Zell Lineage Analysen und Genfunktion Studien mit Twin-Spot MARCM

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll für ein Mosaik Markierungstechnik, die die Visualisierung von Neuronen aus einer gemeinsamen Vorläuferzelle in zwei verschiedenen Farben abgeleitet ermöglicht. Dies erleichtert die neuronale Abstammungslinie Analyse mit der Fähigkeit, Geburts Datierung einzelner Neuronen und das Studium der Genfunktion in den gleichen Neuronen verschiedener Individuen.

Zusammenfassung

M osaic eine nalyse mit einem r epressible c ell m Arker (MARCM) ist ein positives Kennzeichnungssystem Mosaik , das in Drosophila Neurobiologie Studien weithin angewandt wurde komplizierte Morphologien darzustellen und die Funktion von Genen in Teilmengen von Neuronen innerhalb ansonsten unmarkierten und unbeirrt zu manipulieren Organismen. Genetische Mosaiken im MARCM System erzeugt werden durch ortsspezifische Rekombination zwischen homologen Chromosomen vermittelten Vorläuferzellen innerhalb Dividieren beide markiert (MARCM Klone) und unmarkierten Tochterzellen während der Mitose zu erzeugen. Eine Erweiterung des MARCM Methode, die so genannte Twin-Spot MARCM (tsMARCM), Etiketten sowohl der Zwillings von einem gemeinsamen Vorläufer mit zwei verschiedenen Farben abgeleiteten Zellen. Diese Technik wurde entwickelt, um das Abrufen nützlicher Informationen aus beiden Hemi-Abstammungslinien zu ermöglichen. Durch umfassend verschiedene Paare von tsMARCM Klone Analyse erlaubt die tsMARCM System mappin neuronale Abstammungslinie hochauflösenderg die genaue Geburtsfolge der markierten Neuronen aus gemeinsamen Vorläuferzellen produziert zu offenbaren. Ferner erstreckt sich die tsMARCM System auch Studien der Genfunktion durch die phänotypische Analyse von identischen Neuronen verschiedener Tiere ermöglicht. Hier beschreiben wir , wie die tsMARCM System anzuwenden Studien der neuronalen Entwicklung in Drosophila zu erleichtern.

Einleitung

Das Gehirn, die aus einer großen Anzahl und vielfältige Arten von Neuronen, ausstattet Tiere mit der Fähigkeit, Verfahren zu erkennen und zu Herausforderungen von der Außenwelt zu antworten. Neurone des adulten Drosophila zentralen Gehirn aus einer begrenzten Anzahl von neuralen Stammzellen, die so genannte Neuroblasten (NBS) abgeleitet wird , während der Entwicklung ^{1, 2.} Die meisten der NBS in Gehirn Neurogenese in Drosophila beteiligt laufen asymmetrische Teilung selbst erneuernden NBs und Ganglion Mutterzellen (GMCs) zu erzeugen, und die GMCs dann durch eine weitere Runde der Abteilung gehen zu zwei Tochterzellen zu produzieren, die in Neuronen ³ (Abbildung 1A unterscheiden ). Wegen der Kompliziertheit der neuronalen Morphologie und die Herausforderungen im Zusammenhang mit spezifischen Neuronen identifiziert, eine positive Mosaik Etikettiertechnik, Mosaik-Analyse mit einer repressible Zellmarker (MARCM) wurde erfunden, die visualizat zu ermöglichenIon eines einzelnen Neurons oder einer kleinen Untergruppe von Neuronen aus der Bevölkerung der Umgebung, nicht markierten Neuronen ^4.

