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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Organotypischen hippocampal Slice Kulturen (OHSC) sind eine in-vitro- Modell, die die in-Vivo -Situation sehr gut simuliert. Hier beschreiben wir eine Vibratome-basierte verbessert schneiden-Protokoll, um qualitativ hochwertige Scheiben für den Einsatz bei der Beurteilung der neuroprotektive Potenzial der neuartigen Substanzen oder das biologische Verhalten der Tumorzellen zu erhalten.

Zusammenfassung

Im organotypischen hippocampal Slice Kulturen (OHSC) sind die morphologischen und funktionellen Eigenschaften der Neuronen und Gliazellen gut erhalten. Dieses Modell eignet sich für den Umgang mit verschiedenen Forschungsfragen, die Studien zur Neuroprotektion, Elektrophysiologische Experimente auf Neuronen, neuronale Netze oder Tumorinvasion beinhalten. Der Hippokampus Architektur und neuronaler Aktivität in multisynaptic Schaltungen sind gut konserviert in OHSC, obwohl das slicing Verfahren selbst zunächst Läsionen und führt zur Bildung einer glial Narbe. Die Narbenbildung ändert vermutlich die mechanischen Eigenschaften und diffusiven Verhalten von kleinen Molekülen, etc.. Scheiben erlauben die Überwachung der Zeit abhängigen Prozesse nach Hirnverletzung ohne tierische Chirurgie und Studien zu Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Gehirn abgeleitet Zelltypen, nämlich Astrozyten, Mikroglia und Neuronen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Ein ambivalenter Aspekt dieses Modells ist das Fehlen von Blutfluss und Immunzellen im Blut. Während der Progression der neuronalen Verletzung Migration Immunzellen aus Blut spielen eine wichtige Rolle. Da diese Zellen in Scheiben fehlen, können die innere Prozesse in der Kultur ohne Einmischung von außen beobachtet werden. Darüber hinaus ist die Zusammensetzung der Medium-externe Umwelt in OHSC exakt gesteuert. Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist die geringere Anzahl der geopferten Tiere im Vergleich zu standard-Vorbereitungen. Mehreren OHSC erhalten Sie von einem Tier ermöglichen die gleichzeitige Studien mit mehreren Behandlungen in einem Tier. Aus diesen Gründen OHSC sind gut geeignet, um die Auswirkungen der neuen schützenden Therapeutika nach Gewebeschädigung oder während Tumorinvasion analysieren.

Das Protokoll präsentiert hier beschreibt eine Vorbereitung Methode der OHSC, die Erzeugung von hoch reproduzierbare ermöglicht, gut erhaltene Scheiben, die für eine Vielzahl von experimentellen Untersuchungen, wie z.B. Neuroprotektion oder Tumor Invasion Studien verwendet werden können.

Einleitung

OHSC sind eine gut charakterisierte in Vitro Modell zur physiologische und pathologische Eigenschaften der Neuronen, Astrozyten und Mikroglia1. Es ist einfach die extrazelluläre Umwelt steuert und überwacht die zellulären und morphologische Veränderungen nach verschiedene Reize. Die Organisation der hippocampal Neuronen und ihre Verbindungen sind nach Vorbereitung2,3gut erhalten. Aus mehrere Vorteile OHSC ermöglichen eine Überwachung der Gehirn Verletzungen und Tumor Invasion ohne tierische Operation. Sechs bis acht OHSC erhalten Sie bei einem einzigen Nagetier Gehirn. OHSC daher deutlich reduzieren die Anzahl der Tiere und ermöglichen testen mehrere Drogen Konzentrationen, genetische Manipulationen oder verschiedene Läsion Modelle im gleichen Tier helfen. Im Slice-based Assays können experimentelle Bedingungen exakt gesteuert werden. Darüber hinaus Zeit abhängige Entwicklung von pathologischen Zuständen wie Folgeschäden durch Time-Lapse-Bildgebung leicht überwacht werden können.

In das angegebene Protokoll, ursprünglich festgelegten Stoppini Et al. 4, die Vorbereitungsschritte sind beschrieben und wichtige morphologische Wahrzeichen für die Auswahl der entsprechenden Scheiben werden hervorgehoben. Es wird empfohlen, die Vorbereitung der postnatalen Tag 7-9 Ratten oder postnatale Tag 4-5 Mäuse. In diesen Perioden OHSC zeigen eine robuste Beständigkeit gegen mechanische Verletzungen und ein hohes Potential für die Reorganisation von neuronalen Schaltkreisen. Im Gegensatz dazu Zubereitungen aus embryonalen oder erwachsenen Ratten schnell ändern ihre Struktur verlieren ihre organotypischen Morphologie während des Anbaus und eignen sich daher weniger für das Studium langfristige Prozesse in Grundlagenforschung5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. ein weiterer kritischer Punkt für die Überlebensrate der OHSC ist die Dicke der Scheibe selbst, da die Diffusion und damit Nährstoffversorgung begrenzte12,13,14 sind.

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Protokoll

Tierversuche wurden gemäß der Ethik-Politik und die Politik auf den Einsatz von Tieren in der neurowissenschaftlichen Forschung durchgeführt, wie von der Europäischen Gemeinschaften Rat Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments genehmigt und des Rates der Europäischen Union über den Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere.

1. Vorbereitung der Instrumente und Kulturmedien

  1. für die Vorbereitung der OHSC verwenden die folgenden Instrumente: zwei kleine Schere, zwei gebogene Pinzetten, eine Pinzette mit einer feinen Spitze drei Klingen (zwei der Größe 11, einer der Größe 15), Inhaber von drei Skalpell Runde Filterpapiere (Durchmesser: 35 mm), Agar, einer Rasierklinge, einer unveränderten Pasteurpipette und eine geändert Pasteurpipette ohne ein Trinkgeld. Sterilisieren Sie alle Materialien in einem Autoklaven vor Verwendung ( Abbildung 1).
  2. Wiegen 5 g Agar und in 100 mL destilliertem Wasser auflösen. Die Lösung für 20 min bei 121,7 ° C 210,8 kPa im Autoklav zu sterilisieren. Verteilen Sie 3 mL flüssigen Agar Lösung in 60 mm Petrischalen mit einer sterilen Glaspipette zu, lassen Sie es für 5 h zu festigen, Deckel mit plastischen Paraffin Film Kontamination zu vermeiden und bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung speichern. Agar-Blöcke sind notwendig, um das Gehirn während des slicing Verfahrens stabilisieren.
  3. Media
    1. machen 200 mL des Mediums Vorbereitung (pH 7,35) bestehend aus 198 mL minimal wesentliche Medium (MEM) und 2 mL L-Glutamin-Lösung (Endkonzentration 2 mM). Bereiten Sie die Lösung am Tag der Medien Vorbereitung und speichern Sie es auf 4 ° c
    2. Vorbereiten 100 mL Kulturmedium bestehend aus 49 mL MEM, 25 mL Hanks ' ausgewogen Salzlösungen (HBSS), 25 mL (V/V) normales Pferd Serum (NHS), 1 mL L-Glutamin-Lösung (Endkonzentration 2 mM), 100 µg Insulin, Glukose 120 mg, 10 mg Streptomycin , 10.000 U Penicillin und 800 µg Vitamin C wie bereits berichtet. Das Medium (37 ° C) warm, stellen Sie den pH-Wert auf pH 7,4 und steriler Filter (0,2 µm Porengröße). Wiederholen Sie den Vorgang (Aufwärmen, pH-Anpassung, etc..) jeden zweiten Tag vor dem Ändern des Mediums. Verwenden Sie das Medium höchstens eine Woche lang bei Lagerung bei 4 ° c
  4. Füllen einen 35-mm-Petrischale mit Vorbereitung Medium, das Gehirn zu speichern. Legen Sie zwei leere Petrischalen für das Gewebe auf eine Kühlpackung im Arbeitsbereich sammeln.

2. Vorbereitung und Slicing mit einem Vibratome

  1. Verwendung Gehirne von 7-9 Tage alten Ratten oder 4-5 Tage alte Mäuse für die OHSC Zubereitung nach Stoppini Et Al. 4 nach der Enthauptung von Tieren, die Haut abziehen vom Schädel mit einer Schere.
  2. Die Klinge von einer feinen Schere in das Foramen Magnum einführen und Öffnen des Schädels durch Schneiden entlang der kaudalen (wieder) rostral (vorderen) Achse. Machen zwei schneidet senkrecht zur ersten, so dass die Schere in Richtung der linken und rechten Ohr bzw. zeigen (" T-Schnitt ").
  3. Den Schädel öffnen Sie vorsichtig mit feinen Zangen, die Aufmerksamkeit nicht auf das Gehirn zu verletzen. Ein Skalpell (Klingengröße 11) verwenden, um die meisten rostral Teil der vorderen Pole und das Kleinhirn abgeschnitten.
  4. Mittels Spatel, entfernen Sie das Gehirn zu und legen Sie es vorsichtig in der Petrischale gefüllt mit Vorbereitung Medium ( Abbildung 2). Das Gehirn auf Probenhalter und fixieren Sie es mit medizinischen Cyanacrylat-Klebstoff. Verwenden Sie die Stücke des Nährbodens zur mechanischen Stabilisierung versichern.
  5. Sezieren des Gewebes horizontal in 350 µm dicken OHSC mit einer gleitenden Vibratome.
  6. Bewerten die Scheiben optisch unter Verwendung eines binokularen Mikroskops. OHSC von geringer Qualität sofort zu verwerfen. Es ist wichtig, nur diese Segmente mit intakten Cytoarchitecture isoliert aus dem mittleren Teil des Hippocampus (siehe Abbildungen 3 und 4) zwischen den dorsalen und ventralen Hippocampus.
  7. Zu trennen, der hippocampal Region und dem entorhinalen Kortex mit einem Skalpell (Runde Klingengröße 15; ( Abbildung 3). Die Perforant Weg und entorhinalen Kortex muss bewahrt werden.
  8. Werden sechs bis acht OHSC aus jedem Gehirn gewonnen. 2-3 Scheiben in einer Zelle Kultur einfügen (Pore Größe 0,4 µm) und legen Sie sie in einen Brunnen von einer 6-Well Kulturschale mit 1 mL Kulturmedium pro Bohrloch.
  9. 6-wohlen Teller bei 35 ° C in einer voll feuchte Atmosphäre mit 5 % (V/V) CO 2 brüten und ändern das Zellkulturmedium jeden zweiten Tag.
    Hinweis: Führen Sie Ihre Experimente an 6 Tagen in Vitro (Div). Entzündliche Reaktionen im Zusammenhang mit dem slicing Verfahren verschwinden von Tag 6. In diesem Stadium Mikroglia-Zellen zeigen eine verzweigte Morphologie wieder und synaptische Verbindungen gereift.

3. Bewertung der Qualität der Gewebe

  1. Fixierung, Kennzeichnung und Visualisierung von degenerierenden Neuronen im OHSC
    1. nach der Durchführung der Experimente, brüten die OHSC mit 5 µg/mL Propidium Jodid (PI) für 2 h vor der Fixierung, in zu die Kernen der degenerierenden Neuronen beflecken.
      Achtung: PI ist karzinogenverdächtig, immer tragen persönlichen Schutzausrüstung (PSA) wie Handschuhe.
    2. Waschen der OHSC mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) und befestigen Sie sie mit einer 4 % (V/V) Lösung von Paraformaldehyd (PFA) für 24 h
      Achtung: PFA ist giftig und Verdacht Karzinogen. Arbeiten unter Abzug und PSA tragen.
    3. Der OHSC in Einsätzen mit 1 mL PBS waschen und mit einem Ausleger Pinsel, um Scheiben von der Membran zu trennen.
    4. Kennzeichnen die OHSC mit IB 4 Farbstoff in einer 24-Well-Platte ( Abbildung 5).
  2. Durchführung von Tumor Invasion Experimente mit Gewebekulturen beschriftet Einzelzellen
    1. 24 h vor dem Start eines Experiments, beschriften Sie die Tumorzellen mithilfe der Fluoreszenzfarbstoff Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester (CFDA SE).
    2. Trennen und zählen die Tumorzellen mit einer Neubauer Kammer.
    3. Aufschwemmen der Zellen im Medium, 10 µL der Aussetzung der gewünschten Zelle Nummer (normalerweise 50.000 oder 100.000 Zellen) enthält.
    4. Auftragen 10 µL Zellsuspension auf die Slice-Kultur und die Zellen, für 3 Tage zu erobern.
    5. Am Ende des Experiments, die Slice-Kulturen mit 4 % (V/V) PFA für 24 h zu beheben, und beschriften Sie die Ko-Kulturen mit PI für ein weiteres 24 h die Cytoarchitecture visualisieren.
      Achtung: PFA ist giftig und Verdacht Karzinogen. Arbeiten unter Abzug und PSA tragen.
    6. Ko-Kulturen auf einem Deckglas für weitere Analysen mit Hilfe der Medien Montage montieren.

4. Auswertung der OHSC Experimente

der OHSC mit einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop (CLSM) zu analysieren. Zur Erkennung von PI beschriftet, degeneriert Neuronen oder die PI mit der Bezeichnung Cytoarchitecture verwenden monochromatisches Licht der Wellenlänge λ = 543 nm und eine Emission Band pass Filter für Wellenlängen λ = 585-615 nm. Für CFDA Tumorzellen oder IB 4 Mikroglia gekennzeichnet, verwenden eine Erregung Wellenlänge von λ = 488 nm. Für beide experimentelle Arten erfassen einen Z-Stapel mit 2 µm Dicke optische Scheiben und für die Auswertung verwendet.

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Ergebnisse

Neuroprotektion Studien: Zur Bestimmung der neuronalen Schaden, die Anzahl der positiven Kerne PI und IB4 positive Mikroglia in jeder dritten optischen Teil des Granulat-Zellschicht (GCL) von den dentate Gyrus (DG) gezählt wurde. Für Tumor Invasion Experimente wurde die maximale Intensität Z-Projektion des Stapels verwendet für die Berechnung der Fläche von Tumorzellen, als Maßnahme der Invasion und verschiedenen Invasion Muster (Abbi...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung der OHSC. Dieses Modell ermöglicht die Prüfung der inneren Fähigkeiten und Reaktionen von Hirngewebe nach der Anwendung der physiologischen und pathologischen Reize. Neben Analysen elektrophysiologische Parameter kann OHSC lesioned und die Auswirkungen eines Schadens auf alle Zelltypen ermittelt werden. Behandlung mit verschiedenen Substanzen und die detaillierte Beschreibung der schädigendes Prozesse oder in Ermangelung von Makrophagen und Lymphozyten Heilung ist möglich...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben

Danksagungen

Die Autoren möchten Christine Auste für ihre Unterstützung mit der video-Aufzeichnung und Chalid Ghadban für seine hervorragenden technischen Betreuung danken. Urszula Grabiec stützten die Roux Programm FKZ 29/18.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
6-WellFalcon35-3046
AgarFluka5040
AutoclavSystecDX-45
CFDA Thermo FisherV12883
Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700Carl Zeiss
Eagle´s Minimal Essential Medium Invitrogen32360-034
Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin IVector LabsFL-1101
GlucoseMerk1083371000
GlutaminInvitrogen25030-024
Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+)Invitrogen24020-133
Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+  and Mg2+)Invitrogen14170-138
InsulinSigma AldrichI5500
L-ascorbic acidSigma AldrichA5960
L-GlutaminInvitrogen25030-024
LN229Cell-Lines-Service300363
Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue)B.Braun1050052
Millicell Culture InsertsMilliporePICMORG50
NMDA N-methyl-D-aspartic acidSigma AldrichM3262
Normal Horse SeumInvitrogen26050-088
Penicillin StreptomycinInvitrogen15140-122
Petri dishes (all sizes)Greiner627160/664160/628160
PFARoth0335.1toxic
Propidium iodid (PI)Sigma Aldrich81845-25MGtoxic
U138ATCCHTB-14
VibratomeLeicaLeica VT 1200

Referenzen

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