Verbesserte Sample Multiplexing von Gewebe mit Combined Precursor Isotopenmarkierung und Isobaric Tagging (cPILOT)

Zusammenfassung

Kombinierte Vorläufer Isotopenmarkierung und isobar Tagging (cPILOT) ist eine quantitative Proteomik-Strategie, die Probe Multiplexierungsfähigkeiten von isobar-Tags verbessert. Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung von cPILOT an Gewebe von einer Krankheit Mausmodell und Wildtyp-Kontrollen der Alzheimer.

Zusammenfassung

Es gibt eine steigende Nachfrage viele biologischen Proben für die Krankheit Verständnis und zur Entdeckung von Biomarkern zu analysieren. Quantitative Proteomik-Strategien, die gleichzeitige Messung mehrerer Proben ermöglichen haben sie weit verbreitet und stark experimentell Kosten und -zeiten reduzieren. Unser Labor entwickelt eine Technik namens kombiniert Vorläufer Isotopenmarkierung und isobar Tagging (cPILOT), die Ansätze Probe Multiplexen der traditionellen Isotopenmarkierung oder isobar Tagging verbessert. Globale cPILOT können auf Proben angewendet werden, die von Zellen stammen, Gewebe, Körperflüssigkeiten oder ganze Organismen und gibt Informationen über relative Proteinhäufigkeiten in verschiedenen Probenbedingungen. cPILOT arbeitet durch 1) Puffer mit niedrigeren pH Bedingungen unter Verwendung von Bedingungen , um selektiv dimethylate Peptid N-Termini und 2) mit hohem pH - Puffer mit im Handel erhältlichen Reagenzien isobaren primäre Amine der Lysinreste zu kennzeichnen (siehe Tabelle der Materialien / Reagenzien). Der Grad derProbe Multiplexen verfügbar ist abhängig von der Anzahl von Vorläufern Etikett verwendet, und das isobare Markierungsreagens. Hier stellen wir eine 12-Plex-Analyse unter Verwendung von leichten und schweren Dimethylierung kombiniert mit sechs-plex isobaren Reagenzien 12 Proben von Geweben der Maus in einer einzigen Analyse zu analysieren. Verbessern Multiplexen ist hilfreich zur Reduzierung experimentelle Zeit und Kosten, und was noch wichtiger ist, so dass in vielen Vergleichsprobenbedingungen (biologische Replikaten, Krankheitsstadium, medikamentöse Behandlung, Genotypen oder longitudinale Zeitpunkt) mit weniger experimentellen Bias und Irrtum. In dieser Arbeit wird der globale cPILOT Ansatz zur Analyse Gehirn, Herzen und Lebergewebe durch biologische Replikate von einer Alzheimer-Krankheit Mausmodell und Wildtyp-Kontrollen. Globale cPILOT können andere biologische Prozesse angewandt werden, studieren und angepasst Probe Multiplexen von mehr als 20 Proben zu erhöhen.

Einleitung

Proteomik beinhaltet oft die Analyse vielen Proben verwendet, um einen besseren Krankheitsprozess, Enzymkinetik, post-translationale Modifikationen, Reaktion auf Umweltreize, als Reaktion auf therapeutische Behandlungen, die Entdeckung neuer Biomarker oder Drogen Mechanismen zu verstehen. Quantitative Methoden können relative Unterschiede in Proteinspiegeln über die Proben zu messen, können verwendet werden, und markierungsfreie oder beinhalten Isotopenmarkierung (metabolic, chemische oder enzymatisch) werden. Stabilisotopenmarkierungsverfahren haben in der Popularität gewachsen, weil sie viele Proben erlauben gleichzeitig analysiert werden und eignen sich für Proben aus verschiedenen Zellen, Geweben, Körperflüssigkeiten oder ganzen Organismen. Isotopen - Markierungsverfahren ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7} Anstieg experimenteller Durchsatz,bei gleichzeitiger Reduzierung Erfassungszeit, Kosten und experimentelle Fehler. Diese Verfahren verwenden Vorläufermassenspektren relative Häufigkeiten von Proteinen aus Peptidpeaks zu messen. Im Gegensatz dazu isobaren Markierungsreagenzien ^{8, 9, 10} erzeugen Reporter - Ionen, die detektiert werden , entweder in MS / MS oder MS ^{3 11} Spektren und diese Peaks werden verwendet , auf dem relativen Abundanzen von Proteinen zu melden.