MARCM nutzt die Flippase (FLP) / FLP Erkennungsziel (FRT) System ⁴ ortsspezifische Rekombination zwischen homologen Chromosomen in einer Teilungsvorläuferzelle Durchführung eines heterozygoten Allel eines Repressor - Gen, dessen Expression normalerweise hemmt die Expression eines Reportergens zu vermitteln. Nach der mitotischen Teilung werden die rekombinanten Chromosomen in zwei Einzelzellen getrennt ist, so dass eine Zelle homozygot Allele des Repressor-Gen enthält, und die andere Zelle hat kein Repressorgen-die Expression des Reporter in dieser Zelle (und ihre Nachkommen) nicht mehr ⁴ blockiert. Drei klonalen Muster sind in der Regel in einem Experiment gefunden MARCM wenn FLP stochastisch in NBs oder GMCs induziert wird: single-cell und zweizelligen-GMC-Klone, die neuronale Morphologie auf Einzelzell resolutio darstellenn und mehrzelligen-NB - Klone, die aus einer gemeinsamen NB (1B) abgeleitet gesamten morphologischen Muster von Neuronen offenbaren. Die MARCM Technik wurde in Drosophila Neurobiologie Studien weit angewendet worden, einschließlich der neuronalen Typerkennung für die Rekonstruktion des Gehirns weiten Kabelnetze, neuronale Abstammungslinie Analysen in Zellschicksal Spezifikation und neuronalen Morphogenese die Entwicklungsgeschichte von Neuronen, phänotypischen Charakterisierung von Gen - Funktionen beteiligt für die Offenlegung von und Differenzierungsstudien ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Denn nur herkömmliche MARCM eine der beiden Tochterzellen-Etiketten (und Linien) nach der mitotischen Rekombinationsereignis induziert, möglicherweise nützliche Informationen aus der unmarkierten Seite verloren. Diese Einschränkung schließt die Anwendung der Grund MARCM System hochauflösende Analysen vieler neuronaler Linien, die Zellschicksalen in schnellem Tempo oder Präzision umschalten Analysen von Genfunktionen in identischen Neuronen verschiedener Tiere ^{11, 12.}

Twin-Spot MARCM (tsMARCM) ist ein fortschrittliches System , das von einem gemeinsamen Vorläufer mit zwei verschiedenen Farben abgeleitet Neuronen - Etiketten, die die Rückgewinnung von nützlichen Informationen von beiden Seiten der Doppelzellen ermöglicht, so dass die Begrenzung des ursprünglichen MARCM System zu überwinden ¹¹ ( 2A - 2C). Im tsMARCM System werden zwei RNA - Interferenz (RNAi) -basierte Suppressoren an trans-Stellen von homologen Chromosomen in einer Vorläuferzelle angeordnet sind, und die Expression dieser Suppressoren unabhängig die Expression ihrer jeweiligen Reporter (2B) hemmen. Im Anschluss an die ortsspezifische mitotische Rekombination vermittelt durch das FLP / FRT-System, das two RNAi-basierte Suppressoren getrennt werden in zwei Einzelzellen , die Expression von verschiedenen Reportern (2B) zu ermöglichen. Zwei klonalen Muster, single-Zelle , die mit Single-Zell - Klonen und zwei-cell-GMC zugeordnet mehrzelligen-NB - Klone, werden typischerweise in einem tsMARCM experiment (2C) zu sehen. Information von einer Seite der Doppelzellen abgeleitet sind, können als die Referenz für die andere Seite verwendet werden, wodurch hochauflösende neuralen lineage wie Geburten Datieren des markierten Neuronen Analysen und phänotypische Analyse von identischen Neuronen in verschiedenen Tieren, die für die genaue Untersuchung neuronaler Genfunktion ^{11, 12.} Hier präsentieren wir eine Schritt- für -Schritt - Protokoll beschreibt , wie ein tsMARCM Experiment durchzuführen, die von anderen Laboratorien verwendet werden , können ihr Studium der neuronalen Entwicklung (sowie die Entwicklung von anderen Geweben, wo zutreffend) in Drosophila zu erweitern.

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Protokoll

1. Erstellen Sie tsMARCM-ready Flies Anwendung des erforderlichen Transgene ^{11, 13}

1. Generieren Sie die ursprüngliche Version von tsMARCM-ready fliegt von Transgenen, die von einzelnen Fliegen getragen werden ¹¹ (siehe Tabelle 1). Zuführen Standard fly genetische Kreuzungsschemata, die zuvor beschrieben wurden, um ¹³ mehrere Transgene in den gleichen fly Aktien setzen.
   1. In einer Elternlinie, montieren die Transgene von FRT ^40A, UAS-mCD8 :: GFP (der erste Reporter, mCD8 :: GFP; Expression des Transgens unter der Kontrolle des Upstream - Aktivierungssequenz Promotor ist, die eine Membran-gebundenen Reporter erzeugt von Maus - Cluster von Proteindifferenzierung 8 mit grün fluoreszierenden Protein fusioniert) und UAS-rCD2RNAi (Suppressor, die die Expression des zweiten Reporter hemmt, die RNAi gegen die Expression von Ratten - Cluster of Differenzierung 2, RCD2) auf dem linken Arm des Chromosoms 2 ^nd. Ort gewebespezifische -GAL4 Treiber auf dem X oder ^3. Chromosom, falls möglich.
   2. In der anderen Elternlinie, montieren die Transgene von FRT ^40A, UAS-RCD2 :: RFP (der zweite Reporter, RCD2 :: RFP, die andere Membran-gebundenen Reporter aus RCD2 Protein mit rot fluoreszierendes Protein fusioniert) und UAS-GFPRNAi (der Suppressor, der die Expression mCD8 :: GFP hemmt, die RNAi gegen die Expression von gfp) auf dem linken Arm des Chromosoms 2 ^nd. Platzieren Hitzeschock (hs) -FLP oder Gewebe-Spezifität FLP auf das X oder ^3. Chromosom, wenn möglich.
2. Generieren Sie die neue Version von tsMARCM-ready fliegt von Transgenen, die von einzelnen Fliegen getragen werden ¹⁴ (siehe Tabelle 1). Führen Sie Standard-fly genetischen Kreuzungsschemata, die p beschrieben wurdenreviously, durch mehrere Transgene in den gleichen Flug Aktien ¹³ setzen.
   1. In einer Elternlinie, montieren die Transgene einer FRT - Stelle und UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (ein kombiniertes Transgen mCD8 :: GFP und den Suppressor, die die Expression von RCD2 :: RFP hemmt) zusammen im selben Arm der ^2. oder ^3. Chromosom (entsprechende Paare von Transgenen von FRT und UAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i sind in Tabelle 1 angegeben). Platzieren gewebsspezifische-GAL4 - Treiber auf den Chromosomen anderen als dem Chromosom des gewählten FRT - Stelle, falls möglich.
   2. In der anderen Elternlinie, montieren die Transgene einer FRT - Stelle und UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPI (den anderen verbundenen Transgen RCD2 :: RFP und den Suppressor, die die Expression von mCD8 :: GFP hemmt) im selben Arm der ^2. oder ^3. Chromosom (geeignete Paare von Transgenen von FRT und UAS-rCD2.RFP.UAS-GFPI sind in Tabelle 1) angegeben. Ort hs-FLP oder gewebespezifische FLP-on Chromosome anderen als dem Chromosom des Standortes gewählt FRT, falls möglich.

