Zuordnung von RNA-RNA-Wechselwirkungen unter Verwendung von biotinyliertem Psoralen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Methode des S- Zensierens von P- Soralen-vernetzten, l- igierten und S- gewählten H- Ybriden (SPLASH), die eine genomweite Abbildung von intramolekularen und intermolekularen RNA-RNA-Wechselwirkungen in vivo ermöglichen. SPLASH kann angewendet werden, um RNA-Interaktome von Organismen einschließlich Hefe, Bakterien und Menschen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Zu wissen, wie RNAs mit sich selbst und mit anderen interagieren, ist der Schlüssel zum Verständnis der RNA-basierten Genregulation in der Zelle. Während Beispiele für RNA-RNA-Wechselwirkungen wie microRNA-mRNA-Wechselwirkungen gezeigt wurden, um die Genexpression zu regulieren, ist das volle Ausmaß, in dem RNA-Wechselwirkungen in der Zelle auftreten, noch unbekannt. Bisherige Methoden zur Untersuchung von RNA-Wechselwirkungen haben sich primär auf Teilmengen von RNAs konzentriert, die mit einem bestimmten Protein oder einer RNA-Spezies interagieren. Hier beschreiben wir eine Methode namens S equencing von P soralen vernetzt, L igated und S gewählt H ybrids (SPLASH), die genomweites Erfassen von RNA-Wechselwirkungen in vivo in einer unvoreingenommenen Weise ermöglicht. SPLASH nutzt in vivo- Vernetzung, Proximity-Ligation und High-Throughput-Sequenzierung, um intramolekulare und intermolekulare RNA-Basenpaarungspartner weltweit zu identifizieren. SPLASH kann auf verschiedene Organismen angewendet werden, einschließlich Bakterien, Hefe und menschliche Zellen, sowie aS vielfältige zelluläre Bedingungen, um das Verständnis der Dynamik der RNA-Organisation unter verschiedenen zellulären Kontexten zu erleichtern. Das gesamte experimentelle SPLASH-Protokoll dauert ca. 5 Tage und der rechnerische Workflow dauert ca. 7 Tage.

Einleitung

Das Studium, wie Makromoleküle falten und miteinander interagieren, ist der Schlüssel zum Verständnis der Genregulation in der Zelle. Während in den vergangenen zehn Jahren viel Aufwand fokussiert wurde, um zu verstehen, wie DNA und Proteine ​​zur Genregulation beitragen, ist relativ wenig über die posttranskriptionelle Regulation der Genexpression bekannt. RNA trägt sowohl in ihrer linearen Sequenz als auch in ihrer sekundären und tertiären Struktur ¹ Information. Seine Fähigkeit, sich mit sich selbst und mit anderen zu paaren, ist für seine Funktion in vivo wichtig. Jüngste Fortschritte bei der Hochdurchsatz-RNA-Sekundärstruktur-Sondierung lieferten wertvolle Einblicke in die Orte von Doppel- und Einzelstrangbereichen im Transkriptom ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} , HoweDie Information über die Paarungs-Interaktionspartner fehlt noch weitgehend. Um zu bestimmen, welche RNA-Sequenz mit einer anderen RNA-Region im Transkriptom interagiert ist, benötigen wir globale paarweise Informationen.

Die Abbildung von Paar-weise RNA-Interaktionen in einer globalen, unvoreingenommenen Weise war traditionell eine große Herausforderung. Während frühere Ansätze, wie CLASH ⁹ , hiCLIP ¹⁰ und RAP ¹¹ , verwendet werden, um RNA-Wechselwirkungen in einer großen Skala zu identifizieren, weisen diese Techniken typischerweise die RNA-Basenpaarung für eine Untergruppe von RNAs auf, die entweder mit einem bestimmten Protein oder einer RNA-Spezies interagieren. Zu den jüngsten Entwicklungen beim Studium globaler RNA-Wechselwirkungen gehören die Methode RPL ¹² , die RNA-Wechselwirkungen nicht in vivo stabilisiert und daher nur eine Untermenge von in vivo- Wechselwirkungen erfassen kann. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, entwickelten wir und andere genomweite, unvoreingenommene Strategien für maP-RNA-Interactome in vivo unter Verwendung modifizierter Versionen des Vernetzers Psoralen ^{13 , 14 , 15} . In diesem Protokoll beschreiben wir die Details für die Durchführung von S- Zentren von P- Soralen-vernetzten, l- igierten und S- gewählten H- Ybriden (SPLASH), die biotinylierte Psoralen verwenden, um Basenpaarungs-RNAs in vivo zu vernetzen, gefolgt von einer Näherungsligatur und einer hohen Durchsatzsequenzierung zu Identifizieren RNA-Basenpaarungspartner genomweit ( Abbildung 1 ) ¹⁵ .

In diesem Manuskript beschreiben wir die Schritte zur Durchführung von SPLASH unter Verwendung von kultivierten adhärenten Zellen, in diesem Fall HeLa-Zellen. Das gleiche Protokoll kann leicht an Suspensions-Säugetierzellen und an Hefe- und Bakterienzellen angepasst werden. Kurz gesagt werden HeLa-Zellen mit biotinyliertem Psoralen behandelt und bei 365 nm bestrahlt, um interagierende RNA-Basenpaare in vivo zu vernetzen. Die RNAs werden dann aus den Zellen extrahiert, zersplittert und angereichert für Vernetzungsregionen unter Verwendung von Streptavidinperlen. Interagierende RNA-Fragmente werden dann unter Verwendung von Proximity-Ligation miteinander ligiert und zu einer cDNA-Bibliothek zur tiefen Sequenzierung gebracht. Nach der Sequenzierung werden die chimären RNAs auf das Transkriptom / Genom abgebildet, um die RNA-interagierenden Regionen zu identifizieren, die miteinander gepaart sind. Wir haben SPLASH erfolgreich genutzt, um Tausende von RNA-Wechselwirkungen in vivo in Hefe und verschiedenen menschlichen Zellen zu identifizieren, einschließlich intramolekularer und intermolekularer RNA-Basenpaarung in verschiedenen Klassen von RNAs wie SnoRNAs, lncRNAs und mRNAs, um in die Strukturorganisation und Interaktionsmuster einzutauchen Von RNAs in der Zelle.

Protokoll

1. Behandlung von HeLa-Zellen mit biotinylierter Psoralen- und RNA-Extraktion

1. Kultur-HeLa-Zellen in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin Streptomycin (PS) in einer 10 cm-Platte.
2. Die HeLa-Zellen zweimal mit 5 ml 1x PBS waschen. Den PBS vollständig aus der Schale abtropfen lassen, indem man die Schale für 1 min vertikal platziert.
3. Füge 1 ml PBS mit 200 μM biotinyliertem Psoralen und 0,01% w / v Digitonin zu den Zellen gleichmäßig hinzu und inkubiere bei 37 ° C für 5 min. Während biotinyliertes Psoralen in die Zelle eindringen kann, ist seine Permeabilität viel höher, wenn die Zellen mit geringen Mengen an Digitonin (0,01%) für 5 min belichtet werden
4. Entfernen Sie den Deckel der 10 cm Platte, die die behandelten HeLa-Zellen enthält, und legen Sie die Schale auf Eis auf. Bestrahlen Sie die Schale mit den Zellen mit 365 nm UV für 20 min auf Eis, in einem Abstand von 3 cm von den UV-Glühbirnen, mit dem UV-Vernetzer.
5. Isolieren tOtale RNA aus HeLa-Zellen durch Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion nach dem Protokoll des Herstellers. 1: 1 Volumen Isopropanol zugeben, um die RNA bei Raumtemperatur für 30 min auszufällen.
   Pausenpunkt: RNA kann bei -20 ° C in Isopropanol auf unbestimmte Zeit gelagert werden. Ein Punktblot kann bei diesem Schritt durchgeführt werden, um zu überprüfen, ob biotinyliertes Psoralen erfolgreich in die Zellen eingetreten ist und in vivo vernetzte RNAs aufweist (Abbildung 2 ).
6. Zentrifugieren der ausgefällten RNA bei 20.000 xg für 30 min bei 4 ° C zur Gewinnung der RNA. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml 70% kaltes Ethanol zum RNA-Pellet hinzu, um die RNA zu waschen.
7. Die Proben bei 20.000 xg für 15 min bei 4 ° C zentrifugieren. Den Überstand entfernen und das Pellet 5 min bei Raumtemperatur abtrocknen lassen.
8. Fügen Sie dem RNA-Pellet nukleasefreies Wasser hinzu und quantifizieren Sie die Konzentration von RNA mit UV-Spektrometer.
   Pause Punkt: RNA kann bei -80 ° C nach f gespeichert werdenEinfrieren in flüssigem Stickstoff.

2. RNA Fragmentierung

1. 15 ul 2x RNA-Fragmentierungspuffer und 10 μl der RNA-Probe (1 μg / μL) einzeln in 0,2 ml PCR-Röhrchen bei 95 ° C für 1 min vorheizen. Mischen Sie 10 & mgr; l des erhitzten 2 × RNA-Fragmentierungspuffers mit 10 & mgr; l RNA-Probe durch Pipettieren auf und ab. Inkubieren Sie die Probe bei 95 ° C für 5 min. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Reaktion auf Eis abkühlen.
2. Übertragen und bündeln die 2 Fragmentierungsreaktionen auf ein 1,5 mL Mikrofugenröhrchen. Fügen Sie der Reaktion 10 μl nukleasefreies Wasser zu, 10 μl 3 M Natriumacetat, 1 μl Glykogen und 300 μl 100% Ethanol zur Fragmentierungsreaktion. Inkubieren der RNA bei -20 ° C für mindestens 1 h, um die RNA auszufällen.
3. Die ausgefällte RNA wird bei 20.000 xg für 30 min zentrifugiert, den Überstand entfernt und die RNA mit 1 ml 70% igem Ethanol gewaschen.
4. Die RNA bei 20.000 xg für 15 min zentrifugieren, remÜber den Überstand und löst die RNA in 20 μl nukleasefreiem Wasser auf.

3. RNA Größenauswahl und Elution

1. Füge 20 μl RNA-Beladungsfarbstoff zu der gewonnenen RNA im Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Die RNA mit dem RNA-Beladungsfarbstoff bei 95 ° C für 3 min erhitzen und 2 min auf Eis geben.
2. Füge 3 μl RNA-Beladungsfarbstoff zu 0,25 μl 10 nt DNA-Leiter in ein Mikrofugenröhrchen hinzu. Die Leiter bei 95 ° C für 3 min erhitzen und 2 min auf Eis geben.
3. Legen Sie die denaturierte Leiter und Proben auf ein 8,6 cm x 6,8 cm 6% TBE Harnstoffgel und Größenfraktionierung durch Elektrophorese für 40 min bei 180 V. Färben Sie das Gel in 10 ml TBE-Puffer mit 1: 10.000 Nukleinsäure Gel Fleck für 5 Min im Dunkeln.
4. Punktion eines sauberen 0,6 mL Mikrofugenröhrchens an der Unterseite mit einer 24 G Nadel und legen Sie sie in ein 2 mL Mikrofugenröhrchen.
5. Visualisieren Sie die Banden auf dem nachgefärbten Gel mit einem Transilluminator und schneiden Sie eine Gelscheibe entsprechend 90-110 nt. Übertragen Sie die Gelscheibe in das durchbohrte 0,6 mL Mikrofugenröhrchen im 2 mL Mikrofugenröhrchen. Diese Größenauswahl wird durchgeführt, um zu ermöglichen, dass die chimären Fragmente eine minimale Länge aufweisen, um dem Transkriptom zuzuordnen und zwischen den Proximitätsligierten Produkten gegenüber den unligierten Produkten in den nachgeschalteten Größenauswahlschritten zu unterscheiden.
6. Die Gelscheiben bei 12.000 xg bei Raumtemperatur für 2 min zentrifugieren, um die Gelscheibe zu zerkleinern und in dem 2 ml-Mikrofugenröhrchen zu sammeln. Das leere 0,6 mL Mikrofugenröhrchen verwerfen. Fügen Sie 700 μl Elutionspuffer zu der zerkleinerten Gelscheibe in dem 2 ml-Mikrofugenröhrchen hinzu und inkubieren Sie bei 4 ° C über Nacht mit konstanter Rotation, um eine Diffusion der Proben in den Puffer zu ermöglichen.
7. Übertragen Sie die Gelscheiben und den Elutionspuffer in ein Zentrifugenröhrchenfilter und zentrifugieren Sie bei 20.000 xg für 2 min. Die Gelscheiben werden im oberen Teil des Filters gefangen. Die Gelscheiben und das obere Fach verwerfen.
8. Füge 1 μl Glykogen und 7 hinzu00 & mgr; l 100% iges Isopropanol zum Filtrat in dem Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und die RNA bei -20 ° C für mindestens 1 h oder über Nacht ausfällt.
   Pausenpunkt: RNA kann in Isopropanol unbegrenzt bei -20 ° C ausgefällt werden.
9. Zentrifugieren der ausgefällten RNA bei 20.000 xg für 30 min bei 4 ° C zur Gewinnung der RNA. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml 70% kaltes Ethanol hinzu, um das RNA-Pellet zu waschen. Das gewaschene Pellet bei 20.000 xg für 15 min bei 4 ° C zentrifugieren.
10. Entfernen Sie den Waschpuffer und fügen Sie 20 μl nukleasefreies Wasser hinzu, um die RNA zu resuspendieren. Quantifizierung der Konzentration von RNA unter Verwendung eines UV-Spektrometers.
    Pause-Punkt: RNA kann bei -80 ° C nach dem Einfrieren von Flüssigkeiten in flüssigem Stickstoff gelagert werden.

4. Anreicherung von RNA-Vernetzungsregionen

1. Vortex-Streptavidin-beschichtete magnetische Kügelchen kräftig, um die Perlen homogen in der Röhre zu resuspendieren. Übertragen Sie 100 μl Perlen auf ein 1,5 ml Mikrofugenröhrchen und legen Sie es auf einen MagnetenIc für 1 min stehen lassen, damit die Perlen an der magnetischen Seite des Rohres haften können. Entfernen Sie den Vorratsbehälter vorsichtig aus den Perlen und nehmen Sie den Schlauch aus dem Magnetständer.
2. Füge 1 mL Lyse Puffer zu den Perlen in der Mikrofuge Rohr und Pipette auf und ab. Legen Sie die Mikrofuge mit Perlen auf den Magnetständer für 1 min, um die Perlen aus dem Waschpuffer zu trennen. Wiederholen Sie dies für insgesamt 3 Wäschen.
3. Entfernen Sie den Waschpuffer aus den Perlen, indem Sie die Mikrofuge mit Perlen auf den Magnetständer für 1 min legen. Füge RNase-Inhibitor (1: 200) zum Lysepuffer hinzu und füge 100 μl Lysepuffer zu den gewaschenen Perlen in der Mikrozentrifugenröhre hinzu.
4. 2 ml frisch zubereiteter Hybridisierungspuffer, 1 ml supplementierter Lysepuffer, 1,5 μg größenfraktionierte RNA und 100 μl resuspendierte Perlen in ein 15 ml konisches Zentrifugenröhrchen geben. Vorwärmen Sie die Röhre sanft.
5. Inkubieren Sie das 15 ml konische Zentrifugenröhrchen bei 37 ° C für 30 min mit End-End-Rotation.Den Waschpuffer bei 37 ° C vorwärmen.
6. Legen Sie die 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen 2 Minuten lang auf einen Magnetständer für 15 ml Röhrchen, um die Perlen aus dem Puffer zu trennen. Puffer den Puffer vorsichtig aus dem Tubus und verwerfe ihn.
7. Füge 1 ml vorgewärmter Waschpuffer zu den Perlen hinzu, pipette auf und ab und transferiere die Perlen in ein 1,5 mL Mikrofugenröhrchen. Inkubieren an den Perlen bei 37 ° C für 5 min, mit End-End-Drehung.
8. Den Inhalt des Mikrofugenröhrchens kurz zentrifugieren Legen Sie die 1,5 ml gewaschenen Perlen in Mikrofugenröhrchen auf einem Magnetständer für 2 ml Röhrchen für 1 min, um die Perlen aus dem Waschpuffer zu trennen. Entfernen Sie den Puffer aus den Perlen, indem Sie den Puffer vorsichtig aus dem Mikrofugenröhrchen pipettieren.
9. Füge 1 ml vorgewärmter Waschpuffer zu den Perlen hinzu und piplette auf und ab, um die Wäsche zu wiederholen. Führen Sie insgesamt 5 Wäschen aus. Am Ende der ^5. Waschung, entfernen Sie den Waschpuffer, indem Sie die Mikrofuge mit Perlen auf den Magnetständer legen1 Minute.

5. Proximity Ligation

1. Füge 1 ml kalten T4-Polynukleotidkinase (PNK) -Puffer zu den gewaschenen Perlen hinzu und inkubiere die Perlen für 5 min bei 4 ° C mit End-End-Rotation. Legen Sie das Mikrofugenröhrchen mit den Perlen auf den Magnetstreifen für 1 min und entfernen Sie vorsichtig den T4 PNK-Puffer. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt 2 Wäschen und entfernen Sie den T4 PNK Puffer nach der letzten Wäsche.
2. Füge Puffer zu den Perlen hinzu, gemäß Tabelle 1 . Um die 3'-Enden des RNA-Fragments zu linieren, werden die Perlen im Puffer bei 37 ° C für 4 h mit konstantem Rühren inkubiert, um die 3'-cyclische Phosphatgruppe am Ende der RNA zu konvertieren 3 'OH
3. Füge Puffer zur vorherigen Reaktion hinzu, gemäß Tabelle 2 . Um das 5'-Ende der RNA-Fragmente als ligationskompetent zu aktivieren, inkubieren die Reaktion bei 37 ° C für 1 h unter konstantem Rühren in Gegenwart von ATPUm 5 'OH auf die RNA zu 5'-Phosphat umzuwandeln.
4. Füge Puffer zur vorherigen Reaktion hinzu, um die Näherungsligatur gemäß Tabelle 3 durchzuführen. Inkubieren Sie die Reaktion bei 16 ° C für 16 h unter konstantem Rühren,
5. Legen Sie die Mikrofuge, die die ligierte RNA enthält, auf einen Magnetständer für 1 min. Entfernen Sie den Überstand sorgfältig und fügen Sie 1 ml Raumtemperatur-Waschpuffer zu den Perlen hinzu. Resuspend durch Pipettieren auf und ab.
6. Legen Sie das Mikrofugenröhrchen 1 min auf den Magnetständer und entfernen Sie den Waschpuffer sorgfältig. Führen Sie insgesamt 2 Waschungen aus und entfernen Sie den Waschpuffer aus den Perlen am Ende der zweiten Wäsche.
7. 100 & mgr; l RNA PK Puffer zu den Perlen geben und durch Pipettieren auf und ab resuspendieren. Die Proben bei 95 ° C für 10 min auf einem Heizblock erhitzen.
8. Die Probe auf Eis für 1 min kühlen lassen und der Probe 500 μl Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform zugeben. Mischen durch kräftiges Vorspülen für 10 s. Inkubieren Sie die MischungRe bei Raumtemperatur für 10 min.
   Pause-Punkt: RNA kann in Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform bei -80 ° C für ein paar Monate gelagert werden.
9. Füge 100 μl Chloroform zu den Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-extrahierten Proben hinzu. Vortex kräftig für 10 s. Die Proben bei 20.000 xg für 15 min bei 4 ° C zentrifugieren.
10. Übertragen Sie 400 μl der wässrigen Schicht auf ein neues 1,5 mL Mikrofugenröhrchen. Füge 800 μl (2 Volumina) 100% iges Ethanol hinzu und vermische durch Pipettieren auf und ab.
11. Übertragen Sie die RNA-Lösung auf RNA-Cleanup-Säulen und erholen Sie die RNA nach Anweisungen des Herstellers, um sicherzustellen, dass auch kleine RNAs beibehalten werden. Eluieren Sie die RNA in 100 & mgr; l nukleasefreies Wasser.
    Pause-Punkt: RNA kann bei -80 ° C nach dem Einfrieren von Flüssigkeiten in flüssigem Stickstoff gelagert werden.

6. Umgekehrte Vernetzung von biotinyliertem Psoralen

1. Übertragen Sie die 100 μl der eluierten Proben in eine Vertiefung eines 24-Well-Plaß. Entfernen Sie die Abdeckung und bestrahlen Sie die Probe unter UV 254 nm, für 5 min auf Eis.
2. Übertragen Sie die umgekehrte vernetzte Probe auf ein sauberes Mikrofugenröhrchen. 10 μl Natriumacetat, 1 μl Glykogen und 300 μl 100% iges Ethanol zugeben und die RNA bei -20 ° C für mindestens 1 h oder über Nacht ausfallen.
   Pausenpunkt: RNA kann in Ethanol unbegrenzt bei -20 ° C ausgefällt werden.
3. Zentrifugieren der ausgefällten RNA bei 20.000 xg für 30 min bei 4 ° C zur Gewinnung der RNA. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml 70% kaltes Ethanol hinzu, um das RNA-Pellet zu waschen.
4. Das gewaschene Pellet bei 20.000 xg für 15 min bei 4 ° C zentrifugieren. Entfernen Sie den Waschpuffer und fügen Sie 4,25 μl nukleasefreies Wasser hinzu, um die RNA zu resuspendieren. Übertragen Sie die RNA auf eine 0,2 ml PCR-Röhre.
   Pause-Punkt: RNA kann bei -80 ° C nach dem Einfrieren von Flüssigkeiten in flüssigem Stickstoff gelagert werden.

7. Reverse Transkription und cDNA-Zirkularisierung

1. Füge 0,75 μl hinzuDes RNA-Linkers (0,5 & mgr; g / & mgr; l) zu der resuspendierten Probe in der PCR-Röhre und erhitze bei 80 ° C für 90 s. Legen Sie die Probe 2 Minuten auf Eis.
2. Füge die Puffer zu der denaturierten Probe für 3 'Adapterligatur gemäß Tabelle 4 hinzu. Inkubieren Sie die Reaktion bei 25 ° C für 2,5 h.
3. Übertragen Sie die Reaktion auf ein 1,5 mL Mikrofugenröhrchen. Füge 90 & mgr; l nukleasefreies Wasser zu der Reaktion hinzu, gefolgt von 10 & mgr; l Natriumacetat, 1 & mgr; l Glykogen und 300 & mgr; l 100% Ethanol. Fälligkeit der RNA bei -20 ° C für mindestens 1 h oder über Nacht.
   Pausenpunkt: RNA kann in Ethanol unbegrenzt bei -20 ° C ausgefällt werden.
4. Zentrifugieren der ausgefällten RNA bei 20.000 xg für 30 min bei 4 ° C zur Gewinnung der RNA. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml 70% kaltes Ethanol hinzu, um das RNA-Pellet zu waschen.
5. Zentrifugieren des gewaschenen Pellets bei 20.000 g für 15 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Waschpuffer, um das Pellet in 5 μl Nuklease frei zu entfernenAter
6. Füge 5 μl RNA-Beladungsfarbstoff zu der gewonnenen RNA im Mikrofugenröhrchen hinzu. Die RNA mit dem RNA-Beladungsfarbstoff bei 95 ° C für 3 min erhitzen und 2 min auf Eis geben.
7. Füge 3 μl RNA-Beladungsfarbstoff zu 0,25 μl 10 nt DNA-Leiter in ein Mikrofugenröhrchen hinzu. Die Leiter bei 95 ° C für 3 min erhitzen und 2 min auf Eis geben.
8. Führen Sie die Größenfraktionierung mit 8,6 cm x 6,8 cm 6% TBE Harnstoffgel wie in den Schritten 3.3 und 3.4 durch.
9. Visualisieren Sie das Gel, das mit Nukleinsäurefärbung unter Verwendung des Transilluminators gefärbt ist, und schneiden Sie eine Gelscheibe, die 110-140 nt auf der Leiter entspricht. Übertragen Sie die Gelscheibe in das durchbohrte 0,6 mL Mikrofugenröhrchen im 2-mL-Mikrofugenröhrchen und folgen Sie dem Protokoll aus den Schritten 3.6- 3.9.
10. Füge 5 μl nukleasefreies Wasser hinzu, um das RNA-Pellet zu resuspendieren. Übertragen Sie die RNA auf eine 0,2 ml PCR-Röhre.
    Pause-Punkt: RNA kann bei -80 ° C nach dem Einfrieren von Flüssigkeiten in flüssigem Stickstoff gelagert werden.
11. 1 μl RT-Primer bei 1,25 zugeben81, M zur RNA im PCR-Röhrchen und Hitze bei 80 ° C für 2 min. Legen Sie die Probe 2 Minuten auf Eis.
12. Füge die Puffer für die reverse Transkription gemäß Tabelle 5 hinzu. Inkubieren Sie die Reaktion bei 50 ° C für 30 min.
13. Zugabe von 1,1 μl 1 N NaOH zur Reaktion und Hitze bei 98 ° C für 20 min. Die Reaktion auf Eis stellen.
14. Übertragen Sie die Reaktion auf ein 1,5 mL Mikrofugenröhrchen. Füge 90 & mgr; l nukleasefreies Wasser zu der Reaktion hinzu, gefolgt von 10 & mgr; l Natriumacetat, 1 & mgr; l Glykogen und 300 & mgr; l 100% Ethanol. Fälligkeit der DNA bei -20 ° C für mindestens 1 h oder über Nacht.
    Pausenpunkt: Die DNA kann in Ethanol unbegrenzt bei -20 ° C ausgefällt werden.
15. Zentrifugieren der ausgefällten DNA bei 20.000 g für 30 min bei 4 ° C, um die DNA zu gewinnen. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml 70% kaltes Ethanol hinzu, um das DNA-Pellet zu waschen. Das gewaschene Pellet bei 20.000 xg für 15 min bei 4 ° C zentrifugieren. Entfernen Sie den Waschpuffer, um das Pel zu resuspendierenIn 5 μl nukleasefreies Wasser geben lassen.
16. Führen Sie die Größenfraktionierung mit 8,6 cm x 6,8 cm 6% TBE Harnstoffgel wie in den Schritten 3.3 und 3.4 durch.
17. Visualisieren Sie das nachgefärbte Gel mit dem Transilluminator und schneiden Sie eine Gelscheibe entsprechend 200-240 nt auf der Leiter. Die reverse transkribierte cDNA ist nun 96 Basen länger als das RNA-Fragment aufgrund der Zugabe des 96-Base-RT-Primers. Übertragen Sie die Gelscheibe in das durchbohrte 0,6 mL Mikrofugenröhrchen im 2 mL Mikrofugenröhrchen.
18. Die Gelscheiben bei 12.000 xg bei Raumtemperatur für 2 min zentrifugieren, um die Gelscheibe zu zerkleinern und in dem 2 ml-Mikrofugenröhrchen zu sammeln. Das leere 0,6 mL Mikrofugenröhrchen verwerfen.
19. Fügen Sie 700 μl Elutionspuffer zu der zerkleinerten Gelscheibe in dem 2 ml-Mikrofugenröhrchen hinzu und inkubieren bei 37 ° C für 2 h bei konstanter Rotation. Folgen Sie dem Protokoll wie in den Schritten 3.7- 3.8 beschrieben.
20. Füge 6 μl nukleasefreies Wasser hinzu, um das DNA-Pellet zu resuspendieren. Übertragen Sie die DNA auf eine 0,2 ml PCR-Röhre.
    Pausenpunkt: Die DNA kann bei -80 ° C nach dem Einfrieren von Flüssigkeiten in flüssigem Stickstoff gelagert werden.
21. Füge die Puffer zur Reaktion zur cDNA-Zirkularisierung gemäß Tabelle 6 hinzu. Die Reaktion wird bei 60 ° C für 1 h inkubiert und bei 80 ° C für 10 min erhitzt, um die Reaktion zu inaktivieren.
22. Übertragen Sie die Reaktion auf ein 1,5 mL Mikrofugenröhrchen. Reinigen Sie die zirkularisierte cDNA unter Verwendung einer DNA-Bereinigungskolonne nach den Anweisungen des Herstellers. Füge 20 & mgr; l nukleasefreies Wasser zu der Säule hinzu, um die gereinigte cDNA zu eluieren.
    Pause Punkt: DNA kann bei -20 ° C für ein paar Monate gelagert werden.

8. PCR-Verstärkung (Small Scale PCR)

1. Fügen Sie die Puffer der Reaktion gemäß Tabelle 7 für die PCR-Amplifikation hinzu, um die minimale Anzahl von Zyklen zu untersuchen, die für die Bibliotheksverstärkung erforderlich sind.
2. Stellen Sie die PCR-Zyklusbedingungen gemäß Tabelle 8 ein . Anregung der Reaktion und Übertragung von 5 μlDie PCR-Reaktion bei 10, 15 und 20 Zyklen, in separate 1,5 mL Mikrofugenröhrchen.
3. Füge 1 μl 6x DNA-Gel-Beladungsfarbstoff zu jeder der 5 μL PCR-Reaktion in den verschiedenen Zyklen hinzu. Führen Sie die Gelelektrophorese auf einem 3% igen Agarosegel bei 120 V für 1 h durch, um die PCR-Produkte zu visualisieren.
   1. Verwenden Sie die niedrigste Anzahl von PCR-Zyklen (Y), die eine Verstärkung bei etwa 250 Basen aufweisen (In Abbildung 3 gibt es eine starke Bande bei 15 Zyklen der Amplifikation und eine schwache Bande bei 10 Zyklen. 12 Zyklen der PCR-Amplifikation in großem Maßstab sind wahrscheinlich Erzeugen genug Material für die Tiefensequenzierung, da die Menge an verwendeter cDNA das 10-fache derjenigen der PCR-Amplifikation kleiner ist).

9. PCR-Amplifikation (Large Scale PCR) und Reinigung

1. Füge die Puffer der Reaktion gemäß Tabelle 9 zur PCR-Amplifikation für PCR mit großem Maßstab hinzu.
2. Stellen Sie die PCR - Radfahrbedingungen nachTabelle 10
3. Füge 5 μl 6x DNA-Gel-Beladungsfarbstoff zu der 25 μl PCR-Reaktion hinzu und lasse in eine Vertiefung eines 3% Agarosegels ein. Laden Sie 1 kb plus DNA-Leiter in einen separaten Brunnen. Führen Sie die Gelelektrophorese bei 100 V für 1,5 h durch.
4. Das fertiggestellte Gel mit einem UV-Transilluminator visualisieren.
5. Größe entnimmt eine Gelscheibe, die PCR-Produkte von 200- 300 Basen enthält und das Gel auf ein sauberes 2-ml-Mikrofugenröhrchen überführt.
6. Füge 1 ml Gellöslichkeitspuffer aus einem DNA-Gel-Extraktionskit zu der Gelscheibe hinzu und inkubiere bei Raumtemperatur für 30 min oder bis das Gel unter konstantem Rühren auflöst.
7. Füge dem gelösten Gel 200 μl Isopropanol zu und vermische gut durch Pipettieren. Übertragen Sie 700 μl der Probe auf eine DNA-Gel-Extraktions-Säuberungssäule und zentrifugieren Sie bei 13.000 xg für 30 s. Halten Sie die gelöste Probe auf die Säule, bis die gesamte Probe auf die Säule geladen wurde.
8. Fügen Sie 500 μl Gel Löslichkeit Puffer,Gefolgt von 700 μl Säulenwaschpuffer, in die Säule, entsprechend dem Protokoll des Herstellers. Füge 12 μl nukleasefreies Wasser in die Mitte der Säule hinzu, um der DNA zu entgehen. Pausenpunkt: DNA kann bei -20 ° C gelagert werden.
9. Quantifizierung der Konzentration der DNA mittels fluorometrischer Quantifizierung. Wenn mehrere Bibliotheken für die Sequenzierung konstruiert und zusammengefaßt werden, fügen Sie die gleiche Menge jeder Probe dem Pool hinzu, für eine hohe Durchsatzsequenzierung.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt den Schema des SPLASH-Workflows. Bei der Zugabe von biotinyliertem Psoralen in Gegenwart von 0,01% Digitonin und UV-Vernetzung wird die Gesamt-RNA aus den Zellen extrahiert und ein Punkt-Blot wird durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Vernetzung von biotinyliertem zu der RNA effizient erfolgt ist (Abbildung 2 ). Wir verwenden biotinylierte 20-Basen-Oligos als positive Kontrollen, um die Menge an biotinyli...

Diskussion

Hier beschreiben wir im Detail den experimentellen und rechnerischen Workflow für SPLASH, eine Methode, die es uns ermöglicht, paarweise RNA-Interaktionen genomweit zu identifizieren. Wir haben erfolgreich SPLASH in Bakterien-, Hefe- und menschlichen Kulturen eingesetzt und erwarten, dass die Strategie weitgehend auf verschiedene Organismen unter verschiedenen zellulären Zuständen angewendet werden kann. Einer der kritischen Schritte im Protokoll ist, mit mindestens 20 μg vernetzten RNA zu beginnen, um ausreichend ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10787026	DNA ladder
10 bp DNA ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10821-015	DNA ladder
20% SDS solution	First BASE	BUF-2052-1L
20x SSC	First BASE	BUF-3050-20X1L
3.0 M Sodium Acetate Solution	First BASE	BUF-1151-1L-pH5.2	Required for nucleic acid precipitation
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1	Bio-Rad	1610145	TBE Urea gel component
Ambion Buffer Kit	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM9010
Ammonium Persulfate, Molecular Grade	Promega	V3131	TBE Urea gel component
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
Chloroform	Merck	1.02445.1000	RNA extraction
Single strand DNA ligase	Epicentre	CL9025K	CircLigase II ssDNA Ligase
Centrifuge tube filters	Sigma-Aldrich	CLS8160-96EA	Costar Spin-X centrifuge tube filters
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE	Sigma-Aldrich	D5628-1G	For cell treatment
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	Dark Reader DR89X Transilluminator	Blue light transilluminator
DNA Gel Loading Dye (6x)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	R0611	Required for agarose gel electroporation
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Pan BioTech	P04-03500	For Hela cell culture
Streptavidin magnetic beads	Life Technologies Holdings Pte Ltd	65002	Dynabeads MyOne Streptavidin C1
Magnetic stand for 15 mL tubes	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12301D	DynaMag-15
Magnetic stand for 15 mL tubes	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12321D	DynaMag-2
ThermoMixer	Eppendorf	5382 000.015	Eppendorf ThermoMixer C
Biotinylated psoralen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	29986	EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL	Hitachi	F8T5/BL	365 nm UV bulb
Fetal Bovine Serum	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10270106	Components of Hela medium
Formamide	Promega	H5052	Component in hybridization buffer
G8T5	Sankyo-Denki	G8T5	254 nm UV bulb
Glycogen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10814010	Required for nucleic acid precipitation
Nanodrop	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Nanodrop 2000	Spectrophotometer for nucleic acidquantification
Nuclease free water	First BASE	BUF-1180-500ml
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15140122	Components of Hela medium
High-Fidelity DNA polymerase (2x)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	F531L	Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x)
Primers Set 1	New England Biolabs	E7335L	PCR primers
DNA Gel Extraction Kit	QIAgen	28106	QIAquick Gel Extraction Kit
Fluorometric Quantification kit	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Q32854	Qubit dsDNA HS Assay Kit
RNA clean up kit	Qiagen	74106	RNeasy Mini Kit Silica-membrane column
Rnase Inhibitor	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM2696	SUPERase In
Reverse transcriptase	Life Technologies Holdings Pte Ltd	18080400	SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix
Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies Holdings Pte Ltd	S11494	SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201L	End repair enzyme
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L	Enzyme for proximity ligation
T4 RNA Ligase 2, truncated KQ	New England Biolabs	M0373L	Enzyme for adaptor ligation
Temed	Bio-Rad	1610801	TBE Urea gel component
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15596018	TRIzol® Reagent for RNA extraction
Urea	First BASE	BIO-2070-5kg
UV crosslinker	Stratagene	400072	UV Stratalinker 1800
UV Transilluminator	UVP	95-0417-01	For visualizing of bands
Xylene Cyanol FF	Sigma-Aldrich	X4126-10G
DNA cleanup it	Zymo Research	D4004	Zymo DNA concentrator-5
List of software required
FastQC software	0.11.4	http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep software	1.0.7	https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA software	0.7.12	http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS software	1.2.1	http://www.htslib.org/
PULLSEQ software	1.0.2	https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR software	2.5.0c	https://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON script	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON script	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
pickJunctionReads.awk AWK script	AWK GNU 4.1.2	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Buffer composition
Elution buffer
0.3 M sodium acetate
Lysis Buffer
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer
100 mM NaCl
10 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
0.5% SDS
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add Superase-in fresh before use
2x SSC Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
2x RNA fragmentation buffer
18 mM MgCl2
450 mM KCl
300 mM Tris-Cl pH 8.3
2x RNA loading Dye
95% Formamide
0.02% SDS
0.02% bromophenol blue
0.01% Xylene Cyanol
1 mM EDTA
3' RNA adapter sequence: 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC
RT primer sequence: AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG