF120-69-10
Micropipette Puller	Sutter		P-1000 horizontal pipette puller
1 mL syringe	Fisher Scientific	14-823-2F
Flexible tubing	Fisher Scientific	14-171
TCL lysis buffer	Qiagen	1031576	Lysis Buffer 1
β-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
RNase-free Water	Qiagen	129112
0.2 mL PCR tubes	Eppendorf	30124359
Ethyl Alcohol, Pure	Sigma Aldrich	E7023	Ethanol
Analog Vortex Mixer	Thermo Fisher Scientific	02215365	Vortex
Mini Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	05-090-100
Agencourt RNAClean XP Beads	Beckman Coulter	A63987	RNA magnetic beads
MagnaBlot II Magnetic Separator	Promega	V8351	Magnetic stand
1.5 mL MCT Graduated Tubes	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit	Clontech	634888	Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification
10x Lysis Buffer			Lysis Buffer 2
5x Ultra Low First-strand Buffer			Buffer 1
3' SMART-Seq CDS Primer II A			Primer II
SMART-Seq v4 Oligonucleotide			Oligonucleotide
SMARTScribe Rverse Transcriptase			Reverse Transcriptase (RT)
2x SeqAmp PCR Buffer			PCR Buffer
PCR Primer II A			PCR Primer
SeqAmp DNA Polymerase			DNA Polymerase
Mastercycler pro S	Eppendorf	950030020	Thermocycler
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63881	DNA magnetic beads
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA
HS Bioanalyzer Chips & Reagents	Agilent Technologies	5067-4626
Qubit HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	For the calculation of sample concentrations
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit	Illumina	FC-131-1024	Reagents for Tagmentation and Index Coupling
TD Buffer			Buffer 2
ATM			Tagmentation Mix
NT Buffer			Tagmentation Neutralizing Buffer
NPM			PCR Master Mix
Nextera XT Index Kit	Illumina	FC-131-1001	Indices for Tagmentation
N501			White 1
N502			White 2
N701			Orange 1
N702			Orange 2
HiSeq 2500	Illumina	SY-401-2501	For completing sequencing of samples