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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das primäre cilium ist von fundamentaler Bedeutung in neuralen Vorläuferzellproliferation, die neuronale Differenzierung, und adulten neuronalen Funktion. Hier beschreiben wir ein Verfahren ciliogenesis und den Handel mit Signalproteinen zu Zilien in neuralen Stamm- / Progenitorzellen und differenzieren Neuronen unter Verwendung von primären Kulturen Neurosphäre zu studieren.

Zusammenfassung

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

Einleitung

Das primäre cilium ist ein Mikrotubulus-basierte dynamischer subzellulären Kompartiment, das als sensorische Antenne in zellulären Signalweg koordinierenden, einschließlich der Sonic Hedgehog (Shh) -Weg während der embryonalen neuronalen Entwicklung 1, 2 und compartmentalized subzellulären Signalgebung in adulten neuronalen Funktion 3, 4 . Signalisierungs Komponenten dieser Wege, wie der Shh - Rezeptor 5 Patched; der Weg Aktivator Smoothened (Smo) 6; und Gpr161 7 ein Orphan - G - Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) , die sich negativ auf die Shh - Weg reguliert, lokalisieren Zilien in einer dynamischen Art und Weise. Multiple GPCRs wurde auf die Zilien in Neuronen im Gehirn 7, 8, 9, 10 lokalisieren berichtet sup>, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Defekte in Cilien und Zilien generierte Signalwege beeinflussen multiple Gewebe und werden als Ziliopathien 17, 18, 19 gemeinsam bekannt. Das Ziliopathie Krankheitsspektrum umfasst häufig die Entwicklung des Nervenstörung, wie kraniofazialen Anomalien 20, 21, 22. Außerdem regulieren primären Zilien in hypothalamischen Neuronen zentralen Sättigungswege und führen Defekte in 23 zentrale Fettleibigkeit, Übergewicht in syndromic Ziliopathien wie Bardet Biedel Syndrom 24 Spiegelung. Zusätzlich Signalisierungsneuropeptid-Rezeptor in Cilien reguliert central Sättigungsweg 11, 14. Ciliary Lokalisierung von Adenylylcyclase III (ACIII) und GPCRs wie Somatostatin - Rezeptor 3 in Hippokampus - Neuronen führt in neuartigen Objekterkennungsfehlern und Gedächtnisdefiziten 25, 26 und verläuft parallel einen Mangel an Integrität ciliary 27. Die Entwicklungsaspekte der Zilien-generated-Signalisierung sind eng mit Gewebshomöostase gebunden; insbesondere sind Zilien wichtig für die Progression von Shh-Subtyp Medulloblastom aus Granulat Vorläufern im Cerebellum 28, 29 entstehen. So spielen primäre Zilien eine wichtige Rolle während der Embryonalentwicklung, nach der Geburt, und adulter neuronaler Entwicklung und Funktion.

Neuronale Stammzellen (NSC) befinden sich in der Subventrikularzone (SVZ) der Seitenventrikel, die Subgranularzone des Gyrus dentatus des Hippocampus und derventrikulären Zone des dritten Ventrikels im Hypothalamus bei Säugetieren 30, 31, 32. NSCs sind multipotent , besitzen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und sind wichtig für die Entwicklung des Gehirns und der regenerativen Medizin 30. Die meisten NSC in dem SVZ sind ruhende und besitzen ein einsames primäres cilium , die, in vielen Fällen 33 an den lateralen Ventrikel erstreckt. Die primären cilium Signale über die Lokalisierung der verschiedenen Rezeptoren, nachgeschaltete zelluläre Antworten zu induzieren, insbesondere in Bezug auf Shh, TGFß, und Rezeptor - Tyrosin - Kinase - Wege 2, 34, 35, 36. Da primäre Zilien in die lateralen Ventrikel erstrecken, wird die Hypothese aufgestellt , dass die primären Zilien Cytokine in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) erfassen , 37 zu aktivieren NSC . Neuere Studien legen nahe , dass der Shh - Signalweg und primäre Zilien sind entscheidend für die Aktivierung von Stammzellen bei der Reparatur und Regeneration von mehreren Geweben, einschließlich dem Riechepithel, Lunge, Niere und 38, 39, 40, 41. Jedoch kommuniziert die Mechanismen, durch die CSF mit NSC und ob primäre Zilien beteiligt sind, sind nicht bekannt. Adhärenten NSCs in Kultur sind bewimpert; Shh Stoffwechselweg Komponenten wie Smo und Gpr161 in Cilien lokalisieren; und Shh reaktions 42. Somit kann NSC als wichtiges Modellsystem dienen der Shh Stoffwechselweg, ciliary Handel und neuronalen Differenzierungswege zu untersuchen. Darüber hinaus von NSCs differenzierten Neuronen können auch für ciliare Handels-Assays verwendet werden.

