Absolute Quantifizierung von Aß<sub&gt; 1-42</sub&gt; In CSF eine massenspektrometrische Referenzmessverfahren verwenden

Zusammenfassung

A reference measurement procedure for the absolute quantification of Aβ_1-42 in human CSF based on solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry is described.

Zusammenfassung

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the diagnosis of AD is based on cognitive tests and mental state exams, but the peptide amyloid-beta (Aβ) in cerebrospinal fluid (CSF) is increasingly used in clinical trials and settings. As for most protein and peptide biomarkers, quantification is performed using antibody-based techniques, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, intra- and inter-laboratory variability in these assays hamper its use as a diagnostic marker in clinical routine.

An antibody-independent Reference Measurement Procedure (RMP) was developed based on solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography (LC)-tandem mass spectrometry (MS/MS), where stable, isotope-labeled Aβ peptides were used as internal standards, enabling absolute quantification. A high-resolution quadrupole-orbitrap hybrid instrument was used for the measurements. The method allows for the quantification of CSF Aβ_1-42 between 150-4,000 pg/mL.

Einleitung

Alzheimer-Krankheit (AD) ist die häufigste Form der Demenz und betrifft etwa 35 Millionen Menschen weltweit ^1. Die neuropathologischen Kennzeichen der Krankheit weit verbreitet in den Mittelpunkt der AD Pathogenese zu liegen glaubte , sind intrazelluläre Neurofibrillen von hyperphosphorylated Tau - Protein ² und extrazellulären Plaques , bestehend aus aggregierten Amyloid-beta (Aß) Peptide ^3. Im Einklang mit dieser Situation hat die Beurteilung der Plaque Pathologie in vivo durch Biomarker vor kurzem in den Forschungs diagnostischen Kriterien für AD ⁴ aufgenommen. Für CSF Messungen von Aß _1-42, sind mehrere Immunoassays zur Verfügung und werden in vielen klinischen Laboratorien ⁵ verwendet. Die Konzentration von A & bgr; _1-42 in CSF beträgt ungefähr 50% niedriger in AD - Patienten als in der kognitiv normalen älteren Personen, was die Abscheidung des Peptids in Plaques im br^{6 ain, 7.}

Diese Biomarker sind hauptsächlich unter Verwendung von Immunoassays analysiert (dh Antikörper-basierte Techniken), aber diese Assays können durch Matrixeffekte ⁸ beeinflusst werden. Die Verwendung von Immuntests auf verschiedenen Technologieplattformen und den Mangel an Standardisierung Assay ^{9, 10} aufgrund der Einführung von globalen abgeschnittene Konzentrationen schwer ^{11, 12.} Eine analytisch validierte RMP würde die einheitliche Kalibrierung von verschiedenen Assay-Plattformen ermöglichen, idealerweise in eine bessere Vergleichbarkeit zwischen den Analyseplattformen zurückgehen und in eine bessere Kontrolle der Faktoren, die die Gesamtmess Variabilität beitragen.

Die absolute Quantifizierung von Aß _1-42 des entwickelten LC-MS / MS - Verfahren überwindet viele der Probleme im Zusammenhang mit dem Antikörper-basierten techniques. Das Verfahren, aufgeführt als RMP durch den Gemischten Ausschuss für Rückverfolgbarkeit in der Labormedizin (JCTLM Datenbank - Identifizierungsnummer C11RMP9), werden verwendet , um die absolute Konzentration von Aß _1-42 in zertifiziertes Referenzmaterial (CRM) , um zu bestimmen CSF Aß ₁ zu harmonisieren _-42 Messungen über Techniken und Analyseplattformen. Die beschriebene Workflow sollte für die Entwicklung der Kandidatenreferenzverfahren für Peptide und Proteine ​​in anderen Bereichen der Medizin von Bedeutung sein.

Protokoll

Hinweis: Dieses Protokoll erfordert Aliquots von mindestens 50 & mgr; l, mit einer Konzentration von 50 ug / ml für jedes Aß-Peptid, als Ausgangsmaterial. Die Aß-Peptide sollten in 20% Acetonitril (ACN) und 4% konzentrierter Ammoniaklösung in entionisiertem Wasser (v / v) und gelagert bei 80 ° C aufgelöst werden.

Achtung: Siehe Tabelle 1 für Sicherheitshinweise.

1. Herstellung der Lösungen

1. Herstellung von 100 ml 20% ACN und 4% konzentrierter Ammoniaklösung in entionisiertem Wasser (v / v) mit 20 ml ACN verdünnt und 4 ml konzentrierter Ammoniak (~ 25%) in deionisiertem Wasser. Stellen Sie das Endvolumen auf 100 ml mit VE-Wasser. Machen Sie jeden Tag frisch.
2. Vorbereitung 50 ml 5 M Guanidin-Hydrochlorid durch Auflösen von 26,08 g Guanidin-Hydrochlorid in deionisiertem Wasser auf ein Endvolumen von 50 mL. Aufbewahren bei 20 ° C und frisch monatlich machen.
3. Bereiten 200 ml 4% ige Phosphorsäure in deionisiertem Wasser (v /v) von 9,4 ml konzentrierter Phosphorsäure verdünnen (~ 85%) in destilliertem Wasser. Stellen Sie das Endvolumen auf 200 ml mit VE-Wasser. Im Kühlschrank aufbewahren und wöchentlich frisch zu machen.
4. Vorbereitung 50 ml 75% ACN und 10% konzentrierter Ammoniaklösung (v / v) in entionisiertem Wasser mit 37,5 ml ACN verdünnt und 5 ml konzentriertem Ammoniak (~ 25%) in deionisiertem Wasser. Stellen Sie das Endvolumen auf 50 ml mit VE-Wasser. Machen Sie jeden Tag frisch.
5. mindestens 2,5 ml menschlichen CSF für die Kalibratoren auftauen, von de-identifizierte übrig gebliebenen Proben aus der klinischen Routine-Analyse erhalten.
6. Bereiten künstlichen CSF, enthaltend 150 mM Na, 3,0 mM K 1,4 mM Ca, 0,8 mM Mg, 1,0 mM P, und 155 mM Cl in deionisiertem Wasser und fügen Rinderserumalbumin in einer Endkonzentration von 4 mg / mL. Nur 1 ml pro Analyse benötigt, sondern bereiten ein großes Volumen, aliquoten es und Speicher für den späteren Gebrauch.

2. Herstellung der Kalibratoren

1. Bereiten 0,5 ml 4 & mgr; g / mL ¹5 NAβ _1-42 Peptid durch Zugabe von 40 & mgr; l von 50 & mgr; g / mL ¹⁵ NAβ _{142 bis 0,46} ml 20% ACN und 4% konzentriertem Ammoniak in einer 0,5-ml - Mikrozentrifugenröhrchen. Mit Hilfe eines Vortex-Mischer für 1 min.
2. Bereiten 2 ml 100 ng / ml ¹⁵ NAβ _1-42 Peptid durch Zugabe von 50 & mgr; l der 4 & mgr; g / mL ¹⁵ NAβ _142-1,95 ml 20% ACN und 4% konzentriertem Ammoniak in einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Mit Hilfe eines Vortex-Mischer für 1 min.
3. Bereiten Sie sechs Kalibratorlösungen (AF) durch die Volumina jeder Lösung in Tabelle 2 angegeben zu mischen. Verwenden Sie 0,5, 1,5 und 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Mit Hilfe eines Vortex-Mischer für 1 min.
4. Bereiten Sie die endgültige Kalibratoren (in zweifacher Ausfertigung) in 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen durch die entsprechenden Kalibrierlösungen Hinzufügen und menschlichen CSF gemäß Tabelle 3. Mischen auf einem Vortex-Mischer für 1 min.

3. Vorbereitung des internen Standards

1. Bereiten 2 ml von 0,8 & mgr; g / mL ¹³ CAβ _1-42 Peptid durch Zugabe von 32 & mgr; l von 50 & mgr; g / mL ¹³ CAβ _{142 bis 1,968} ml 20% ACN und 4% konzentriertem Ammoniak in einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Mit Hilfe eines Vortex-Mischer für 1 min.
2. Bereiten 5 ml 16 ng / ml ¹³ CAβ _1-42 Peptid durch Zugabe von 0,1 ml von 0,8 ug / ml bis 4,9 ml 20% ACN und 4% konzentriertem Ammoniak in einem 5 ml - Mikrozentrifugenröhrchen. Mit Hilfe eines Vortex-Mischer für 1 min.

4. Vorbereitung der Responsefaktor Probe

HINWEIS: Die Responsefaktor (RF) Bestimmung wird durchgeführt , um die Konzentration des markierten Peptids zur Kalibrierung ⁽¹⁵ NAβ _1-42) verwendet zu bestimmen. Dies erfordert , dass die Konzentration des nativen Aß _1-42 Peptid wurde unter Verwendung von Aminosäureanalyse (AAA) bestimmt. Somit wird das Volumen und die Konzentration von nativen Aß _1-42 Peptid Aliquotsmüssen die Anforderungen der AAA zu erfüllen.

1. Bereiten 0,5 ml 4 & mgr; g / mL nativen (unmarkiert) ^{A & bgr;} _1-42 durch Zugabe von 40 ul von 50 ug / ml nativem Aß _1-42 bis 0,46 ml 20% ACN und 4% konzentriertem Ammoniak in einer 0,5-ml - Mikrozentrifugenröhrchen. Mit Hilfe eines Vortex-Mischer für 1 min.
2. Bereiten Sie eine 2-ml 40 ng / ml Mischung aus einheimischen und ¹⁵ NAβ _1-42 durch Zugabe von 20 & mgr; l von 4 ug / ml nativen Aß _1-42 und 20 & mgr; l von 4 ug / ml ¹⁵ NAβ _1-42 bis 1,96 ml 20% ACN und 4% konzentriertem Ammoniak in einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Mit Hilfe eines Vortex-Mischer für 1 min.
3. In 20 ul der 40 ng / ml Mischung auf 0,38 ml künstlichem CSF in einem 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Bereiten Sie Duplikate und mischen auf einem Vortex-Mischer für 1 min.

5. Probenvorbereitung

HINWEIS: auftauen die Proben auf einer Walze bei Raumtemperatur gemessen werden.

1. In 0,18 ml jeder Kalibrator, Responsefaktor und unbekannten Probe (einschließlich der Qualitätskontrolle [QC] Proben, falls verwendet) zu einem 1 ml Protein 96-Deep-Well - Platte, nach 1 (eine vollständige Platte unter der Annahme verwendet wird ). Achten Sie darauf, um die Proben in oder in der Nähe, der Boden der Vertiefungen hinzuzufügen.
2. In 20 ul des internen Standards in jede Vertiefung (dh Kalibratoren, Responsefaktoren, QCs und Unbekannten); ist es entscheidend, den Tropfen an der Seite des Schachts nahe der Oberfläche der Probe zu lösen, ohne die Pipettenspitze eingetaucht.
3. In 0,2 ml 5 M Guanidin-Hydrochlorid in jede Vertiefung.
4. Platzieren Sie die Probenplatte auf einem Schüttler und mischen Sie die Proben für 45 Minuten bei 1100 Umdrehungen pro Minute. Die optimale Frequenz kann je nach Instrumentierung abweichen. Die Frequenz und Amplitude des Mischers so, dass die Lösungen gründlich gemischt und keine Tropfen des internen Standards oder CSF sind auf der Seite der Vertiefungen ungemischten gelassen.
5. In 0,2 ml 4% Phosphorsäurezu gut jeder. Vortex kurz mischen.

6. Festphasenextraktion

HINWEIS: In jedem Waschen, Laden und Eluierungsschritte gelten die niedrigste mögliche Vakuum nach Zugabe der Lösung ist und schrittweise nach Bedarf erhöhen, um die Lösung zu laden oder zu eluieren. Deaktivieren Sie das Vakuum zwischen jedem Lade- und Elutionsschritt.

1. Setzen Sie ein Vorratsfach für Abfall unter einem gemischten Modus, Kationenaustausch, 96-Well Festphasenextraktion (SPE) Platte in der Extraktionsplatte Verteilerkammer.
2. Erhaltung der SPE Sorbens durch Zugabe von 0,2 ml Methanol zu jeder Vertiefung.
3. Äquilibrieren das Sorbens durch Zugabe von 0,2 ml 4% ige Phosphorsäure zu jeder Vertiefung.
4. Übertragen Sie alle Proben (etwa 0,62 ml in jeder Vertiefung) aus dem Deep-Well-Platte an der SPE-Platte. Verwenden Sie einen Acht-Kanal-Pipette, wenn die Proben aus dem Deep-Well-Platte an der SPE-Platte zu übertragen; es ist nicht entscheidend, um die gesamte oder gleiche Volumina aller Proben zu übertragen, da die Proben einen Praktikanten enthaltenal-Standard, der für Variationen kompensieren.
5. Waschen des Sorbens, nachdem die Proben durch Zugabe von 0,2 ml 4% -iger Phosphorsäure in jede Vertiefung durchlaufen haben.
6. Nach dem Waschlösungsmittels aus dem Sorbens eluiert wurde, mit einer Sammelplatte oder Rohre, die die Vorratsfach ersetzen.
7. Eluieren der Probe aus dem Sorbens durch zweimalige Zugabe von 50 & mgr; l von 75% ACN / 10% konzentriertem Ammoniak, und beachten Sie, dass diese Lösung eine sehr niedrige Vakuum erfordert durch das Sorbens zu passieren. Denken Sie daran, das Vakuum zwischen jeder Zugabe zu deaktivieren.
   1. Optional: Verschließen Sie die Sammelplatte oder Rohre und sie bei -80 ° C einfrieren. Entfernen Sie die Dichtung von der Sammelplatte oder Rohre vor 6.8.2 zu Schritt fortfahren.
   2. Trocknen Sie die Eluate durch Verwendung von Vakuum-Zentrifugation (ohne Anwendung von Wärme); Dies kann von einem bis zu mehreren Stunden dauern, abhängig von der Vakuumzentrifuge.
   3. Verschließen Sie die Behälter und frieren sie bei -80 ° C.

7. Flüssige Chromatographie

1. Vorbereitung der mobilen Phase A (5% ACN und 0,3% konzentriertem Ammoniak in entionisiertem Wasser [v / v]), B (4% deionisiertes Wasser und 0,1% konzentriertem Ammoniak in ACN [v / v]) und Nadelspülung (50% ACN und 4% konzentriertem Ammoniak in entsalztem Wasser [v / v]).
   1. Für 500 ml der mobilen Phase A, 25 ml ACN und 1,5 ml konzentrierter Ammoniak zu entionisiertem Wasser. Stellen Sie die endgültige Volumen auf 500 ml mit VE-Wasser.
   2. Für 500 ml der mobilen Phase B, 500 & mgr; l konzentrierter Ammoniak und 25 ml VE-Wasser zu ACN. Stellen Sie die endgültige Volumen auf 500 ml mit ACN.
   3. Bereiten 250 ml Nadelspülung durch Zugabe von 120 ml ACN und 10 ml konzentriertem Ammoniak zu entionisiertem Wasser. Stellen Sie das Endvolumen auf 250 ml mit entionisiertem Wasser.
   4. Setzen Sie den mobilen Phasen A und B und Nadelwaschflaschen öffnet in einem Ultraschallbad für 20 Minuten vor dem Gebrauch mit dem LC-System
2. Man löst jede Probe mit 25 & mgr; l von 20% ACN und 4% KonzenAmmoniaklösung ted und legen Sie sie auf einem Schüttler für 20 min. Zentrifuge nach unten den Proben und legen Sie sie in den Autosampler (halten bei 7 ° C).
3. Injizieren 20 ul der Probe auf einem 1 x 250 mm ² Polystyrol-Divinylbenzol (Reversed Phase) monolithische Säule bei 50 ° C gehalten.
   1. Verwenden , um die LC - Gradienten in Tabelle 4 gezeigt mit einer Durchflussrate von 0,3 mL / min. Umleiten die ersten beiden und die letzten fünf Minuten zu verschwenden (post-Säule) unter Verwendung eines Umleitungsventil, um die Verunreinigung des Massenspektrometers zu reduzieren.

8. massenspektrometrische Analyse

HINWEIS: Diese Parameter für einen Quadrupol-Orbitrap Hybrid-Massenspektrometer mit aheated Elektrospray-Ionisierung Quelle ausgestattet verwendet wurden.

1. Die Parameter für den Ionenquelle gemäß Tabelle 5.
2. Stellen Sie das MS - Gerät die 4+ Ladungszustände von nativen Aß _1-42 (1,129.48 Massen zu isolierenLadungs-Verhältnis [m / z]), ¹⁵ NAβ _1-42 (1.143,00 m / z) und ¹³ CAβ _1-42 (1,179.50 m / z) in der Quadrupol - Massenanalysator mit einer Isolationsbreite von 2,5 m / z.
3. Fragment, das die isolierten Peptide in der Kollisionszelle mit einer normalisierten Kollisionsenergie (NCE) von 17,0. Diese müssen möglicherweise für jedes Instrument, selbst des gleichen Typs abgestimmt werden (und insbesondere dann, wenn andere Arten von Instrumenten, wie beispielsweise einem Triple-Quadrupol-MS).
4. Notieren Sie sich die Fragmentspektren mit einer Auflösung von 17.500, mit einer automatischen Verstärkungsregelung Ziel von 2 x 10 ⁵ Kosten und einem maximalen Einspritzzeit von 250 ms.

9. Datenverarbeitung

1. Verwenden , um die Summe der Produkt - Ionen (mit einem Massentoleranz von ± 250 Millimasseneinheiten [MMU]) in Tabelle 6 die chromatographischen Bereiche für jedes Peptid berechnet. Beachten Sie, dass die Ionenarten und Zahlen werden nur für die native Aß gezeigt _{1-42 Produkt - Ionen, da sie die gleichen für beide ¹⁵ NAβ 1-42 und ¹³ CAβ 1-42.}
2. Bestimmen Sie die durchschnittliche Reaktionsfaktor der beiden Reaktionsfaktor Proben durch die Fläche unter der Kurve dividiert (chromatographischen Peak) von ¹⁵ NAβ _1-42 mit der Fläche unter der Kurve von nativen Aß _1-42.
3. Stellen Sie die Konzentration des ¹⁵ NAβ _1-42 für die Kalibrierung verwendet , indem er mit dem Reaktionsfaktor in Schritt 9.2 berechnet multipliziert wird .
4. Einer Eichkurve , die durch die Flächenverhältnisse von ¹⁵ NAβ _1-42 bis ¹³ CAβ _1-42 von den beiden Sätzen von Kalibratoren gegen die Konzentration aufgetragen ist .
5. Berechnen der Steigung und Achsenabschnitt der Kalibrierungskurve lineare Regression verwendet wird.
6. Berechnen Sie den Flächenverhältnis von nativen Aß _1-42 auf den internen Standard ⁽¹³ CAβ _1-42) für unbekannten Proben.
7. Extrapolation der Konzentration von unbekannten Proben aus der Kalibrierungskurve unter Verwendung der Steigung und Achsenabschnitt in Schritt 9.5.

Ergebnisse

Die Platte Setup in Abbildung 1 für eine volle Platte der Proben verwendet. Wenn weniger unbekannte Proben zu analysieren, sollte der zweite Kalibrator, RF, und QC-Sets nach der ersten Hälfte der unbekannten Proben platziert werden.

Wie in Figur 2 zu sehen ist , sind die Kalibratoren nahe der Regressionslinie mit geringen Standardabweichungen. Diese Methode hat einen geringeren Grad an Quant...

Diskussion

Für das Verfahren beschrieben, stattdessen eine Ersatzmatrix zu verwenden, haben wir den Surrogat - Analyt - Ansatz ^{13, 14, 15, 16,} die Kalibrierung im menschlichen CSF ermöglicht. Der Ersatz Analyt Ansatz beinhaltet zwei verschiedene isotopenmarkierten Standards. Eine ⁽¹⁵ NAβ ₁₄₂₎ wird verwendet , um die Kalibrierungskurve in menschlichen CSF zu erzeugen, während ein...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL	Eppendorf	022431102
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL	Eppendorf	0030 108.310
Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96	Eppendorf	951032905
Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom	Micronic	MPW32071BC3	Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates.
Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes	Micronic	MP53026	Caps for Micronic tubes.
Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded	Micronic	MPW51015BC3	Holder for Micronic tubes.
Biohit Optifit tips 1.2 mL	Sartorius	791210	Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well.
Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate	Waters	186001830BA
Waters Plate manifold reservoir tray	Waters	WAT058942
Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates	Waters	186001831
Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis	Sigma-Aldrich	30501-1L-D
Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L	Fisher Scientific	A/0627/17X
ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur	Merck Millipore	1005731000
Guanidine Hydrochloride, 500 g	Thermo Scientific	24110
Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR	With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler.
Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm)	Dionex	066640
Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated	Sigma-Aldrich	B6917
Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA	rPeptide	A-1002-2
15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled	rPeptide	A-1102-2
13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled	rPeptide	A-1106-2
Microplate shakers, TiMix 2	Edmund Bühler	6110 000