Das<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Colon Organ Culture und seine Verwendung in Antimicrobial-Host Defense Studies

Zusammenfassung

The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.

Zusammenfassung

Der Darm zeigt eine Architektur von repetitiven Krypta Strukturen, die aus verschiedenen Typen von Epithelzellen, Lamina Propria Immunzellen enthalten, und Stroma. Alle diese heterogenen Zellen tragen dazu bei, antimikrobielle Abwehrdarm Homöostase und daran teilzunehmen. Daher ist für das Studium Immunantwort und antimikrobielle Aktivität des Darmes in einem in vitro - Einstellung ein Ersatzmodell identifizieren , ist extrem schwierig. In - vitro - Studien mit verewigte Darmepithel - Zelllinien oder auch primäre Krypta organoiden Kultur nicht die genaue Physiologie der normalen Darm und seine Mikroumgebung darstellen. Hier haben wir ein Verfahren zum Kultivieren der Maus Kolongewebe in einer Kulturschale und darüber , wie diese ex vivo - Organkultursystem kann in Studien durchgeführt werden in Bezug auf antimikrobielle Wirtsabwehrreaktionen. In repräsentativen Experimenten haben wir gezeigt, dass Doppelpunkte in Organkultur exprimieren antimikrobiellen Peptiden in bzw.onse auf exogenes IL-1β und IL-18. Die antimikrobiellen Effektor - Molekülen durch den Dickdarm Gewebe in der Organkultur produziert effizient Escherichia coli in vitro Ferner töten. Dieser Ansatz kann daher genutzt werden, um die Rolle der pathogen und Gefahren associated molecular patterns und ihre zellulären Rezeptoren bei der Regulierung der Darm angeborenen Immunantwort und antimikrobielle Abwehrreaktionen zu sezieren.

Einleitung

Der Darm stellt ein dynamisches System , das für commensal Mikroorganismen als Barriere wirkt, kämpft gegen eindringende Krankheitserreger, und reguliert die mikrobielle Zusammensetzung ^1. Die intestinalen Epithelzellen, bestehend aus Enterozyten, Becherzellen, Panethzellen und enteroendokrinen Zellen sind die Hauptzellpopulationen, die Abwehrreaktionen gegen Darmmikrobiota liefern. Die Becherzellen produzieren Muzine , die eine entmilitarisierte Zone auf der Oberseite der Epithelschicht ² erstellen. Die Panethzellen und Enterozyten produzieren antimikrobielle Peptide, Zytokine und reaktive Sauerstoff und Stickstoff - Spezies , die eine antimikrobielle Abwehrreaktionen darstellen und tragen ^3, die Darmflora ⁴ zu formen. Zusätzlich zu Epithelzellen, die Immunzellen, einschließlich Makrophagen, dendritische Zellen, Neutrophile, natürliche Killerzellen, Lymphozyten und inna te lymphatischen Zellen in der Lamina propria und Submukosa durch die Herstellung Zytokinen, Chemokinen eine entscheidende Rolle bei Darm-antimikrobielle Abwehrreaktionen spielen, und andere Vermittler fähig ^{5 - 7.} Um zu verstehen, wie die Schleimhaut Immunsystem reguliert Mikrobiota und bietet Schutz gegen mikrobielle Infektionen, ist es wichtig, das komplexe Zusammenspiel der heterogenen Zellpopulationen des Darms zu berücksichtigen. Jedoch ist ein in vitro - Modell , das alle Merkmale des Darmes umfasst ist nicht verfügbar. Daher sind molekulare Untersuchungen auf Wirt-Pathogen-Interaktion im Darm sehr herausfordernd.

In den letzten Jahren mehrere Modellsystemen , die Aspekte der Darmschleimhaut zu imitieren wurden zur Untersuchung der pathophysiologischen Prozesse bei entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) und anderen gastrointestinalen Störungen ⁸ entwickelt ^-= "xref"> 14. Immortalized Darmepithel-Zelllinien werden oft zu studieren epithelialen Zell-spezifische Antworten verwendet. Wegen der differentiellen Genexpression und Funktion in immortalisierten Zellen jedoch die erhaltenen Daten aus diesen Zellen unter Verwendung von nicht mit denen häufig in in vivo Studien beobachtet entsprechen. Intestinale Krypta organoiden Kultur wurde als mögliches Instrument zur Beurteilung der Reaktion des Darmepithels auf verschiedene Reize ¹³ kürzlich entstanden. In diesem System werden Krypta Stammzellen erlaubt eine 3D-organoiden Struktur zu wachsen und sich entwickeln. Während die organoiden Kultursystem für die Untersuchung vieler Aspekte des Darmepithels sehr nützlich ist, ist es nicht die komplexe Interaktion von Immunzellen, Epithelzellen und mikrobielle Produkte nachahmen. Die ex vivo Kultur des Darmgewebe bietet eine bessere Darstellung der in vivo - Wirtsabwehrreaktionen. In diesem Verfahren wird ein Teil des Darms kultiviert in einer Zellkulturplatte with geeigneten Medien, die verschiedenen Arten von Zellpopulationen im Darm ermöglichen, aktiv zu sein metabolisch für mindestens 48 h. Somit kann eine ex vivo - Kultur des Organs kann verwendet werden , um die Expression von antimikrobiellen Genen und die Abwehrreaktionen des Darmes auf einen bestimmten Reiz zu messen.

Die Ermittler haben die Ex - vivo - Organkultursystem unter Verwendung von zu Abwehrreaktionen gegen mikrobielle Infektion im Darm ¹⁵ studieren ^{- 21.} Wir nahmen kürzlich die Organkultursystem die Rolle des Inflammasoms in antimikrobiellen Abwehrreaktionen in Maus Doppelpunkte ²² zu studieren. Die Inflammasoms ist eine molekulare Plattform für die Aktivierung von Caspase-1, die für die Produktion von IL-1β gereift und IL-18 benötigt wird. Wir haben gezeigt , dass IL-1β und IL-18 antimikrobielle Peptide induzieren , die effektiv commensal pathobionts wie E. coli töten . Diese Beobachtung wurde im Einklang mit einer erhöhten Belastung E. coli in Inflammasoms defekten Maus Doppelpunkte ^22. Dieses System kann daher verwendet werden, um die Rolle der Mustererkennungsrezeptoren (PRRS) und andere angeborene Immunmoleküle in intestinalen antimikrobielle Wirtsabwehrreaktionen zu untersuchen sowie Pathogenese von intestinalen Erkrankungen, wie entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) und Darmkrebs (CRC). Es gibt mehr als 200 IBD Suszeptibilitätsgene, und Mutationen in vielen dieser Gene mit veränderten mikrobiellen Zusammensetzung im Darm verbunden sind. Es ist von großer klinischer Bedeutung, die genaue Mechanismus, durch den die IBD-Anfälligkeit Gene regulieren Darmflora zu bestimmen. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Basisprotokoll von Ex - vivo - Kolon Organkultur einzuführen und zu zeigen , wie diese Kulturverfahren verwendet werden können antimikrobielle Abwehrreaktionen des Darms zu studieren.

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Protokoll

Verwendung von 6-8 Wochen alten männlichen Wildtyp (C57BL6 / J) Mäuse gehalten in einem spezifischen Pathogen (SPF) Anlage im Tier Resource Center (ARC), UT Southwestern Medical Center Alle hier beschriebenen Experimente wurden durchgeführt. Alle Untersuchungen wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien IACUC und die National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.

1. Sammlung und Vorbereitung des Colon

1. Euthanize Mäuse mit CO ₂ Erstickung durch zervikale Dislokation gefolgt.
2. Spray-Mäuse mit 70% Ethanol und Stift Gliedmaßen zu einem Pinning Bord der Maus Rückenseite nach unten auf dem Brett zu halten.
3. Mit vorsterilisiert Dissektionsscheren und Zange, machen einen Einschnitt Mittellinie in das Peritoneum des Bauches. Öffnen Sie den Bauch durch das Peritoneum mit einer Pinzette zu falten.
4. Entfernen Sie den Darm aus der Bauchhöhle with Pinzette und Schere. Trenne die Kolon vom Dünndarm durch am Boden des Blinddarms Schneiden und das andere Ende am Rektum.
5. Platzieren Sie den Darm in eine sterile Petrischale mit eiskaltem PBS. Spülen, den Inhalt des Lumens des Dickdarms mit eiskaltem PBS unter Verwendung einer 20 ml-Spritze mit einer 20 G Nadel oder eine Schlundsonde Nadel, bis der Stuhl in dem Lumen des Kolons Halte vollständig entfernt wird.
6. Schneiden Sie den Dickdarm mit einer Schere in Längsrichtung. Waschen Sie den Doppelpunkt durch kräftiges in eiskaltem PBS in einer sterilen Petrischale schütteln.
7. Schneiden Sie den Doppelpunkt Gewebe in Stücke von etwa 1 cm lange ein steriles Skalpell oder einer Schere.
8. Nehmen Sie das Gewicht der Kolon Stücke.
   HINWEIS: Alle Schritte in dem Abschnitt 1 kann entweder innerhalb oder außerhalb eines biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden. Sobald Doppelpunkte für Kultur bereit sind, alle Schritte müssen in einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden, zur Aufrechterhaltung der Sterilität.

2. Colon Orgeine Kultur

1. Legen Sie eine Zelle Sieb (100 um) auf einer 6-Well-Zellkulturplatte. Übertragen Sie alle von den Kolon Stücke von einer Maus in die Zelle Sieb gesammelt.
2. Werden 5 ml DMEM / F12 Medium mit 5% FBS, Penicillin-Streptomycin (1x) und Gentamycin (20 ug / ml). Decken Sie die Kolon Stücke mit den Medien.
3. In einem Inkubator mit 5% CO ₂ und 95% Luft bei 37 ° C für 2 Stunden inkubieren.
4. Heben Sie die Zelle Sieb und absaugen Medien.
5. Legen Sie die Zelle Sieb wieder auf den Brunnen und 5 ml frisches Medium ohne Antibiotika. Heben Sie die Zelle Sieb und absaugen Medien.
6. Wiederholen der obigen Waschschritt (Schritt 2.5) zweimal (insgesamt 3x) alle restlichen Antibiotika zu entfernen.
7. Übertragen Sie die Kolon Stücke aus einer einzigen Zelle Sieb in eine einzige Vertiefung einer sterilen 12-Well-Zellkulturplatte.
8. Hinzufügen DMEM / F12 Medium mit 5% FBS (ohne Antibiotika). Stellen Sie die Lautstärke des Mediums mit dem weight der colon Stücken, beispielsweise 1 ml Medium pro 100 mg Gewebe. Inkubieren für 12 h bei 37 ° C in einem Inkubator Injizieren von 5% CO ₂ und 95% Luft.
9. Sammeln Sie die Kulturüberstand in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen.
10. Zentrifuge bei 12.000 × g bei 4 ° C für 5 min. Trennen der Überstand in ein neues 1,5 ml-Röhrchen zur Verwendung in den Assays der Abtötung von Bakterien und / oder andere Immunassays. Der Überstand kann bis zum Test bei -80 ° C gelagert werden.
11. Sammeln Sie die Kolon Stücke in einem Rohr für die RNA-Isolierung.

3. E. coli Assay Töten

1. Impfen E. coli in 5 ml Luria-Bertani (LB) Brühe in einem 15 - ml - Röhrchen und Inkubation über Nacht bei 37 ° C bei 200 Umdrehungen pro Minute unter Schütteln. Halten Sie die Kappe des Kulturröhrchen etwas locker.
2. Zentrifugieren der Bakterienkulturröhrchen bei 1.200 xg für 10 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Bakterienpellet in 5 ml eiskaltem PBS.
3. 1 ml der bacterial Suspension in eine Küvette und messen der OD bei 600 nm. Verwenden Sie PBS als leer.
4. Berechnen der Kolonie bildenden Einheit (cfu) mit einer vorbestimmten Standardkurve verwendet wird. Hier wird angenommen , dass 1 OD = 2 x 10 ⁹ cfu / ml (ungefähr).
5. Verdünnen Sie die Bakteriensuspension auf die Stoffsuspension 1 x 10 ⁵ KBE / ml zu machen.
6. Übertragen Sie die Kolon-Organkulturüberstand (500 ul / Vertiefung) gesammelt in Abschnitt 2.10 in zwei Vertiefungen einer 24-Well-Zellkulturplatte.
7. In 10 & mgr; l E. coli - Kultur (1000 KBE) in eine Vertiefung mit 500 ul Kolon Organkulturüberstand. Lassen Sie die anderen auch ohne E. coli Impfung zu bestätigen , dass der Darm Organkulturüberstand keine Verunreinigung enthält.
8. Inkubiere die gleiche Anzahl von Bakterien (cfu 1000) in Kulturmedium (DMEM / F12 plus 5% FBS) ohne Antibiotika als Kontrolle.
9. Inkubieren bei 37 ° C für 1 h.
10. Man gibt 50 & mgr; l jeder Probe Drop-wise auf MacConkey-Agar-Platten. Inkubieren der MacConkey-Agarplatten bei 37 ° C über Nacht.
11. Zähle die Anzahl der Kolonien und die Berechnung der cfu / ml.

4. Die Wirkung von extrinsischen und intrinsischen Faktoren auf Kolon Antimicrobial-Host Defense Antworten

HINWEIS: Die antimikrobielle Tötung Test, wie hier beschrieben ist, kann die Wirkung von pathogen associated molecular patterns (PAMPs) und Zytokinen auf die bakterizide Aktivität der Organkulturüberstand zu prüfen, angenommen werden. Ein Beispiel eines solchen Experiments unter Verwendung von IL-1β und IL-18 wird nachfolgend beschrieben.

1. Sammeln Sie Doppelpunkte von Mäusen, wie in Abschnitt 1 beschrieben.
2. Platzieren Sie den Doppelpunkt auf einer sterilen Papiertuch. Schneiden Sie den Doppelpunkt der Länge nach in drei Teile mit einer Schere (Abbildung 2).
3. Waschen Sie jeden Teil des Dickdarms in eiskaltem PBS, wie in Abschnitt 1 beschrieben.
4. Schneiden Sie jeden Teil des Dickdarms in kleine Stücke und aseptisch wiegen. Übertragen Sie die Stücke jedes Teilsdes Kolons in drei separate Zellsiebe (100 um) , die auf drei Wells einer 6-Well - Zellkulturplatte (Abbildung 2).
5. 2 ml DMEM / F12 Medium mit 5% FBS, Penicillin-Streptomycin (1x) und Gentamycin (20 ug / ml).
6. Bei 37 ° C für 2 h Inkubieren in einem Inkubator Injizieren 5% CO ₂ und 95% Luft.
7. Waschen Sie die Kolon Stücke wie in 2,4-2,6 beschrieben. Übertragen Sie die Kolon Stücke aus einer einzigen Zelle Sieb in eine einzige Vertiefung einer sterilen 12-Well-Zellkulturplatte. Die drei Vertiefungen , die drei Teile des Dickdarms von einer einzelnen Maus sollte als unbehandelte, IL-1β bezeichnet werden, und IL-18 (Abbildung 2).
8. Hinzufügen DMEM / F12 Medium mit 5% FBS (ohne Antibiotika). Stellen Sie das Volumen des Mediums mit dem Gewicht der colon Stücke, beispielsweise 1 ml Medium pro 100 mg Gewebe.
9. Stimulieren des Dickdarms Organkultur mit IL-1β (20 ng / ml) oder IL-18 (20 ng / ml) für 12 h. Die unbehandelte Kolon Organkultur dient als Kontrolle.
10. Nach 12 h Inkubation bei 37 ° C in einem Inkubator Injizieren von 5% CO ₂ und 95% Luft, der Kulturüberstand in einem sterilen 1,5 ml - Röhrchen sammeln.
11. Übertragen Sie 500 ul Kulturüberstand in zwei Vertiefungen einer 24-Well-Platte.
12. Impfen E. coli (1000 KBE) in Überstand Kolon Organkultur als für jede Bedingung in Abschnitt 3 beschrieben impfen E. coli in einem einzigen gut. Die andere gut enthaltende Organkulturüberstand ohne E. coli wird als Kontrolle für bakterielle Kontamination dienen.
13. Inkubiere die gleiche Menge Bakterien in Kulturmedium ohne Antibiotika als Kontrolle.
14. Inkubieren bei 37 ° C für 1 h.
15. Man gibt 50 & mgr; l jeder Probe tropfenweise auf MacConkey-Agar-Platten. Inkubieren der MacConkey-Agar-Platten über Nacht bei 37 ° C.
16. Zähle die Anzahl der Kolonien und die Berechnung der cfu / ml (Abbildung 4).

e_title "> 5. Die Messung der Expression von Genen Antimicrobial

1. Nach Inkubation über Nacht (12 h) von Kolon Organkultur wie in den Abschnitten 2 und 4, waschen Sie die Kolon-Stücke mit 2 ml eiskaltem PBS (2x) beschrieben.
2. Sammeln Sie die Kolon Stücke in ein 2 ml RNase / DNase frei Schraubverschluss Rohr. Die Röhrchen auf Eis.
3. 1 mL kommerzielle Trizolreagenz und Lysismatrix Perlen in die Röhre.
4. Lyse das Gewebe eines automatisierten Gewebe-Homogenisator.
5. Sammeln Sie die Gewebelysat in ein neues Reaktionsgefäß.
6. Isolieren RNA-Standard-Protokoll.
7. Messen Sie RNA-Konzentration.
8. Verdünnte RNA in geeigneter Weise mit entsalztem Wasser und verwenden 500 ng RNA cDNA zu synthetisieren.
9. Verwenden Sie die cDNA für real-time RT-PCR-Analyse von gezielten antimikrobiellen Genen, Zytokine, Chemokine und andere Gene von Interesse.

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Ergebnisse

Ein repräsentatives Bild von Doppelpunkte in Organkultur ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Doppelpunkt Stücke in der Kultur bleiben metabolisch und physiologisch aktiv. Sie reagieren effizient auf exogene Stimuli zu den Kulturmedien hinzugefügt. Eine schematische Arbeitsablauf der Herstellung des Kolongewebe für ex vivo - Kultur und Stimulation mit exogenen Stimuli, wie zB IL-1β und IL-18, ist in Abbildung 2 dargestellt. Die repr...

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Diskussion

Die intestinalen Epithelzellen sind sehr empfindlich in Bezug auf ihre Wachstumsanforderungen und daher schwierig zu kultivieren. Die Epithelzellen isoliert durch EDTA - Behandlung nicht überleben in konventionellen Zellkulturmedien , wie beispielsweise DMEM ^8. Daher Wirt-Pathogen-Interaktion Studien isoliert Krypta oder primäre Epithelzellen sind sehr anspruchsvoll. Vor kurzem Sato et al. eine Krypta organoiden Kultursystem beschrieben , die für Studien im Zusammenhang mit Darm Pathophysiolog...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/ F12	Life Technologies	12634-010
Dulbecco's phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride & Magnesium chloride	Sigma	5634
FBS, heat inactivated	Sigma	F4135
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15070063
Gentamicin solution	Sigma	G1272
Mouse IL-1b recombinan	Reprokine	RKP10749
Mouse IL-18 recombinant	Reprokine	RKP70380
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018
Difco Luria-Bertani Broth	BD Bioscience	244620
BD Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar	Fisher Scientific	DF0075-17-1
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Scientific		Uded to measure RNA concentration
UV/Vis Spectrophotometer	BECKMAN	DU 530	Used to determine E. coli count
iScript RT Supermix, 100 rxns	Bio-Rad	1708841
iTaq Univer SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725125
Lysing Matrix S (1/8"), 2 ml Tube	MP Biomedicals	116925500	Used to homgenize colon organ for RNA isolation
FastPrep-24 5G System	Bio-Rad	116005500
100 mm x 15 mm Petri Dish	Falcon	5687
Plate 6 well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile	Cellstar	5085
100 μm cell strainer	Falcon	5698
Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific
Sorvall ST40R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific
Forma Scientific orbital shaker	Thermo Fisher Scientific