2. Quer tsMARCM-ready Fliegen zu tsMARCM Klone in ihren Nachkommen generieren

1. Kreuz tsMARCM-ready Fliegen zusammen (zB setzen 10-15 männlichen Fliegen aus Schritt 1.1.1 oder 1.2.1 und 20-30 jungfräulichen Weibchen aus Schritt fliegt 1.1.2 oder 1.2.2 zusammen) in einem Fly-Essen Fläschchen mit frischem -Aus Hefe-Paste an der Wand des Gefäßes.
2. Pflegen Sie die gekreuzten tsMARCM-ready Fliegen bei 25 ° C für 2 Tage, um die Chance der Paarung zu verbessern, bevor befruchteten Eier zu sammeln.
3. Häufig übertragen die gekreuzten tsMARCM-ready Fliegen in frisch yeasted Fläschchen Verdrängung zu vermeiden (tippen Sie die Fliegen oder Kohlendioxid verwenden, um die Fliegen zu betäuben den Transfer zu erleichtern, halten nicht mehr als 80 bis 100 befruchtete Eier in einen 10-ml Fliegen-Food überl zu vermeiden, dass zu viele geschlüpften Larven).
4. Kultur die tsMARCM Tiere (dh befruchtete Eier, ein Beispiel des Genotyps tsMARCM Tiere, wie verwendet in Abbildung 3 ist hs-FLP ^[22], w / w; UAS-mCD8 :: GFP, UAS-rCD2RNAi, FRT ^40A , GAL4-GH146 / UAS-RCD2 :: RFP, UAS-GFPRNAi, FRT ^40A; +; +), die in den seriell übertragen Fläschchen bei 25 ° C gelegt wurden , bis sie auf die gewünschten Stufen (zB Embryonen, Larven entwickeln, oder Puppen).
5. Legen Sie die übertragenen Fläschchen, die tsMARCM Tiere in der gleichen Entwicklungsstufe zu einem 37 ° C Wasserbad enthalten für 10, 20, 30, 40 und 50 Minuten, um die optimale Zeit der Hitzeschock, um zu bestimmen, welche die Expression von FLP induziert zu erzeugen, die tsMARCM Klone von Interesse. Überspringen Sie diesen Schritt , wenn Gewebe-Spezifität FLP ist in der tsMARCM Experiment verwendet wird (hs-FLP ist für neuronale Linie bevorzugt analysiert; die Gründe für diese Einstellung zuvor ¹⁵ beschrieben worden ist).
   HINWEIS: Wiederholen Sie Schritt 2.5 die optimale Zeit des Hitzeschock in Zukunft tsMARCM Experimente, wenn mehr tsMARCM Klone von Interesse verwendet werden wollte; Im Allgemeinen wird in hs-FLP mehr FLP Expression induziert ^[22] im Vergleich zu hs-FLP ^[1] mit der gleichen Hitzeschock - Zeit.
6. Kultur, die einem Hitzeschock tsMARCM Tiere bei 25 ° C, bis sie die entsprechende Entwicklungsstufe erreicht, und dann gehen Sie zu Schritt 3.

3. Bereiten Sie, Beize und Mount Fly Gehirne mit einem Gehalt tsMARCM Clones

1. Bereiten Sie zangen Schutz Gerichte. Mischen Sie Teil A (30 g) und Teil B (3 g) des Silikon-Elastomer-Kit mit Aktivkohle (0,25 g). Gießen Sie die Mischung in die entsprechenden Gerichte.
2. Präparieren Larven-, pupal oder Erwachsenen-Gehirn aus der tsMARCM Tiere in 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Zange auf einem zangenSchutzSchale betrachtet durch eine Dissektion Mikroskop. HINWEIS: Ein Protokoll für das Fliegen Gehirnsezierung wurde abribed ¹⁶ zuvor.
3. Fix the fly Gehirn in einem Glas Tüpfelplatte mit 1x PBS für 20 min 4% Formaldehyd bei Raumtemperatur enthält. Verarbeiten Sie die Fliege Gehirne in diesem Glas Tüpfelplatte für den Rest der Schritte.
4. Spülen Sie die Fliege Gehirne dreimal mit 1% PBT (1x PBS mit 1% Triton X-100) und waschen Sie sie dreimal für je 30 min in 1% PBT (rinse: entfernen PBT und fügen Sie neue PBT schnell; waschen: entfernen PBT, fügen Sie neue PBT, und brüten die Fliege Gehirne in der neuen PBT einen Orbitalschüttler verwenden).
5. Inkubieren Sie die Fliege Gehirne mit der Mischung aus primären Antikörper über Nacht bei 4 ° C oder für 4 Stunden bei Raumtemperatur. Ein Beispiel der Mischung aus primärem Antikörper ist Ratte anti-CD8-Antikörper (1: 100), Kaninchen-Anti-DsRed-Antikörper (1: 800) und Maus-Anti-Bruchpilot (BRP) Antikörper (1:50) in 1% PBT, enthaltend 5% normalem Ziegenserum (NGS).
6. Spülen Sie die Fliege Gehirne dreimal mit 1% PBT, und dann waschen Sie sie dreimal für jeweils 30 min mit 1% PBT.
7. Inkubieren Sie die Fliege Gehirne mit der Mischung aus sekundären Antikörper über Nacht bei 4 ° C oder für 4 Stunden bei Raumtemperatur. Ein Beispiel für die Mischung von Sekundärantikörper ist Ziege-anti-Ratte-IgG-Antikörper mit grün-fluoreszierenden Farbstoff konjugiert ist (1: 800), Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, konjugiert mit gelb-fluoreszierenden Farbstoff (1: 800) und Ziege-anti-Maus konjugierte IgG-Antikörper mit weit rot-fluoreszierenden Farbstoff (1: 800) in 1% PBT mit 5% NGS.
8. Spülen Sie die Fliege Gehirne dreimal mit 1% PBT, und dann waschen Sie sie dreimal für jeweils 30 min mit 1% PBT. Montieren sie auf einem Mikroobjektträger mit einem Anti-Quenching-Reagenz. Setzen Sie ein Mikrodeckglas auf der Mikro Dia-the-fly Gehirne zu bedecken und zu schützen. Seal die Ränder des Mikrodeckglas und Mikro-Schlitten mit klarem Nagellack. Bewahren Sie diese montiert und versiegelt Gehirn Proben bei 4 ° C fliegen.

Nehmen 4., Prozess- und Analysieren Fluoreszenzbilder von tsMARCM Clones

1. Erfassen Fluoreszenzbilder von tsMARCM Klone from die Proben in Schritt 3.8 mit der konfokalen Mikroskopie System der Wahl erstellt.
2. Projektstapel tsMARCM konfokalen Fluoreszenzbildern in zweidimensionalen, abgeflachten Bilder die Bildverarbeitungs - Software mit dem konfokalen Mikroskopiesystem der Wahl zugeführt (siehe Figur 3B - 3E, 3G - 3J, 3L - 3O und 3Q - 3T für Beispiele von abgeflachten konfokale Fluoreszenzbilder).
3. Zählen der Zellanzahl der mehrzelligen-NB Seiten der tsMARCM Klone eine geeignete Bildverarbeitungssoftware (beispielsweise die "Zellzähler" -Funktion in ImageJ ^17; siehe Figur 3E, 3J, 3O und 3T für die Beispiele der Zelle Leichen von Neuronen).

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Ergebnisse

Das tsMARCM System verwendet worden neuronale Abstammungslinie zu erleichtern Analysen und Genfunktion Studien durch Abrufen wichtiger Informationen zu Neuronen aus gemeinsamen NBs abgeleitet. Das System verwendet worden ist am meisten zu identifizieren (wenn nicht alle) neuronalen Typen, bestimmen die Zellzahl jeder neuronalen Typ, und ermitteln die Geburt Ordnung dieser Neuronen ^{11, 12, 18} (si...

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Diskussion

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls

Die Schritte 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5 und 3.2 sind von entscheidender Bedeutung für eine gute tsMARCM Ergebnisse zu erhalten. Gewebespezifische -GAL4 Treiber , die 1.1.1 und 1.2.1 für Schritte nicht GAL4 in neuralen Vorläuferzellen exprimieren , werden bevorzugt. Vermeiden Sie die Tiere über Anziehens in den Fly-Lebensmittel Fläschchen in Schritt 2,3 gezüchtet. Da die Induktion Latenz, das Expressionsniveau von FLP auf Hitzeschock, und di...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75x25	Mount fly brains
Micro cover glass No. 1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25 °C
(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37 °C
(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., ImageJ)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones