Längerer Inkubation von Akute neuronales Gewebe für Elektrophysiologie und Calcium-Bildgebung

Zusammenfassung

Sobald aus dem Körper entfernt wird neuronalem Gewebe stark durch Umweltbedingungen beeinflusst, den späteren Abbau des Gewebes führt nach 6 - 8 h. Unter Verwendung einer einzigartigen Inkubationsverfahren, die eng überwacht und reguliert die extrazelluläre Umgebung des Gewebes kann Gewebeviabilität deutlich> 24 h ausgedehnt werden.

Zusammenfassung

8 Stunden nach der Präparation - neuronaler Gewebepräparate Akut, Hirnschnitten und Retina-Wholemount, können in der Regel nur für 6 gehalten werden. Dies begrenzt die Versuchszeit und erhöht die Anzahl der Tiere, die pro Studie verwendet werden. Diese Einschränkung speziell Auswirkungen Protokolle wie Kalzium-Imaging, die verlängerte Vorinkubation erfordern mit Bad aufgetragen Farbstoffe. Exponential Bakterienwachstum in 3 - 4 h nach dem Schneiden ist eng mit einer Abnahme der Gewebegesundheit korreliert. Diese Studie beschreibt ein Verfahren für die Vermehrung von Bakterien in acute Zubereitungen Begrenzung für längere Zeiträume (> 24 h) ohne die Notwendigkeit von Antibiotika, sterile Verfahren oder Gewebekulturmedien, enthaltend Wachstumsfaktoren tragfähige neuronalem Gewebe zu halten. Durch Radfahren Kammer die extrazelluläre Flüssigkeit durch UV-Bestrahlung und halten das Gewebe in einem benutzerdefinierten Halte bei 15 - 16 ° C, zeigt das Gewebe keinen Unterschied in der elektrophysiologischen Eigenschaften, oder Calcium-signaling durch intrazelluläres Calcium Farbstoffe bei> 24 h postdissection. Diese Methoden werden nicht nur verlängern experimentelle Zeit für diejenigen, mit akuten neuronalen Gewebe, sondern die Zahl der Tiere zu reduzieren erforderlich, um experimentelle Ziele abzuschließen, und wird eine Goldstandard für die akute neuronale Gewebe Inkubation gesetzt.

Einleitung

Elektrophysiologie und funktionelle Bildgebung (Calcium, spannungsempfindliche Farbstoffe) sind zwei der am häufigsten verwendeten experimentellen Techniken in den Neurowissenschaften. Hirnschnittpräparaten und retinale Wholemount, die hier untersucht werden, ein Mittel zur Prüfung der elektrophysiologischen Eigenschaften und synaptischer Verbindungen ohne Kontamination von Anästhetika oder Muskelrelaxantien. Hirnschnitte und Retina - Wholemount ihre strukturelle Integrität aufrechtzuerhalten, im Gegensatz zu Kulturen oder Zellhomogenisate, so dass die Untersuchung spezifischer Schaltungen und Gehirn Netzwerke ^1. Aufnahmen von isolierten Gewebe haben Vorteile gegenüber in vivo Aufnahmen als Bewegungen mit dem Herzschlag und Atmung verbunden sind eliminiert. Darüber hinaus ermöglicht die direkte Visualisierung bestimmte Klassen von Zellen ^{2, 3} gezielte und lokale Anwendung von pharmakologischen Werkzeugen werden.

Patch-Clamp-Aufnahmen und Calcium Farbstoffbeladung in retinalen Wholemount wird durch die Existenz der inneren Grenzmembran (ILM), die deckt die retinalen Ganglienzellen (RGC) Schicht kompliziert und direkten Zugang zu den Zellen verhindert. Typischerweise wird diese Membran mit einer Glaspipette abgeschabt direkte Anwendung eines Patch-Pipette und die Bildung eines Gigaohm Dichtung an einer einzigen Zelle zu ermöglichen. Darüber hinaus Bade angewendet Kalzium Farbstoffe nicht kreuzen die ILM und müssen entweder unter dieser Membran ^4, retrograden Transport nach der Injektion an den Sehnerv ⁵ oder durch Elektroporation durch das Gewebe ⁶ injiziert werden. Wenn darüber hinaus ein Nagetiermodell von Retinitis pigmentosa verwendet wird , die rd / rd Maus, ist die ILM dicker und undurchdringlich. Hier verwenden wir eine Technik , um die ILM mit enzymatischen Aufschluss ⁷ zu entfernen , sowohl allgegenwärtige Calcium - Farbstoff-Beladung und den direkten Zugang zu retinalen Ganglionzellen für Patch-Clamp - recordi zu ermöglichenNGS ^8.

Erfolgreiche Aufnahmen von beiden Hirnschnitten oder retinalen Wholemount hängen von Präparation und Inkubation von lebenden Nervengewebe. Typischerweise wird Gewebe am Morgen des Experiments entnommen und in künstlichen Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF) inkubiert, bis sie für die Aufnahmen verwendet wird. Normalerweise bleibt Gewebe lebensfähig für 6 - 8 h, mit signifikanten Abbau nach diesem Zeitfenster. beide Gehirnscheiben und Präparate jedoch in der Regel Wholemount retinae produzieren mehr Gewebe als kann innerhalb dieser kurzen Zeitspanne aufgezeichnet werden. Folglich wird Gewebe oft am Ende des Tages verworfen und die Präparation wird wieder an den nachfolgenden Tagen abgeschlossen. Das bedeutet, ein anderes Tier wird verwendet, und ~ 2 h Setup und Dissektion / Färbung wiederholt. Das folgende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Verlängerung der Lebensdauer von neuronalem Gewebe für mehr als 24 h, was bedeutet weniger Tiere verwendet werden, und Versuchszeit zur Verfügung steht. Gewebeviabilität wwie beurteilt durch elektrophysiologischen Eigenschaften der Aufnahme und Kalziumdynamik, und diese Eigenschaften waren nicht zu unterscheiden zwischen <4 h und> 24 h postdissection.

Diese Ergebnisse zeigen, dass nicht nur einzelne Zelleigenschaften intakt und funktionsfähig nach längerer Inkubation, aber Netzwerk-Aktivität, wie durch Calcium-Bildgebung und elektrophysiologischen Ableitungen beurteilt, ist unverändert> 24 h postdissection. Darüber hinaus zeigen wir, dass Calcium Farbstoffe in Zellen über einen längeren Zeitraum, ohne dass irgendwelche nachteiligen Effekte bleiben kann. Anwendung dieses Protokolls veranschaulicht, dass die funktionelle Aktivität von Neuronen in akuten neuronalen Gewebe können für lange Zeiträume aufrechterhalten werden, sobald die äußere Umgebung stark reguliert ist. Außerdem ist, wie die Lebensfähigkeit des Gewebes aufgrund unterschiedlicher Inkubationsprotokolle stark zwischen den Labors variiert, stellt dieses Verfahren einen Goldstandard für die idealen Parameter, die Variabilität in der Gesundheit der akuten neu zu reduzieren angewendet werden sollteronal Gewebe.

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Protokoll

Das Protokoll unten beschreibt die Herstellung von C57BL / 6 und C3H / He (retinally degeneriert) Maus neuronalem Gewebe, aber ähnliche Techniken können auf andere Arten angewendet werden. Alle Tiere gesund und Umgang mit Standardbedingungen von Temperatur, Feuchtigkeit, 12 h Hell / Dunkel-Zyklus, den freien Zugang zu Futter und Wasser waren, und ohne beabsichtigte Stressreize. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den westlichen Sydney University Animal Care und Ethikkommission und nach der Nutzung von Tieren und Pflegerichtlinien (Animal Research Authority # A9452, # A10396 und # A8967) genehmigt und durchgeführt.

1. Gehirn Scheibe Vorbereitung

1. Anesthetize das Tier durch Inhalation von Isofluran (5%) und enthaupten ein Nagetier Guillotine verwenden. Entfernen Sie schnell das Gehirn, wie zuvor ⁹ beschrieben und legen Sie sie in eiskalter physiologischer Lösung (aCSF) enthält (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 MgCl _2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 2 CaCl _2, 25NaHCO _3, 25 Dextrose und gesättigt mit Carbogen (95% O _2/5% CO ₂ -Gemisch; 310 mOsm, pH 7,4).
2. Schneiden Sie Hirnschnitten, in der Region von Interesse, 300 & mgr; m dick mit einem vibrierenden Mikrotom.
3. Übertragen Scheiben zu einem speziell angefertigten Inkubationssystems , die eng überwacht und steuert pH - Werte (pH 7,2 bis 7,4), Carbogen Strömung und Temperatur wie zuvor ^{10 beschrieben, 11.}
4. Eingestellten Anfangskammertemperatur auf 35 ° C für 15 - 30 min, und dann reduzieren langsam auf 15 - 16 ° C , wie in 1C gezeigt. Dann inkubieren Scheiben in Inkubationssystems bis sie benötigt werden, entweder für die Elektrophysiologie oder Bildgebung.
   HINWEIS: Wenn Scheiben werden für Calcium-Bildgebung verwendet werden, unter Schritte folgen, bevor Gewebe unterhalb RT abgekühlt wird.

2. Retinal Wholemount Vorbereitung und Membrana limitans Removal

1. Bereiten Sie retinalen wholemounts entweder unter normalenLaborlichtverhältnissen oder schwach rot / Infrarot-Licht.
2. Euthanize Tier durch Genickbruch und sofort enucleate Augen. Machen Sie einen kleinen Schnitt entlang der Ora serrata und Ort entweder in Ames Medien oder aCSF enthält (mM): 125 NaCl, 25 NaHCO _3, 3 KCl, 2 CaCl _2, 1 MgCl _2, 10 Glucose, 0,5 L-Glutamin und sättigen mit Carbogen (95% O _2/5% CO ₂ -Gemisch; ~ 300 mOsm, pH 7,4) bei RT.
3. Entfernen Sie unverzüglich die Hornhaut, Linse und Glaskörper durch entlang der Ora serrata mit einer kleinen Schere schneiden und die Linse und Glaskörper mit einer Pinzette entfernen. Platzieren Gewebe im Inkubationssystem bei RT.
   HINWEIS: Retinal Gewebe kann in der Augenbecher, nach langsamer Temperaturabsenkung bis 15 gehalten werden - 16 ° C, für> 24 h in Inkubationssystems bis benötigt.
4. Um die ILM entfernen, übertragen Sie die Augenmuschel die Netzhaut zu einem kleinen Glas mit 30 U / ml Papain, 1 mM L-Cystin, 0,5 mM EDTA und 0,005% DNase in Earl's- enthältBalanced Salt Solution (BSS) bei 37 ° C für 20 min. Anwenden 95% O _2/5% CO ₂ in die Lösung durch den Deckel , aber nicht Blase. Wenn Gewebe von jungen Tieren (<6 Wochen) verwenden, verdünnen die Lösung auf halber Stärke.
   1. Stoppen enzymatischen Verdau, durch das Gewebe in einer Ovomucoid Plazieren (10 mg / ml) und BSA (10 mg / ml) -Lösung für 10 min in Earl BSS. Wash Gewebe gründlich mit aCSF vor dem Transfer zum Inkubationssystems und reduzieren Temperatur auf 15 - 16 ° C.
5. Pflegen Netzhautgewebe im Auge Schale, bis sie benötigt. Für die Übertragung an das Mikroskop, isolieren die Netzhaut aus dem Auge-Tasse und schneiden in 4 Stücke mit einer Rasierklinge. Wenn die gesamte Netzhaut erforderlich ist, machen vier kleine Schnitte in der Peripherie der Netzhaut, es zu ermöglichen, flach zu liegen.
   HINWEIS: Für die Bildgebung Experimente, Belastung mit Calcium-Farbstoffe vor dem Transfer zum Inkubationssystems, siehe unten.

3. Erhaltung von Gewebe im Inkubator

1. Platz Gewebe in der Hauptkammer Sonden für pH und Temperaturmessungen (1A, B) enthält.
2. Zirkulieren aCSF durch eine zweite Kammer (UVC Kammer, aufgebaut wie zuvor ¹² beschrieben) , isoliert aus der Hauptkammer und ausgesetzt zu 1,1 W UVC - Licht (254 nm, 5W / 2P Sterilisator UV - Lampe), um Bakterien zu eradiate in der Lösung schwebenden (Abbildung 1A). Steuer UVC Licht Timing über einen programmierbaren Zeitgeber ein zufälliges-Funktion, die zu Zeiten schaltet variierend zwischen 15 und 26 min alle 15 - 30 min eine übermäßige Erwärmung des aCSF zu vermeiden.
3. Stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit in der Kammer UVC bis 12 mL / min , wie zuvor berichtet , ^12. Decken Sie die UVC-Kammer mit Aluminiumfolie zu UVC Beleuchtung außerhalb der Kammer zu verhindern, die das neuronale Gewebe schädigen können.
   HINWEIS: Für die dunkeladaptierten Netzhautgewebe, tragen Sie eine maßgeschneiderte Abdeckung mit der Hauptkammer Licht auszuschließen.
4. Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe zu Circulate die Lösung (aCSF) durch die beiden Kammern und eine Platte thermo kalten Peltier-Kühler entweder kühlen oder die Hauptkammer im Bereich von 0 bis die gewünschten Temperaturen erhitzen - 50 ° C. Für eine optimale Gewebe Inkubation verwenden 15 - 16 ° C für die langfristige Rentabilität.

4. Calcium Farbstoffbeladung

1. Wählen Calcium Farbstoffe basierend auf der Präferenz des einzelnen Forscher. Hier verwenden wir Fura-02.00, Fluo-08.00 Uhr oder Fluo-04.00. Jedoch kann dieses Verfahren auf andere Farbstoffe verwendet werden wie auch: Man löst Calcium Farbstoffe in DMSO auf eine 1 mM - Lösung und 1% Blockcopolymere (beispielsweise Pluronsäure-127) bis zu einem Endvolumen von 50 ul und beschallen für 10 min.
2. Hinzufügen Lösung aCSF bis zu einer Endkonzentration von 10 uM, 0,01% Blockcopolymere für Hirnschnitten und 20 uM (Netzhaut), 0,02% Blockcopolymere für die Netzhaut. In Retinae (Papain behandelt) und Hirnschnitten von jungen Tieren, Last auf das Bad für 45 min bei 37 ° C (Fura-2 AM) oder bei RT (Fluo-04.00; Fluo-08.00 Uhr).
   1. Für erwachsene Tiere, (> 12 Wochen) pipettieren die Farbstoffe (50 ul) direkt auf die Hirnschnitten und pflegen 75 min eine bessere Durchdringung des Farbstoffs in die tiefen Schichten zu ermöglichen.
   2. Um eine ausreichende Sauerstoffversorgung des untergetauchten Scheibe während der Farbstoff Inkubation sicherzustellen, bereiten eine Glasladeraum mit einem geschlossenen Deckel (Kreis Glas mit einem Durchmesser von 2,5 cm, 3,5 cm Höhe) mit Calcium-Farbstoffe, verdünnt in 2,5 ml aCSF. Oxygenat kontinuierlich mit 95% O _2/5% CO _2. Nicht Blase.
3. Nach Farbstoffbeladung, waschen Sie die Gewebe mit aCSF und Transfer zum Inkubationssystems, reduzieren die Temperatur langsam auf 15 - 16 ° C bis zum experimentellen Einsatz.

5. Recordings und Imaging Elektrophysiologische

1. Platzieren Gewebe in einem untergetauchten Aufnahmekammer unter einem Mikroskop und perfundieren mit oxygeniertem aCSF mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 4 - 5 ml / min entweder bei RT (~ 22 ° C) oder physiologischer Temperatur (~ 35 ° C). Hold das Gewebe an Ort und Stelle durch Verwendung eines benutzerdefinierten gemacht '' Harfe '', aus Nylon oder Goldfäden gestreckt und über ein U-förmiges Stück Gold oder Platindraht geklebt.
2. Für die Elektrophysiologie:
   1. Bereiten Sie Aufnahme Pipetten von 1,5 mm (1,19 mm ID) Borosilicatglas mit einer Mikro Abzieher mit einem Endwiderstand von 5-6 MOhm zu erreichen.
   2. Füllen Sie die Pipette mit 3 bis 4 & mgr; l der internen Lösung wie zuvor ¹³ beschrieben und zu visualisieren Zellen unter Infrarot - Differential - Interferenz - Kontrast (IR-DIC) mit einer CCD - Kamera. Die intrazelluläre Lösung sollte sorgfältig jedem Experiment zugeschnitten werden experimentelle Ergebnisse zu erzielen.
   3. Position Pipette, während positive Druck aufrechterhalten wird aufgebracht durch eine Ansaugöffnung auf der Pipettenhalter an der Membran einer Zelle eines Mikromanipulators verwenden. Da die ILM von der Netzhaut entfernt wurde, keine vorherige Membran Abschaben erforderlich ist. Sobald die Pipette auf die Zelle ist, gelten sanft negativDruck auf die Pipette eine Gigaohm Dichtung zu erreichen. Dann reißt die Zellmembran mit einer kurzen Menge von Unterdruck.
   4. Machen Sie mit ganzen Zellen Strom- oder Spannungs-Clamp Messungen mit Standardtechniken als angemessen.
3. Calcium-Bildgebung:
   1. Für ratiometrisch Bildgebung von Fura-2, eine Ultrahochgeschwindigkeits-Wellenlängenumschalter verwenden, um Anregungswellenlängen von 340 nm und 380 nm bereitzustellen. Passieren emittierte Licht von einzelnen Zellen durch ein Emissionsfilter von 510 ± 20 nm, und erfassen mit einer hohen Empfindlichkeit, Hochgeschwindigkeits-Digitalkamera.
   2. Für einen einzelnen Anregungswellenlänge von Fluo-4, Filteranregungslicht durch einen 460-490 nm Bandpassfilter und emittiert Licht durch eine 515-550 nm Bandpassfilter. Für die schnellste und empfindlichste Aufnahme eine so hohe Geschwindigkeit Digitalkamera verwenden. Erwerben Sie Bilder nach Bedarf.
   3. Messung der Veränderungen in der Fluoreszenz als Funktion der Zeit entweder bei einer einzigen Wellenlänge (Fluo-4) oder der Wellenlängen-Verhältnis unter Verwendung vonVerfahren (Fura-2), wie zuvor beschrieben , ^{8, 14.}

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Ergebnisse

Strenge Regulierung der Bakterienlast und der Temperatur der aCSF während der Inkubation ist wesentlich neuronalem Gewebe Lebensfähigkeit zu erhalten. 16 ° C (Abbildung 1) - dies kann mit UVC - Licht und Aufrechterhalten der Temperatur des aCSF bei 15 durch Bestrahlung optimiert werden. Des Weiteren Parameter der aCSF Stempel (APS; 1C) stellt die Experimentator mit einem Rekord von den Umgebungsbedingungen (pH - Wert und Temperatur.), So dass ein Gold...

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Diskussion

Dieser Artikel beschreibt eine Inkubation Methode, um die Lebensfähigkeit von akuten neuronalen Gewebe für die Bildgebung und elektrophysiologischen Experimenten zu verlängern, wodurch die Anzahl der Tiere zu reduzieren erforderlich, um experimentelle Ziele abzuschließen. Zwei Hauptprozesse regeln die Verschlechterung der neuronalen Gewebe im Laufe der Zeit: i) erhöhte Keimbelastung und die damit einhergehende Erhöhung der bakterielles Endotoxin freigesetzt, und ii) Exzitotoxizität , die das traumatische Slicing ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma Aldrich VETEC	V800372
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P9333
N-Methyl-D-glucamine	Sigma Aldrich	M2004
D-glucose	Sigma Aldrich	G5767
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014
Sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S2554
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	M9272
Calcium chloride	Sigma Aldrich	223506
Papain Dissociation System	Worthington	LK003150
Dimethyl sulfoxide anhydrous	Sigma Aldrich	276855
Pluronic F-127 Low UV absorbance*	Life technologies	P-6867	20% solution in DMSO
Fura-2 AM	Anaspec	84017
Fluo-4 AM	Life Technologies	F23917
Fluo-8 AM	Abcam	Ab142773
Vibrating blade microtome	Leica Biosystem	VT1200 S	Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device
Antivibration table	Kinetic Systems Vibraplane	Vibraplane 9100/9200
Fixed Stage Upright Microscope	Olympus	BX51WI
Microscope Objective	Olympus	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	20X
Microscope Objective	Olympus	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60X
CCD Camera	Andor	Ixon +
High speed wavelength switcher	Sutter instrument	Lambda DG-4
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B
Data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1440A	Axon Digidata® System
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instrument Co	BF150-86-10
Microelectrode puller	Sutter Instrument Co	P-97	Flaming/Brown type micropipette puller
Recording/perfusion chamber	Warner Instruments	RC-40LP	Low Profile Open Bath Chambers
Software	Molecular Devices	pClamp 10.2
Andor iQ Live Cell Imaging Software	Andor	Andor iQ3
Braincubator	Payo Scientific	BR26021976	www.braincubator.com.au
Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler	TE Technology	CP-121
Temperature Controller	TE Technology	TC-36-25 RS232