Tandem Affinity Purification von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen

Zusammenfassung

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

Zusammenfassung

Die Reinigung von aktivem Protein-Protein- und Protein-Nukleinsäure-Komplexen ist von entscheidender Bedeutung für die Charakterisierung der enzymatischen Aktivitäten und de novo Identifizierung neuer Untereinheiten und post-translationalen Modifikationen. Bakterielle Systeme erlauben die für die Expression und Reinigung einer Vielzahl von einzelnen Polypeptide und Proteinkomplexen. Allerdings ist dieses System nicht die Reinigung von Protein - Untereinheiten ermöglichen , die post-translationale Modifikationen beinhalten (zB Phosphorylierung und Acetylierung) und die Identifizierung von neuen regulatorischen Untereinheiten , die nur present / ausgedrückt in der eukaryotischen System sind. Hier stellen wir eine detaillierte Beschreibung eines neuen, robusten und effizienten tandem Affinitätsreinigung (TAP) Verfahren unter Verwendung von Strep- und FLAG-markierte Proteine, die die Reinigung von Proteinkomplexen mit transient oder stabil exprimiert erleichtert Epitop-markierten Proteinen aus eukaryontischen Zellen. Dieses Protokoll kann angewendet werden Prot zu charakterisierenein komplexer Funktionalität, zu entdecken, post-translationale Modifikationen an komplexen Untereinheiten und neuen Regulations komplexen Komponenten durch Massenspektrometrie zu identifizieren. Bemerkenswert ist, kann diese TAP-Methode angewendet werden Proteinkomplexe durch eukaryotische oder pathogene (viral und bakteriell) Komponenten gebildet zu untersuchen, so dass eine Vielzahl von stromabwärts experimentellen Möglichkeiten ergibt. Wir schlagen vor, dass die Forscher mit Proteinkomplexen arbeiten in vielen verschiedenen Möglichkeiten, um diesen Ansatz nutzen können.

Einleitung

Protein-Protein - Wechselwirkungen (PPIs) sind entscheidend für die genaue Regulierung der biologischen Prozesse ^1, und weitere Studien auf diesen PPIs kann ² um ihre Funktion zu informieren. Mehrere Ansätze wurden für die Untersuchung und Charakterisierung von EPI sowie für die de novo - Identifizierung neuer regulatorischer Proteinkomponenten entwickelt. Stanley Felder und Kollegen 1989, berichtete die Hefe - Zwei-Hybrid (Y2H) Test ^3. Dieser Ansatz ermöglicht die unvoreingenommene und umfassende Identifizierung von Interaktoren (Beuten) für ein definiertes Protein von Interesse (Köder) in Saccharomyces cerevisiae. Neben der bemerkenswerten Nutzen für die Entdeckung PPIs kann der Y2H Assay zur Charakterisierung von Protein-Paare in Hefezellen verwendet werden, definieren eine minimale Interaktion Domänen und Identifizierung Mutationen, die derartige Wechselwirkungen aufheben. Durch Modifizieren der Y2H Assay kann PPIs auch in Säugerzellen untersucht werden,class = "xref"> 4. Variationen des Y2H Assay (zB Hefe Drei-Hybrid - System) kann auch zu studieren Protein-RNA und Protein-small organischen Liganden - Wechselwirkungen in Zellen angewendet werden.

Ein weiteres häufig verwendetes Werkzeug PPIs in einem homologen System zu studieren , ist die Co-Immunopräzipitation (Co-IP) Assay ^5. Durch die Verwendung eines Antikörpers für ein Protein von Interesse zu immunpräzipitieren, erlaubt die Co-IP-Assay Forscher PPIs in Zellen für die verschiedenen Umgebungsbedingungen und experimentelle Situationen zu überwachen. Die Verwendung von Epitop-markierten Proteinen (zB FLAG, Myc, Strep, und HA, ua) in der Affinitätsreinigung (AP) Verfahren , um die Isolierung von Proteinen aus komplexen Proteingemischen für mehrere Downstream - Assays erleichtert hat, einschließlich Western - Blot, silver stain und enzymatische Analyse. Jedoch keiner dieser früheren Ansätze ermöglichen die Isolierung von großen Mengen an Protein - Komplexe zur weiteren Charakterisierung einschließlich in vitro assays, Entdeckung der regulatorischen Untereinheiten durch Massenspektrometrie, und Identifizierung von post-translationalen Modifikationen. Eine verbesserte Version des AP Methode Tandem AP (TAP) bezeichnet, die EPI für die Untersuchung durch die Schaffung eines Fusionsproteins mit zwei Epitope ein Reinigungsverfahren, das ⁶ bis zwei aufeinanderfolgende APs gereinigt ^{wird, 7.} In diesem Artikel stellen wir eine Variation des TAP Verfahren zur Reinigung von Protein-Komplexe, in denen zwei Untereinheiten mit unterschiedlichen Epitopen markiert werden und dann durch zwei aufeinanderfolgende APs (STREP AP gefolgt von einer FLAG IP) gereinigt. Wir bieten zunächst eine minimalistische Übersicht über TAP (Abbildung 1) und dann eine detaillierte Beschreibung aller experimentellen Schritte (Abbildung 2), so dass die Forscher sie auf ihre Proteinkomplex von Interesse anwenden können.

Um die Anwendbarkeit des TAP-Methode zu demonstrieren, haben wir uns für eine gut charakterisierte Cyclin-CDK-Komplex (bezeichnet als PTEFB - kinase), die aus der regulatorischen Untereinheit Cyclin T1 (CycT1) und eine kinase (CDK9) zusammengesetzt ist, und ist an der Regulation der Transkription durch RNA - Polymerase II (Pol II) ^{8, 9} beteiligt sind ^{, 10.} P-TEFb phosphoryliert die C-terminale Domäne von Pol II und den damit verbundenen negativen Elongationsfaktoren, die an der transkriptionalen Promotor Pausieren entlastet und erleichtert dadurch Transkriptionselongation ^{11, 12, 13.} Bei dieser bekannten Interaktion im Auge, STREP-tagged CycT1 und FLAG-markierten CDK9 waren über in HEK293T-Zellen exprimiert. Eine reziproke TAP Experiment wurde mit Strep-tagged CDK9 und FLAG-markiertes CycT1 geführt weiter zu bestätigen, dass die Protein-Interaktion ist unabhängig von der verwendeten Epitope. Die Zellen wurden gesammelt und lysiert 48 h nach der Transfektion. Das lösliche Lysat durch TAP gereinigt (STREP AP gefolgt von FLAGIP). Eingangs- und gereinigten Proteine wurden durch Western Blot und Silberfärbung (Abbildung 3) analysiert.

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Protokoll

1. Plating Cells

1. Einen Tag vor der Transfektion Platte 3,5 x 10 ⁶ HEK293T - Zellen in 10 ml Dulbecco-modifiziertem Eagle Medium (DMEM) , ergänzt mit 10% (v / v) fötalem Rinderserum (FBS) und 1% (v / v) Penicillin / Streptomycin (10.000 U / ml Lager) pro 100 mm Schale. Platte 3 bis 5 100 mm-Schalen pro Versuch / Zustand ausreichend Protein Erholung zu gewährleisten.
   HINWEIS: Die Anzahl der Platten hat für jedes Experiment / Bedingung bestimmt werden, die auf den Expressionsspiegel und die Löslichkeit des Proteinkomplex von Interesse verlassen wird. Alternativ, falls in größerem Maßstab Reinigung benötigt wird, können Zelllinien angepasst werden in Suspensionen in spinner flasks ² zu wachsen, aber dieses Verfahren nicht für transiente Transfektionen arbeiten.

2. Transfektion von Zellen oder Induzierende stabilen Zelllinien

1. Am folgenden Tag, überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop. 80% konfluent vor proce - Zellen müssen 70 seineding.
2. Transfizieren der Zellen mit einer Gesamtmischung von 7 & mgr; g Plasmid-DNA und 21 & mgr; l Transfektionsreagenz pro 100 mm-Schale. Transfizieren Zellen mit einem Vektor die GFP exprimieren (Tabelle 1) als Kontrolle für die Transfektionseffizienz.
   HINWEIS: Bei Verwendung eines HEK293-T-REx oder ähnliche stabile Zelllinie, die die Expression von zwei oder komplexeres Untereinheiten in Reaktion auf Doxycyclin ^{14, 15} induziert wird der Induktor haben zu den Zellen hinzugefügt werden und für 48 Stunden inkubiert. Ähnlich wird eine stabile Zelllinie, die die Expression von GFP bei der Zugabe des Induktors auch zu Validierungszwecken erforderlich wäre induziert. Gehen 2.7 zu treten.
3. Bereiten Sie die Transfektionsgemischs pro 100 mm Schale. In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 7 ug Gesamt-Plasmid-DNA (entsprechend zwei oder mehreren Plasmiden) 500 ul DMEM unsupplementierten mischen. In einem separaten Reaktionsgefäß, mischen 500 ul unsupplementierten DMEM with 21 ul des Transfektionsreagenz. Wiederholen Sie für jede Transfektionsreaktion.
4. Pipette, um die Transfektionsreagenz Lösung in die Plasmid-DNA-Lösung (nicht zu verwechseln Lösungen in umgekehrter Reihenfolge). Mischen von mindestens 4 mal Pipettieren.
5. Inkubieren dieser Mischung bei Raumtemperatur für 10 bis 15 min, aber nicht länger als 15 min.
6. Neigen die Platte einen Medienspeicher zu schaffen und Pipetten sorgfältig das Transfektionsgemisch tropfenweise auf die innere Seite der Platte, ohne die Zellen zu stören. Bringen Sie das Gericht auf seine ursprüngliche flache Position und vorsichtig schwenken die Mischung zu verteilen.
7. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in einer befeuchteten Zellkultur - Inkubator mit 5% CO ₂ (dieser Zustand im folgenden als "Gewebekultur - Inkubator" bezeichnet wird). Ersetzen Sie die Medien 5 Stunden nach der Transfektion (optional).

3. Prüfung Transfection oder Induction Efficiency

1. Bei 24 Stunden nach der Transfektion visualisieren die Zellen unter einer Grippeorescent Mikroskop für die Transfektionseffizienz (oder Induktion von Steuer HEK293T-REx stabile Zelllinie GFP-exprimierenden) zu überprüfen. Inkubieren für weitere 24 Stunden.

4. STREP Affinitätsreinigung (STREP AP)

1. Das Sammeln der Zellen
   1. Bei 48 Stunden nach der Transfektion, entfernen Sie die Medien und 8 ml kaltem 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Pipette nach oben und unten Zellen von der Platte zu lösen.
   2. Sammeln Sie und übertragen Sie die Zellsuspension in einem 15 ml-Röhrchen und drehen Sie die Zellen bei 800 · g unten für 4 min bei 4 ° C.
   3. Entfernen Sie den PBS Überstand. Wiederholen Sie den Spin-Down (800 × g für 1 min bei 4 ° C) restliche PBS zu beseitigen. Lagern Sie das Zellpellet bei -80 ° C für eine spätere Verwendung oder das Verfahren folgen unterhalb der Proteinreinigung fortzusetzen.
2. Lyse der Zellen
   1. Resuspendieren der Pellets Zelle 5 × Zellpellet Volumen mit (~ 250 & mgr; l pro Platte) Passive Lysis Buffer(PLB: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl _2, 1 mM DTT, Protease - Inhibitor - Cocktail - Tablette, 5% v / v Glycerin und 1,0% NP-40) und übertragen die Zellsuspension auf eine 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
   2. verwirbeln kurz die Suspension und Nutation für 30 min bei 4 ° C.
   3. Drehen, um die Zellsuspension bei 10000 xg für 10 min bei 4 ° C.
   4. Übertragen Sie die löslichen Lysate in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und entsorgen Sie die Zellpellets. Sparen Sie 10% des endgültigen Volumens des löslichen Lysat als "STREP AP Input". Lagerung bei 4 ° C.
3. Äquilibrieren der STREP Perlen
   HINWEIS: Verwenden Sie STREP Perlen zum ersten AP Schritt! Komplexe nach unten gezogen mit STREP Perlen als die deutlich mehr Protein erholen mit FLAG Perlen nach unten gezogen.
   1. Nehmen Sie (n 40 & mgr; l ×) + n ul der 50% STREP Kügelchenaufschlämmung (n = Anzahl der Proben) und Spin-down bei 1.500 × g für 2 min bei 4 ° C.
      HINWEIS: Verwenden Sie Weit mouthed Tipps Pipette Perlen.
   2. Entfernen Sie den Überstand und fügen 500 ul PLB an die Kügelchen. Nutiert die Perlen Gemisch 5 min bei 4 ° C. Spin down bei 1.500 × g für 2 min bei 4 ° C.
      1. Wiederholen für insgesamt 3 Waschungen. Resuspendieren der Kügelchen in PLB auf ein Endvolumen von n × 40 & mgr; l.
   3. Werden 40 ul 50% STREP Kügelchenaufschlämmung zu jedem Zelllysat Probe und nutiert für 2 h bei 4 ° C.
4. STREP AP
   1. Spin down-Lösung bei 1500 × g für 2 min bei 4 ° C.
   2. Entfernen Sie den Überstand und speichern als "STREP AP Durchfluss (FT)" bei 4 ° C.
   3. Hinzufügen 500 ul von Strep AP Waschpuffer I (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaCl, 1,5 mM MgCl _2, 1 mM DTT, 5% Glycerin und 0,2% NP-40) an die Kügelchen. Nutiert die Perlen Gemisch 5 min bei 4 ° C und Zentrifugation bei 1.500 × g für 2 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen.
      1. Wiederholen Sie dies für insgesamt 4 Wäschen.
         Hinweis: Vor der vierten Wäsche, übertragen Sie die Perlen-Lösung in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, das Protein Hintergrund zu reduzieren. Dieser Schritt ist wichtig.
   4. Hinzufügen, 500 & mgr; l Waschpuffer II (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl und 1 mM EDTA) und die Kügelchen äquilibrieren durch die Rohre zu invertieren. Spin down bei 1.500 × g für 2 min bei 4 ° C und den Überstand verwerfen.
   5. Eluieren des Proteins von Interesse mit 50 ul von Strep Elutionspuffer (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA und 2,5 mM Desthiobiotin). Vortex bei 800 Upm für 15 min bei 4 ° C.
   6. Spin down die Perlen bei 1.500 × g für 1 min bei 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand. Dieser Anteil entspricht dem "STREP AP Elution" Probe.
   7. Speichern Sie die Perlen Fraktion bei 4 ° C für eine zweite Elution, die auf die Hälfte der Menge an Protein mit der ersten Elution erhalten ergeben könnte. Aliquot 10% des Strep AP Elution zur Silberfärbung und / oder Western-Blotting^16.
5. Äquilibrieren der FLAG - Perlen
   1. Nehmen Sie (nx 16 & mgr; l) + n ul FLAG Perlen-Lösung (n = Anzahl der Proben) und Spin-down bei 1.500 × g für 2 min bei 4 ° C.
      HINWEIS: Verwenden Sie Weithals Tipps Pipette Perlen.
   2. Entfernen Sie den Überstand und fügen 500 ul FLAG Waschpuffer (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA und 0,1% NP-40) an die Kügelchen. Spin down bei 1.500 × g für 2 min bei 4 ° C. Wiederholen für insgesamt 3 Waschungen.
   3. Resuspendieren der Kügelchen in FLAG Waschpuffer auf ein Endvolumen von 16 & mgr; l nx.
   4. Format 16 ul der FLAG Kügelchenaufschlämmung zum verbleibenden STREP AP Elution und nutiert über Nacht bei 4 ° C.

5. FLAG IP

1. Spin down die FLAG Perlen Suspension bei 1500 × g für 2 min bei 4 ° C. Speichern Sie den Überstand und speichern als "FLAG IP Flow-through" (FT) bei 4 ° C.
2. In 50081; l von FLAG Waschpuffer zur Lösung. Nutiert für 5 min bei 4 ° C und Zentrifugation bei 1.500 × g für 2 min bei 4 ° C. Wiederholen Sie dies für insgesamt 4 Waschungen und entfernen Sie den Überstand nach jeder Wäsche.
   HINWEIS: Vor der vierten Wäsche, übertragen Sie die Protein-Kügelchen-Lösung in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen Hintergrund zu reduzieren. Dieser Schritt ist wichtig.
3. Entfernen Sie den Überstand aus dem letzten Spin und fügen Sie 30 ul Waschpuffer FLAG, die 200 ng / ul FLAG-Peptid in die Kügelchen. Vortex bei 800 Upm für 2 h bei 4 ° C.
4. Spin down die Suspension bei 1500 × g für 2 min bei 4 ° C. Ernten Sie den Überstand und lagern bei 4 ° C als "FLAG IP Elution."
   HINWEIS: Die Elution Proben kann durch Silberfärbung und / oder Western - Blot unter Verwendung von Standardprotokollen ^16, und sind bereit für die weitere Proteintests bestätigt werden. Wenn eine Western-Blot-Einrichtung, mit allen folgenden Proben durchgeführt: (1) STREP AP Eingang, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elutiauf, (4) FLAG IP FT, und (5) FLAG IP Elution. Volumes geladen wird für jedes Experiment ermittelt werden. Alle gesammelten Proben und Perlen können Kurzzeitspeicher gespeichert werden und bei -80 ° C zur Langzeitlagerung bei 4ºC. TAP Proben konnten durch Massenspektrometrie analysiert werden , um die Identität ihrer Komponenten zu überprüfen, neuartige posttranslationale Modifikationen (PTMs) zu identifizieren, und / oder jede neue Protein - Wechselwirkung zu entdecken , mit dem gereinigten Komplex ^{2, 17.} Zu diesem Zweck wird nach einer Coomassie-Gel oder Silberfärbung ausgeführt wird, können Bänder aus dem Gel ausgeschnitten werden, um einen sauberen Skalpell. Mehrere ausgezeichnete Bewertungen, die Massenspektrometrie Methoden diskutieren wurden bisher ^{18 veröffentlicht, 19.}

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Ergebnisse

In diesem Artikel zeigen wir die Anwendbarkeit der TAP Verfahren zur gut charakterisierten CycT1-CDK9 Komplexes (auch als P-TEFb Kinase bekannt).

Plasmide , kodierend Cyclin T1-Strep (CycT1: S) und CDK9-FLAG (CDK9: F) oder CDK9-Strep (CDK9: S) und Cyclin T1-FLAG (CycT1: F) (Tabelle 1), wurden in HEK293T - Zellen transfiziert . Negative Kontrollen enthalten Transfektionen mit einem leeren Vektor und dem CDK9: F...

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Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll für die Expression und Isolierung von Proteinkomplexen aus eukaryotischen Zellen ist nicht auf die biochemische Charakterisierung solcher molekularen Anordnungen beschränkt, sondern kann auch für die Identifizierung von neuen Interaktoren und post-translationalen Modifikationen verwendet werden, die ihre Funktion regulieren könnte. Die Verwendung von Affinitätsmarkierungen ist nicht beschränkt auf das, was in diesem Protokoll genannt wird; aber unsere Erfahrung legt nahe, dass STREP...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	GE Healthcare Life Sciences/Hyclone	SH3002.2FS
Fetal bovine serum	GE Healthcare Life Sciences/Hyclone	SH30071
Penicillin/Streptomycin	MP Biomedicals	MP091670049
PolyJet	SignaGen Laboratories	SL100688
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836153001
STREP-Tactin Superflow	IBA Lifesciences	2-1208-010
STREP-tag elution buffer	IBA Lifesciences	2-1000-025
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	F2426
Corning 100 mm × 20 mm style dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve	Corning	430167
Protein Lo-Bind Eppendorf	Eppendorf	022431081
Digital Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-370
48 hole micro tube foam rack	Fisher Scientific	02-215-386
Labquake shaker rotisserie	Thermo	415110