Neurosphären werden von Clustern von frei schwebenden Zellen gebildet aus der Proliferation von NEURA ergebendenl Stammzellen / Vorläuferzellen , die in Anwesenheit von spezifischen Wachstumsfaktoren und nicht klebender Oberflächen 43, 44 wachsen. Neurospheres dient in vitro Kulturmodellen als wichtiges neuralen Stamm- / Vorläuferzellen in der normalen Entwicklung und Krankheit 31, 45, 46, 47 zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Neurosphäre basierende Assay zur Kultivierung von neuralen Stamm- / Vorläuferzellen und zur Differenzierung zu Neuronen / Glia. Wir betonen , insbesondere den Handel mit Komponenten Zilien neuraler Stammzellen / Vorläuferzellen und differenziert Neuronen (Figur 1) signalisiert. Im Gegensatz zu primären Neuronen Kulti, sind primäre Neurosphären relativ leicht zu Kultur, zugänglich sind, um mehrere Durchgänge und Gefrier-Auftau-Zyklen, und die Differenzierung zu Neuronen / Glia eingehen können. Wichtig ist, stellten wir fest, dass die Neurosphäre abgeleiteten neuralenStamm- / Progenitorzellen und differenzierte Neuronen in Kultur bewimpert und lokalisieren Moleküle relevant Zilienfunktion in diesen Kompartimenten Signalisierung. Neurosphere Basis Kultivierungsverfahren kann als ein ideales Modellsystem dienen zur Untersuchung von ciliogenesis und ciliare Handel in NSCs und differenzierten Neuronen.

Protokoll

1. Isolierung von Neurosphären aus der erwachsenen Maus-Gehirn

  1. Euthanize einen erwachsenen Maus (etwa 2 Monate alt) durch eine Überdosis Isofluran. Doppelklicken Sie sicher, dass die Maus Atmung und seziert unmittelbar nach dem Tod gestoppt hat.
  2. Mit einer Schere, machen Sie einen Mittellinienschnitt, den Schädel zu öffnen. Entfernen Sie das Gehirn.
  3. Legen Sie das Gehirn in kaltem PBS in einer 10 cm Schale auf Eis. Folgen Sie der whole-mount Dissektion Methode 48 die SVZ von der lateralen Ventrikel zu erhalten.
  4. Platzieren Sie den lateralen Ventrikel in ein 1,5 ml-Röhrchen, 500 & mgr; l von 0,05% Trypsin-EDTA in PBS, und inkubieren das Röhrchen für 15 min bei 37 ° C in einem Wasserbad.
  5. Nach 15 min, 500 & mgr; l Stoppmedium und pipettieren sanft 20 - 30 mal mit einer 1 ml-Spitze. Vermeiden Sie Luftblasen beim Pipettieren zu bilden.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend für das Überleben der Zelle.
  6. Spin down die Zellen bei 500 g für 8 min. Überstand verwerfen, 1 ml PBS und Resuspendieren ter Zellen durch vorsichtiges Pipettieren mit einer 5 x 1 ml-Spitze.
  7. Spin down bei 500 g für 8 min. Überstand verwerfen eine 1 ml-Spitze und unter Verwendung von 1 mL Basalmedium.
  8. (Optional) Falls Zelldebris beobachtet werden, passiert die Zellen durch eine 70 & mgr; m-Sieb-Zelle.
  9. Zähle die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer; in der Regel etwa 30.000 - 60.000 Zellen / SVZ erhalten.
  10. Platte , die die Zellen von einem SVZ in eine 10 - cm - Schale mit 10 ml NSC Medium und die Kultur bei 37 ° C mit 5% CO 2.
  11. (Optional) Fusion zwischen 49 Kugeln zu vermeiden, setzte 1.000 Zellen in einer einzelnen Vertiefung einer Ultra-Low-bindenden 6-Well - Platte , die mit 1,5 ml NSC Medium und die Kultur bei 37 ° C mit 5% CO 2 vorbefüllt ist.
    HINWEIS: Nach 5-7 Tagen können Neurosphären (2A) beobachtet werden. Die Kultivierungszeit kann mit dem Alter der Maus oder dem genetischen Hintergrund unterscheiden.
  12. In 2 ml NSC Medium alle 3-4 Tage, um die Kultur zu pflegen(Nicht entfernt das vorhandene Medium).

2. Analyse der Differenzierungskapazität von Neurosphären und Ciliogenesis Tests

  1. Um die Differenzierungsfähigkeit zu analysieren, analysiert die Neurosphären unter adhärenten Bedingungen in Differenzierungsmedium.
  2. Sterilisieren 12 mm runde Deckgläser durch Autoklavierung oder mit UV-Exposition vor der Verwendung. Für eine adhärente Zellkultur, legte ein sterilisiertes 12 mm rundes Deckglas in eine Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen unter aseptischen Bedingungen.
  3. Coat das Deckglas für 10 s mit 500 ul 0,002% Poly-L-lysin (PLL). Aspirieren die Lösung und trocknen Sie es für 10-15 min.
  4. In 500 ul Laminin-Lösung (5 ug / ul). Inkubieren des Deckglases für 1 h bei 37 ° C.
  5. Absaugen Laminin und füge 500 ul Differenzierungsmedium oder NSC Medium (undifferenzierte Kontrolle).
  6. Für die Differenzierung Assay, Pick-up eine 100 bis 200 & mgr; m-Kugel mit einer 200 & mgr; l Spitze unter dem Mikroskop. Hinzufügen5-10 Neurosphären zu jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte und die Kultur für 7-10 Tage in Differenzierungsmedium.
  7. Zur Analyse undifferenzierten Neurospheres, fügen 5-10 Neurosphären zu jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte und die Kultur für 1-2 Tage in Medium NSC. Befestigt Neurosphären ausbreiten und wachsen als Monoschicht (2B).
  8. Nach vorsichtigem Entfernen des Mediums, fixiert die Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 15 min bei RT und dann mit PBS wäscht zweimal für 5 min bei RT. Die Platte kann bei 4 ° C für 1-2 Monate gelagert werden.
    HINWEIS: Neuronale Stammzellen / Vorläuferzellen in NSC Medium und differenzierten Zellen in Differenzierungsmedium zu visualisieren, führt Immunofärbung gegen Nestin (neurale Stammzellen / Vorläuferzellmarker), β-Tubulin III (TuJ1 monoclonal, neuronaler Marker), GFAP (saures Gliafaserprotein , Astrozyten - Marker) und O4 (Oligodendrozyten - Marker) (2B-E). Zur Analyse der Zilien, führen Immunofärbung gegen Arl13b (primäre cilia marker) und Gpr161 (ciliary GPCR) (Abbildung 3).
  9. Montieren Sie das Deckglas mit der Lösung auf ein Objektglas montieren. Kippen Sie den Glasobjektträger überschüssige Lösung zu entfernen.

3. Analyse von Ciliogenesis in Neurosphären

  1. Um Zellen in intakten Neurosphären durch Immunfärbung, 1 ml des Kultivierungsmediums, enthaltend mehrere Neurosphären in ein 1,5 ml-Röhrchen und Abschalten bei 500 · g für 8 min zu analysieren. Fix die Kugeln mit 4% (PFA), nachdem das Medium für 15 min entfernt und waschen mit PBS. Spin-Down-Kugeln bei 500 · g für 8 min, Überstand entfernen, und Inkubieren der Kugeln O / N mit 30% Saccharose bei 4 ° C.
  2. Überstand verwerfen eine 1 ml-Spitze verwendet, und fügen 500 ul der OCT-Lösung mit einer 1 ml cut Spitze verwendet wird. Schneiden Sie die Kante der Spitze um die Öffnung zu erweitern, wie Oktober viskos ist.
  3. Überträgt die OAT Lösung, die die Neurosphären in eine Einweg-Kunststoff-Gefrierform enthält (10 mm x 10 mm x 5 mm).
  4. Frieren Sie das malt auf Trockeneis für 15 Minuten mindestens.
  5. (Optional) Stoppen Sie das Experiment und speichern Sie die Form in einer -80 ° C Gefrierschrank für bis zu 1 Jahr.
  6. Schneiden Sie die Abschnitte mit einem Kryostaten; die Dicke der Abschnitte sollten 15-30 um betragen.
  7. Um die primären Zilien in einer Neurosphäre zu visualisieren, führt Immunofärbung gegen Arl13b (Abbildung 4).

4. Kultur und Passage von Neurosphären und Adherent NSCs

  1. Passage der Neurosphären, während die Kugelgröße zwischen 100-200 & mgr; m ist; wenn die Neurosphären zu groß sind (300 & mgr; m oder darüber), sind sie für Experimente nicht ideal.
  2. Übertragen der Neurosphären in ein 50 ml-Röhrchen eine 1 ml-Spitze und unter Verwendung von Spin-Down bei 500 · g für 8 min.
  3. Überstand verwirft einen Sauggebläses verwendet, 500 & mgr; l von 0,05% Trypsin-EDTA in PBS und Inkubieren bei 37 ° C für 5 min. Die Menge an Trypsin, variiert in Abhängigkeit von der Anzahl der Kugeln.
  4. Fügen 500 ul Serummedium und sanft Rohrt 20-mal mit einer 1 ml-Spitze.
  5. Spin down bei 500 g für 8 min. Überstand verwerfen eine 1 ml-Spitze und unter Verwendung von 1 mL Basalmedium.
  6. (Optional) Falls Zelldebris oder undissoziierten Neurosphären zu sehen sind, übergeben Sie die Zellen durch ein 70 & mgr; m-Sieb-Zelle.
  7. Passage der Zellen in einer 10 cm - Schale in einer Dichte von 10.000 Zellen / cm 2 in NSC Medium; die Zellen werden für den nächsten Durchgang nach einer Woche fertig sein.
  8. (Optional) um die Zellen gefrieren, fügt Medium Einfrieren 500.000 bis 1.000.000 Zellen / ml-Suspension zu erzeugen. Einfrieren der Zellen unter Verwendung von Kryo-Gefrierbehältern; undissoziiertes Neurosphären können auch eingefroren werden.
  9. Für die adhärente Kultur, dillute um die Zellen zu 50.000 Zellen / cm 2 auf PLL- und Laminin-beschichtete Deckgläser mit NSC Medium und die Kultur für 1-2 Tage.

5. Starvation und Analyse von Cilia

  1. Bereiten Hungermedium (Tabelle 1).
  2. 1-2 Tage nach der ersten plating adhärenter Zellen nach dem Dissoziation Änderung NSC Medium in einer Vertiefung (Kontrolle) und Hungermedium in einer anderen Vertiefung (Versuch).
  3. Kultur der anhaftenden Zellen für 24 h.
  4. Fix die Zellen mit 4% PFA in PBS für 15 min bei RT und wäscht zweimal mit PBS für jeweils 5 min bei RT.
  5. (Optional) Stoppen des Experiments und speichert die 24-Well-Platten mit Deckgläschen in PBS bei 4 ° C für 1-2 Monate.
  6. Führen Sie ein Immunofluoreszenz - Protokoll zum Färben von 7, 50.
  7. Montieren Sie die Deckgläser mit Befestigungslösung. Trocknen Sie die Gleitglas O / N bei RT im Dunkeln.
  8. Erwerben von Bildern auf einem zusammengesetzten Mikroskop bei der notwendigen Vergrößerung. Verwenden, um ein Mikroskop, eine Kamera und Ziele (40X / 63X 1.3 Öl und / 1,4-Öl), gesteuert, um die Software begleitet. Nehmen ausreichende z Schnitte an 0,5-0,8 & mgr; m Intervallen (Abbildung 5).
  9. Für die quantitative Analyse der Lokalisierung in ciliaryadhärenten Zellen erwerben Stapel von Bildern 3-8 aufeinanderfolgende Felder mit konfluenten Zellen durch Tauchen in die DAPI Kanal suchen. Quantifizierung der Anzahl der primären Zilien mit ImageJ / Fiji. Typischerweise nutzen das „Zellenzähler“ Werkzeug in der ImageJ Plugins> Analysieren Dialogfeld die Zellen mit GPCR-positiven Zilien zu zählen; maximale Projektionen aus Stapeln von Bildern kann auch aus ImageJ / Fiji.Use ähnlicher Bildintensität und Kontrastparameter für alle Bilder aus dem gleichen Experiment zum Zählen und Exportieren Zwecke exportiert werden.

6. Transfektion von Neurosphären

  1. Adhere dissoziierten Zellen auf Deckgläser für 24 h. Verwenden, um eine Zelldichte typischerweise zwischen 75.000 und 150.000 Zellen in 500 ul Medium NSC in einem einzigen Well einer 24-Well-Platte.
  2. Mischen 25 ul reduzierten Serummedium und 1,5 ul Transfektionsreagenz in ein 0,5 ml Mikroröhrchen durch Vortexen für 5 s.
  3. Hinzufügen 2,5 ug Endotoxin-freie Plasmid-DNA mit einer getrennten 0,5 ml microtube 25 ul reduziert Serum enthaltenden Medien und mische für 5 s durch Vortexen.
  4. 1 & mgr; l Transfektionsreagenz an dem zweiten Mikroröhrchen, enthaltend DNA und mischt für 5 s durch Vortexen.
  5. Fügen Sie die Mischung aus dem DNA-enthaltenden Rohr mit dem ersten Mikroröhrchen und Mischen durch Pipettieren.
  6. Inkubieren Sie die Mischung für 10-15 min bei RT. Nach der Inkubation vorsichtig hinzu Das Transfektionsgemisch tropfenweise zu den Vertiefungen auf der Oberseite des NSC-Medium (500 ul / Vertiefung).
  7. Ändert die Medium 24 h nach der Transfektion zu steuern Medium (NSC-Medium) oder Hungermedium (500 & mgr; l / Well).
  8. Fixieren Sie die Zellen durch das Medium zu 4% PFA Wechsel nach 24 h und führt Immunofärbung; typischerweise bis zu einem 10% igen Transfektionseffizienz wird dieses Protokoll erhalten werden.

Ergebnisse

Die Zellen aus dem SVZ in NSC - Medium für eine Woche nach dem Plattieren floating Neurosphären wurden (2A) beobachtet. Die Größen der Kugeln variiert zwischen 50 und 200 um. Um zu untersuchen, ob die Kugeln aus neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen abgeleitet wurden, wurden die Neurospheres ausplattiert PLL- und Laminin-beschichtete Deckgläser in NSC-Medium für 2 Tage. Sie wurden dann immunhistochemisch gegen die neuralen Stammzellen / Vorläuferzellmarker, Nest...

Diskussion

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Erzeugung und Neurosphere Kulturen von adulten Maus SVZ zu halten. Einige relevanten Punkte, die Kulturen in Bezug auf sind wie folgt. Erstens sind die Größen der Kugeln typischerweise zwischen 50 bis 200 & mgr; m. Unserer Erfahrung nach, wenn ein Neurosphere größer als 300 & mgr; m im Durchmesser bekommt, hat die optimale Zeit für Passagierung verfehlt. Diese größeren Kugeln enthalten tote Zellen im Kern. Zweitens, wie Neurosphären üblicherweise verwendet werden, ...

Offenlegungen

The authors declare no competing financial interests.

Danksagungen

Work in S.M.'s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
12 mm round cover glassFisherbrand12-545-80 
24-well plateFalcon353047
4% paraformaldehyde (PFA)Affymetrix19943
50 mL tubeFalcon352098
95 mm x 15 mm petri dish, slippable lidFisherbrandFB0875714G10 cm dish
70 µm cell strainerFalcon352350
Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immunoresearch711-545-152Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody
Arl13B, Clone N295B/66NeuromabAB_11000053
B-27 Supplement (50X), serum freeThermoFisher Scientific17504001B27
CentrifugeThermo scientificST 40R
Cryogenic vialCorning430488
DAPISigmaD9542-10MG
Deoxyribonuclease I from bovine pancreaseSigmaD5025-15KUDnase I
Dimethyl sulfoxideSigmaD8418-100MLDMSO
Disposable Vinyl Specimen MoldsSakura Tissue-Tek Cryomold456510 mm x 10 mm x 5 mm
Dulbecco's Phosphate-buffered Saline 10X, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell cultureSigmaD1408-500MLDPBS
Dumont #5 ForcepsFine science tools11254-20
Fetal Bovine Serum (FBS)SigmaF9026-500ML
Fluoromount-G solutionSouthern Biotech0100-01mounting solution
GFAPDAKOZ0334
Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateThermoFisher ScientificA-21127Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody
Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugateThermoFisher ScientificA-21137Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody
Gpr161home madeN/A
human bFGFSigmaF0291FGF
hemocytometerHausser Scientific0.100 mm deepimproved neubauer
IsothesiaHenry ScheinNDC 11695-0500-2Isofluorane
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membraneSigmaL2020Laminin
L-Glutamine (200 mM)SigmaG7513
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentThermoFisher ScientificL3000
Mr. FrostyNalgene 5100-0036
N-2 supplement (100X)ThermoFisher Scientific17502001N2
Neurobasal mediumGibco21103-049
Normal Donkey SerumJackson ImmunoResearch017-000-121
OCT compoundSakura Tissue-Tek4583OCT
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333-100ML
Poly-L-Lysine (PLL)SigmaP4707
Recombinant human EGF protein, CFR and D systems236-EG-200EGF
ScissorFine science tools14060-10
Superfrost plus microscope slideFisher scientific12-550-15slides
Triton X-100Bio-Rad161-0407
Trypsin-EDTA solution (10X)SigmaT4174-100Trypsin
COSTAR 6-Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, SterileCorning3471ultra-low binding 6-well plate
β-tubulin IIICovanceMMS-435PTUJ1

Referenzen

  1. Mukhopadhyay, S., Rohatgi, R. G-protein-coupled receptors, Hedgehog signaling and primary cilia. Semin Cell Dev Biol. 33, 63-72 (2014).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nat Rev Genet. 11, 331-344 (2010).
  3. Guemez-Gamboa, A., Coufal, N. G., Gleeson, J. G. Primary cilia in the developing and mature brain. Neuron. 82, 511-521 (2014).
  4. Louvi, A., Grove, E. A. Cilia in the CNS: the quiet organelle claims center stage. Neuron. 69, 1046-1060 (2011).
  5. Rohatgi, R., Milenkovic, L., Scott, M. P. Patched1 regulates hedgehog signaling at the primary cilium. Science. 317, 372-376 (2007).
  6. Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437, 1018-1021 (2005).
  7. Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary G-protein-coupled receptor Gpr161 negatively regulates the Sonic hedgehog pathway via cAMP signaling. Cell. 152, 210-223 (2013).
  8. Hilgendorf, K. I., Johnson, C. T., Jackson, P. K. The primary cilium as a cellular receiver: organizing ciliary GPCR signaling. Curr Opin Cell Biol. 39, 84-92 (2016).
  9. Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol Biol Cell. 19, 1540-1547 (2008).
  10. Berbari, N. F., Lewis, J. S., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Bardet-Biedl syndrome proteins are required for the localization of G protein-coupled receptors to primary cilia. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 4242-4246 (2008).
  11. Loktev, A. V., Jackson, P. K. Neuropeptide Y family receptors traffic via the Bardet-Biedl syndrome pathway to signal in neuronal primary cilia. Cell Rep. 5, 1316-1329 (2013).
  12. Marley, A., Choy, R. W., von Zastrow, M. GPR88 reveals a discrete function of primary cilia as selective insulators of GPCR cross-talk. PLoS One. 8, e70857 (2013).
  13. Marley, A., von Zastrow, M. DISC1 regulates primary cilia that display specific dopamine receptors. PLoS One. 5, e10902 (2010).
  14. Omori, Y., et al. Identification of G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) in Primary Cilia and Their Possible Involvement in Body Weight Control. PLoS One. 10, e0128422 (2015).
  15. Koemeter-Cox, A. I., et al. Primary cilia enhance kisspeptin receptor signaling on gonadotropin-releasing hormone neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 10335-10340 (2014).
  16. Brailov, I., et al. Localization of 5-HT(6) receptors at the plasma membrane of neuronal cilia in the rat brain. Brain Res. 872, 271-275 (2000).
  17. Hildebrandt, F. .. ,. ,. T. .. ,. &. a. m. p. ;. K. a. t. s. a. n. i. s. ,. N. .., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N Engl J Med. 364, 1533-1543 (2011).
  18. Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
  19. Badano, J. L., Mitsuma, N., Beales, P. L., Katsanis, N. The ciliopathies: an emerging class of human genetic disorders. Annu Rev Genomics Hum Genet. 7, 125-148 (2006).
  20. Novarino, G., Akizu, N., Gleeson, J. G. Modeling human disease in humans: the ciliopathies. Cell. 147, 70-79 (2011).
  21. Brugmann, S. A., Cordero, D. R., Helms, J. A. Craniofacial ciliopathies: A new classification for craniofacial disorders. Am J Med Genet A. 152A (12), 2995-3006 (2010).
  22. Valente, E. M., Rosti, R. O., Gibbs, E., Gleeson, J. G. Primary cilia in neurodevelopmental disorders. Nat Rev Neurol. 10, 27-36 (2014).
  23. Davenport, J. R., et al. Disruption of intraflagellar transport in adult mice leads to obesity and slow-onset cystic kidney disease. Curr Biol. 17, 1586-1594 (2007).
  24. Zaghloul, N. A., Katsanis, N. Mechanistic insights into Bardet-Biedl syndrome, a model ciliopathy. J Clin Invest. 119, 428-437 (2009).
  25. Einstein, E. B., et al. Somatostatin signaling in neuronal cilia is critical for object recognition memory. J Neurosci. 30, 4306-4314 (2010).
  26. Wang, Z., Phan, T., Storm, D. R. The type 3 adenylyl cyclase is required for novel object learning and extinction of contextual memory: role of cAMP signaling in primary cilia. J Neurosci. 31, 5557-5561 (2011).
  27. Berbari, N. F., et al. Hippocampal and cortical primary cilia are required for aversive memory in mice. PLoS One. 9, e106576 (2014).
  28. Han, Y. G., Alvarez-Buylla, A. Role of primary cilia in brain development and cancer. Curr Opin Neurobiol. 20, 58-67 (2010).
  29. Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nat Med. 15, 1062-1065 (2009).
  30. Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A. The Adult Ventricular-Subventricular Zone (V-SVZ) and Olfactory Bulb (OB) Neurogenesis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 8, (2016).
  31. Shimada, I. S., LeComte, M. D., Granger, J. C., Quinlan, N. J., Spees, J. L. Self-renewal and differentiation of reactive astrocyte-derived neural stem/progenitor cells isolated from the cortical peri-infarct area after stroke. J Neurosci. 32, 7926-7940 (2012).
  32. Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. eLife. 3, e02669 (2014).
  33. Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell stem cell. 3, 265-278 (2008).
  34. Pedersen, L. B., Mogensen, J. B., Christensen, S. T. Endocytic Control of Cellular Signaling at the Primary Cilium. Trends Biochem Sci. , (2016).
  35. Christensen, S. T., Clement, C. A., Satir, P., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of receptor tyrosine kinase (RTK) signalling. J Pathol. 226, 172-184 (2012).
  36. Clement, C. A., et al. TGF-beta signaling is associated with endocytosis at the pocket region of the primary cilium. Cell reports. 3, 1806-1814 (2013).
  37. Taverna, E., Gotz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 465-502 (2014).
  38. Joiner, A. M., Green, W. W., McIntyre, J. C. Primary Cilia on Horizontal Basal Cells Regulate Regeneration of the Olfactory Epithelium. J Neurosci. 35, 13761-13772 (2015).
  39. Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
  40. Peng, T., et al. Hedgehog actively maintains adult lung quiescence and regulates repair and regeneration. Nature. 526, 578-582 (2015).
  41. Rauhauser, A. A., et al. Hedgehog signaling indirectly affects tubular cell survival after obstructive kidney injury. Am J Physiol: Renal Physiol. 309, F770-F778 (2015).
  42. Chavez, M., et al. Modulation of Ciliary Phosphoinositide Content Regulates Trafficking and Sonic Hedgehog Signaling Output. Dev Cell. 34, 338-350 (2015).
  43. Lobo, M. V., et al. Cellular characterization of epidermal growth factor-expanded free-floating neurospheres. J. Histochem. Cytochem. 51, 89-103 (2003).
  44. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  45. Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
  46. Nishino, J., Kim, I., Chada, K., Morrison, S. J. Hmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16Ink4a and p19Arf Expression. Cell. 135, 227-239 (2008).
  47. Shimada, I. S., Peterson, B. M., Spees, J. L. Isolation of locally derived stem/progenitor cells from the peri-infarct area that do not migrate from the lateral ventricle after cortical stroke. Stroke. 41, e552-e560 (2010).
  48. Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal flow. J Vis Exp. , (2010).
  49. Coles-Takabe, B. L., et al. Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26, 2938-2944 (2008).
  50. Pal, K., et al. Smoothened determines beta-arrestin-mediated removal of the G protein-coupled receptor Gpr161 from the primary cilium. J Cell Biol. 212, 861-875 (2016).
  51. Caspary, T., Larkins, C. E., Anderson, K. V. The graded response to Sonic Hedgehog depends on cilia architecture. Dev Cell. 12, 767-778 (2007).
  52. Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nat Cell Biol. 17, 113-122 (2015).
  53. Berbari, N. F., Bishop, G. A., Askwith, C. C., Lewis, J. S., Mykytyn, K. Hippocampal neurons possess primary cilia in culture. J Neurosci Res. 85, 1095-1100 (2007).
  54. Paridaen, J. T., Wilsch-Brauninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155, 333-344 (2013).
  55. Kiprilov, E. N., et al. Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery. J Cell Biol. 180, 897-904 (2008).
  56. Mukhopadhyay, S., et al. TULP3 bridges the IFT-A complex and membrane phosphoinositides to promote trafficking of G protein-coupled receptors into primary cilia. Genes Dev. 24, 2180-2193 (2010).
  57. Ishikawa, H., Marshall, W. F. Efficient live fluorescence imaging of intraflagellar transport in mammalian primary cilia. Methods Cell Biol. 127, 189-201 (2015).

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