Die aktuelle Zustand-of-the-art in der Proteomik Multiplexen ist entweder eine 10-plex ¹² oder 12-plex isobaren tag Analyse ^13. Verbesserte Proben Multiplexing (dh> 10 Proben) Methoden wurden von unserem Labor für Gewebe ^{14 entwickelt, 15, 16, 17} und von anderen für die Analyse von Zellen ¹⁸ sup>, ^{19, 20,} Geweben ²¹ oder ²² gezielt Peptide. Wir entwickelten eine verbesserte Multiplex-Technik kombiniert Vorläufer Isotopenmarkierung mit isobar Tagging genannt (cPILOT). Globale cPILOT ist nützlich , um Informationen über die relativen Konzentrationen aller Proteine in den verschiedenen Probenbedingungen (≥12) ^14. Abbildung 1 zeigt einen allgemeinen cPILOT Workflow. Tryptic oder Lys-C - Peptide am N-Terminus mit Dimethylierung unter Verwendung von niedrigem pH - Wert bei ² und Lysinresten mit 6-Plex - Reagenzien unter Verwendung von hohem pH - Wert selektiv markiert. Diese Strategie verdoppelt die Anzahl der Proben, die mit isobar Reagenzien analysiert werden können, die Versuchskosten und zusätzlich zu reduzieren hilft, reduziert experimentelle Schritte und Zeit.

cPILOT ist flexibel, wie wir andere Methoden entwickelt haben oxidative post-translationale modi zu studierenfikationen, einschließlich 3-Nitrotyrosin-modifizierte Proteine ¹⁴ und Cystein enthaltenden Peptiden mit S-Nitrosylierung (oxcyscPILOT) ^23. Wir haben auch eine Aminosäure-selektiven Ansatz, Cystein cPILOT (cyscPILOT) ¹⁷ entwickelt. MS ³ Erwerb mit einem Top-Ionen ¹¹ oder selektiv-y ₁ -Ion Verfahren ¹⁵ kann Reporter Ionen Interferenz reduzieren und quantitative Genauigkeit der cPILOT verbessern. Die Verwendung von MS ³ in dem Erfassungsverfahren erfordert ein hochauflösendes Gerät mit einem Orbitrap - Massenanalysator obwohl niedrige Auflösung lonenfalle Instrumente auch ²⁴ arbeiten können.

Zuvor hat cPILOT verwendet Leberproteine ¹⁶ von einer Alzheimer-Krankheit Mausmodell zu untersuchen. Hier beschreiben wir, wie die globale cPILOT Analyse unter Verwendung von Gehirn, Herz durchzuführen, und Leberhomogenisaten die Rolle des periphe zu studierenry in der Alzheimer-Krankheit. Dieses Experiment beinhaltet biologische Replikation. Aufgrund der Vielseitigkeit von cPILOT können interessierte Benutzer die Technik verwenden, um andere Gewebe für eine Reihe von biologischen Problemen und Systemen zu untersuchen.

Protokoll

Ethik-Statement: Die Mäuse wurden an der Universität von Pittsburgh von einer unabhängigen, gemeinnützigen Einrichtung der biomedizinischen Forschung und beherbergten in der Abteilung für Labortier Ressourcen erworben hat. Alle Tierprotokolle wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der University of Pittsburgh genehmigt.

1. Proteinextraktion und Erzeugung von Peptiden für Chemisch-Tagging

1. Extraktprotein aus Geweben, Zellen oder Körperflüssigkeiten.
   1. Homogenisiert 60-90 mg Gewebe (zB Gehirn, Herz und Leber) in Phosphatpuffer - Salzlösung (1x PBS) mit 8 M Harnstoff (500 & mgr; l) unter Verwendung eines mechanischen Homogenisators. Protease oder Phosphatase-Inhibitoren können in den Puffer, wenn notwendig, hinzugefügt werden. In diesem Projekt wurden sie nicht verwendet. Verwenden Sie die folgenden Parameter für den Homogenisator: Lysismatrix A-Kügelchen, 4 m / s, 20 s. Herzgewebe kann bis zu 9 Zyklen der Homogenisierung erfordern.
      HINWEIS: Protease oder Phosphatasehemmer s kann den Puffer bei Bedarf hinzugefügt werden. Sie wurden in dieser Studie nicht verwendet.
      1. Entfernen Gewebshomogenisat aus dem Lysieren Rohr und Transfer in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Spülrohre mit 100-500 ul PBS mit 8 M Harnstoff und kombiniert, um die Spüllösung mit Gewebehomogenat lysieren.
   2. Zentrifugieren der homogenisierten Gewebe (9.447 xg, 4 ° C, 15 min) und sammle den Überstand.
2. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration eine Bicinchoninsäure (BCA) -Assay nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird .
   HINWEIS: Eine weitere Verdünnung mit Puffer notwendig sein kann, wenn die Proteinkonzentration zu hoch ist. Die resultierenden Konzentrationen für Proben aus diesen Geweben waren zwischen 6-13 ug / ul.
   1. Optional: Fügen Sie eine interne Qualitätskontrolle Standard (zB Rinder-Alpha - Casein oder andere exogene Protein) mit dem Verhältnis 1 & mgr; g - Standard: 100 ug Proteinprobe.

jove_title "> 2. Probenaufschluss

1. Füge 100 & mgr; g (100 x 10 ^-6 g) Protein aus jeder Probe einzeln Mikrozentrifugenröhrchen bezeichnet. Das Volumen ist abhängig von der Proteinkonzentration (siehe Schritt 1.2).
2. Hinzufügen Dithiothreitol (DTT) (40: 1 Molverhältnis Reagenz zu Probe) zu jeder Probe. Inkubieren bei 37 ° C für 2 h. Die Berechnung für das Molverhältnis von der Proteinmasse von Rinderserumalbumin (BSA) basiert, die 66,5 x 10 ³ g / mol ist.
3. Hinzufügen Iodacetamid (IAM) (80: 1 Molverhältnis Reagenz zu Probe) zu jeder Probe. Inkubieren auf Eis im Dunkeln für 2 Stunden. Diese Reaktion wird für 2 Stunden auf Eis durchgeführt, um Nebenreaktionen zu verhindern.
4. Hinzufügen L-Cystein (40: 1 Molverhältnis Reagenz zu Probe) zu jeder Probe. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
5. Zugabe von 20 mM Tris - Puffer mit 10 mM CaCl ₂ (pH 8,2) Harnstoff auf eine Endkonzentration von 2 M zu verdünnen
6. Hinzufügen L-1-Tosylamido-2 phenylethyl-chlormethylketon (TPCK) -behandelten Trypsin (50: Substrat 1 mol-Verhältnis) zu jeder Probe und inkubiere für 24 h bei 37 ° C bis Enzym.
7. Quenche die Proteinverdauung durch Flash-Gefrieren der Probe in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C bis zur Weiterverarbeitung.

3. Probe Entsalzung

1. Re-säuert die Proben durch Zugabe von Ameisensäure (FA). Fügen Sie genug FA eine Endkonzentration von 0,1% zu erhalten. Wenn Proben ursprünglich bei -80 ° C sind, tauen Proben auf Eis vor dem erneuten Ansäuerung.
2. De-Salz der Peptide C ₁₈ hydrophilic lipophilic ausgewogen (HLB) 10 mg Kartuschen , wie zuvor unter Verwendung von ¹⁶ beschrieben.
3. Trockne die Proben durch Vakuumzentrifugation (5 Torr, 45 ° C, 77 × g) auf ein Volumen von ~ 10 & mgr; l.

4. Dimethylierung Labeling (N-Termini)

1. Rekonstituieren Peptide in 1% Essigsäure (0,25 ug / ul) in Hochleistungsflüssigkeitschromatographie aufgelöst (HPLC) oder Nano reiner Qualität Wasser. Entfernen Sie eine 50 μ; G-Teil in ein neues Röhrchen Mikrozentrifuge (1,5 ml), und den Rest bei -80 ° C lagern.
2. Aus 8 ul 60 mM (4%) CH ₂ O (37% wt / v) oder 60 mM (4%) , ¹³ CD ₂ O (20% wt / v) zu den Proben zur Markierung mit leichter oder schwerer Dimethylierung bzw. . Typischerweise wird 4 & mgr; l Reagenz pro 25 ug Peptiden hinzugefügt (Schritte 4.2, 4.3, 4.6).
3. Aus 8 & mgr; l 24 mM NaBH ₃ CN oder 24 mM NaBD ₃ CN zu den markierten Proben mit leichter oder schwerer Dimethylierung, respectively.
4. Vortex und schütteln auf einem Rohr Schüttler für ~ 10 min bei Raumtemperatur.
5. Quenche die Reaktion durch 16 ul 1% igem Ammoniak Zugabe (~ 28-30% v / v) für 5 min. Typischerweise wird, 8 & mgr; L Reagens pro 25 & mgr; g Peptide zugegeben.
6. Re-säuert die Reaktionsgemische durch Zugabe von 8 & mgr; l von 5% FA (98% v / v).
7. Kombinieren , um die leichten und schweren dimethyliert Peptide (Abbildung 1) insgesamt sechs Proben zu erzeugen. Siehe Tabelle 1 für eine Beschreibung der Probe Tagging und Pooling für diese Studie verwendet.
8. Führen Probe Entsalzen gemäß den Schritten 3.2 und 3.3.

5. Isobare Tagging (Lys-Reste)

1. Rekonstituieren 100 ug dimethyliert Peptide (1 ug / ul) in 100 mM tri-ethyl Ammoniumbicarbonat (TEAB) Puffer (pH ~ 8,5).
2. Bereiten Sie isobar Reagenzien wie in dem Protokoll des Herstellers angegeben (siehe Tabelle der Materialien / Reagenzien).
3. In solubilisierten isobar Reagenzien (41 ul) auf Peptide und Wirbel für ~ 10 s. Schütteln Sie die Proben auf einem Mikrozentrifugenröhrchen Schüttler für ~ 1 h. Quenche die Reaktion mit 8 ul Hydroxylamin (10% w / v) und inkubiere die Proben für 15 min bei Raumtemperatur.
4. Pool mit sechs markierten Proben in einer einzigen Mischung und entsalzen (Schritte 3.1-3.3) oder bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
   HINWEIS: Proteom Abdeckung und Tiefe zu verbessern, eine mehrdimensionale Trennung Strategie wird vorgeschlagen,wie starker Kationenaustausch (SCX).

6. Starker Kationenaustausch

1. Führen SCX gemäß dem Protokoll des Herstellers (siehe Materialien Tabelle).
   1. Bereiten ~ 1 ml Ammoniumformiat-Lösungen (20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM, & 500 mM) mit 10% Acetonitril (ACN), 0,1% FA (pH 3).
   2. Entfernen Sie die rote Kappe vom oberen Ende der Pipettenspitze und anschließend auf die Pipettenspitze mit der Aufschlämmung verpacken, um sicherzustellen, dass das Verpackungsmaterial in Richtung der Unterseite der Pipettenspitze ist.
      HINWEIS: Kritisch: Werfen Sie nicht die Pipettenspitze bis zum Ende des Protokolls.
   3. Platzieren Sie den Zentrifugen Adapter auf der Oberseite eines Mikrozentrifugenröhrchen (2 mL) und befestigen im Inneren der Pipettenspitze.
   4. In 150 ul SCX Rekonstitutionspuffers zu Pipettenspitzen.
   5. Zentrifugierte die Pipettenspitzen für 6 min bei Raumtemperatur (4,000 xg). Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal und entsorgen den Abfall.
   6. Man löst die peptides in 150 ul SCX Rekonstitutionspuffer. Sicherzustellen, dass der pH 3 ist.
   7. In Peptide an den Pipettenspitzen, Zentrifuge (siehe 6.1.5) und die Eluenten halten.
   8. Übertragen der Filter und Pipette in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen (2 ml) gelöst und 150 ul 20 mM Ammoniumformiat-Lösung. Zentrifuge 6 Minuten bei Raumtemperatur (4000 xg) und halten die Eluenten.
   9. Wiederholen Sie Schritt 6.1.8 sieben weitere Male unter Verwendung von aufeinander folgenden Konzentrationen (dh 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM und 500 mM) Ammoniumformiat.
2. Überträgt die acht Fraktionen zu SCX Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml) und engt sie durch zentrifugale Verdampfung (siehe Schritt 3.3).

7. Flüssigchromatographie-Tandem - Massenspektrometrie (LC-MS / MS) und MS ³

1. Rekonstituieren der Peptide in der Massenspektrometrie-Wasser mit 0,1% FA, Filter, aufnehmen und in einem Auto-sampler Phiole. Filter Peptide als Follows:
   1. Hinzufügen rekonstituiert Peptide zu einem Mikrozentrifugenröhrchen einen 0,65 um - Filter (siehe Materialien Table) enthält.
   2. Zentrifuge Peptide bei 12.000 × g für 1 min. Filter entfernen, verwerfen, und fügen gefiltert Peptide in einem Autosampler Fläschchen.
2. Bereiten Sie die mobile Phase Puffer wie folgt: 3% (v / v) ACN mit 0,1% FA (A) und 100% ACN mit 0,1% FA (B).
3. Einzuspritzen 6 ul jeder Fraktion SCX Probe auf eine Säule gepackte trap bis 2 cm mit C ₁₈ - Material (5 um, 200 Å Porengröße).
   HINWEIS: Probenreinigung auf der Falle ist wie folgt: 3 min, 0% B; 3 & mgr; L / min ein 2D - Flüssigkeitschromatographie - System (siehe Materialien Tabelle).
4. Führen Sie die analytischen Trennverfahren. Verwenden , um eine 75 um ID x 13,2 cm Laser ausgezogene Spitze Quarzglas - Kapillarsäule , gepackt mit C ₁₈ - Material (5 um, 100 Å). Der Gradient: 0-5 min, 10% B; 5-40 min, 10-15% B; 40-90 min, 15-25% B; 90-115 min, 25-30% B; 115-130 min 30-60% B; 130-135 min 60-80% B; 135-145 min 80% B, 145-150 min 80-10% B; 150-180 min, 10% B; 300 Nl / min, 180 min.
5. Führen Sie die Datenerfassung für das Massenspektrometer, während die analytischen Trennverfahren laufen.
   HINWEIS: Die Parameter für die Übersichtsabtastung MS sind wie folgt: 400-1,600 m / z, 60000 Auflösung, automatische Verstärkungsregelung (AGC) -Target 1 x 10 ⁶ Ionen, die maximale Einspritzzeit 500 ms. Parameter für die CID-MS / MS wie folgt: Top 1-7 oder 8-14 Top datenabhängigem Erfassung (DDA), 3 m / z Isolationsbreite, 500 minimales Signal, 35% normalisierten Kollisionsenergie (NCE), 0,25 q Aktivierungs , 10 ms Aktivierungszeit, 3 x 10 ⁴ AGC, 50 ms maximale Einspritzzeit. Parameter für die HCD-MS ³ sind wie folgt: 200 minimales Signal, 4 m / z Isolationsbreite, 60% NOA, 0,1 Aktivierungszeit, 3 x 10 ⁵ AGC, 250 ms IT, 300-1,300 m / z MS / MS Auswahllbereich ausschließen, un-fragmentierten Stammion.
6. Führen Sie jede Analyse in zweifacher Ausfertigung sowohl für die Top-1-7 und 8-14 oben läuft.
   HINWEIS: Für die Proben auf ein neueres Modell eines Instruments führen eine Orbitrap oder eine tribrid Massenspektrometers enthält, DDA Parameter variiert und optimiert werden können , um mehr MS / MS und MS ³ Scans enthalten. Zusätzlich für tribrid Instrumente, Synchron Vorläufer Auswahl (SPS) -MS ³ eingesetzt werden soll.

8. Datenanalyse ¹⁶

1. Suche die RAW-Dateien Protein-Analyse-Software gegen eine entsprechende Datenbank, wie Maus Uniprot.
   HINWEIS: Es ist wichtig, zwei Workflows für jede RAW-Datei, um für leichte und schwere dimethyliertem Peptiden suchen zu erstellen.
2. Suche die RAW-Dateien mit den folgenden Parametern: Trypsin mit zwei verpassten cleavages, Peptidmassenbereich 300-6,000 Da, 15 ppm Muttermassentoleranz, Da 1 Fragmentierungstoleranz. Statische Änderungen: Licht Dimethylierung (28,031, Peptid-N-Terminus) oder HEavy Dimethylierung (36,076 Da, Peptid-N-Terminus), carbamidomethyl (57,021 Da, C).
   Hinweis: Manchmal ist die schwere dimethyliertem Spitze ist ~ 7 Da (35,069 Da, Peptid N-Terminus) ist von der Licht dimethyliertem Spitze und sollte daher in das Such Workflow für schwere dimethyliertem Peptide eingebaut werden. Dynamische Änderungen: Oxidation (15,995 Da, M), 6-plex isobaren tag (229,163 Da, K). Fügen Sie eine Lockvogel - Datenbank suchen False Discovery Rate (zB 1 und 5%) und eine Quantifizierung Knoten für die Reporter Ionenintensitäten von isobar Tags suchen zu erhalten.
3. Statistiken
   1. Export von Daten in ein elektronisches Tabellenkalkulationsprogramm, um Protein-Reporter-Ionenwerte zu normalisieren. Für jedes Protein, teilen entweder die mediane reporter Ionenverhältnisse oder rohe reporter Ionenintensitäten durch den Median-Verhältnis des internen Standards oder rohe reporter Ionenintensitäten des internen Standards, respectively. Verwenden Sie die entsprechende Statistik-Software wie zum Beispiel ein Tabellenkalkulationsprogramm, Perseus oder R zu signifikanten Veränderungen bei den Probenbedingungen zu bestimmen.

Ergebnisse

cPILOT verwendet Aminbasis Chemie zu Label-Peptide am N-Terminus chemisch und Lysinreste und verbessert Probe Multiplexing-Funktionen. Abbildung 2 zeigt repräsentative MS - Daten , die von einem 12-plex cPILOT Analyse von Gehirn, Herz, Leber und Geweben von einer Alzheimer-Krankheit - Maus - Modell und Wildtyp - Kontrollen erhalten wird. Wie in Tabelle 1 gezeigt, zwei biologische Replikate für die Alzheimer-Krankheit und Wildtyp - Mäuse werden in dies...

Diskussion

cPILOT ermöglicht die gleichzeitige Messung von mehr als 12 einzigartigen Proben. Um bei erfolgreichen Tagging, um sicherzustellen, sowohl des N-Terminus und Lysinresten von Peptiden, ist es zwingend notwendig, den richtigen pH-Wert für jeden Satz von Reaktionen zu haben und die Dimethylierung Reaktion zunächst für die Peptidmarkierung durchzuführen. Selective Dimethylierung am N-Terminus wird durch einen pH-Wert bei etwa 2,5 (± 0,2) durchgeführt. Dies wird durch Ausnutzung der Unterschiede der pKa der Aminogrupp...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Water - MS Grade	Fisher Scientific	W6-4	4 L quantity is not necessary
Acetonitrile - MS Grade	Fisher Scientific	A955-4	4 L quantity is not necessary
Acetic Acid	J.T. Baker	9508-01
Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)	Sigma Aldrich	320145-500ML
Ammonium formate	Acros Organics	208-753-9
Formic Acid	Fluka Analytical	94318-250ML-F
BCA protein assay kit	Pierce Thermo Fisher Scientific	23227
Urea	Biorad	161-0731
Tris	Biorad	161-0716
Dithiothreiotol (DTT)	Fisher Scientific	BP172-5
Iodoacetamide (IAM)	Acros Organics	144-48-9
L-Cysteine	Sigma Aldrich, Chemistry	168149-25G
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas	Sigma Aldrich, Life Science	T1426-100MG
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O	Sigma Aldrich, Life Science	F8775-25ML
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C	Sigma Aldrich, Chemistry	596388-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%	Sigma Aldrich	156159-10G
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP	Sigma Aldrich, Chemistry	190020-1G
Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit	Protea BioSciences	SP-155-24kit
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer	Sigma Aldrich, Life Science	T7408-100ML
Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg)	Thermo Fisher Scientific	90061
Hydroxylamine hydrochloride	Sigma Aldrich, Chemistry	255580-100G
Standard vortex mixer	Fisher Scientific	2215365	any mixer can be used
Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridges	Waters	186000383	These are C18 cartridges
Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model	Sigma Aldrich	57265	A 12 port model is also sufficient
Speed-vac	Thermo Scientific	SPD1010	any brand of speed vac is sufficient
Water bath chamber	Thermo Scientific	2825/2826	Any brand of  a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient.
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)	MP Biomedicals	116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler	Sciex	-	This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer	Thermo Scientific	-	This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Protein software (e.g. Proteome Discoverer)	Thermo Scientific	IQLAAEGABSFAKJMAUH
Analytical balance	Mettler Toledo	AL54
Stir plate	VWR	12365-382	Any brand of stir plates are sufficient
pH meter (Tris compatiable)	Fisher Scientific (Accumet)	13-620-183	Any brand of a pH meter is sufficient
pH 10 buffer	Fisher Scientific	06-664-261	Any brand of pH buffer 10 is sufficient
pH 7 buffer	Fisher Scientific	06-664-260	Any brand pH buffer 7 is sufficient
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk	Fisher Scientific	05-408-129	Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk	Fisher Scientific	04-408-120	Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units	EMD Millipore	UFC30DV00
2 mL microcentrifuge tubes, 72 units	Thermo Scientific	69720
C18 packing material (5 µm, 100 Å)	Bruker	PM5/61100/000	This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient
C18 packing material (5 µm, 200 Å)	Bruker	PM5/61200/000	This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient