Analyse dendritischer Morphologie in Spalten und Schichten

Zusammenfassung

Hier zeigen wir , wie dendritische Routing von Drosophila Medulla Neuronen in Spalten und Schichten zu analysieren. Der Workflow enthält einen Dual-View-Imaging-Technik, um die Bildqualität und Computational Tools für das Aufspüren, Registrierung dendritischen Dorne auf die Referenzspaltenanordnung und für die Analyse der dendritischen Strukturen in 3D-Raum zu verbessern.

Zusammenfassung

In vielen Regionen des zentralen Nervensystems, wie beispielsweise die Fliegen optic Lappen und der wirbel cortex werden in Schichten und Säulen synaptischen Schaltungen organisiert Gehirn Verdrahtung während der Entwicklung und der Informationsverarbeitung in den entwickelten Tieren erleichtern. Postsynaptischen Neuronen aufwendige Dendriten in typspezifische Muster in bestimmten Schichten mit entsprechenden präsynaptischen zu Synapse. Die Fliege medulla Neuropil besteht aus 10 Schichten und 750 Spalten; jede Spalte von Dendriten von mehr als 38 Arten von Medulla Neuronen innervated, die mit den axonalen Terminals einiger 7 Arten von Afferenzen in einem typspezifischen Art und Weise entsprechen. Dieser Bericht beschreibt die Verfahren zur Abbildung und Dendriten der Medulla Neuronen zu analysieren. Der Workflow besteht aus drei Abschnitten: (i) die Dual-View-Abbildungsabschnitt verbindet zwei konfokale Bildstapel in orthogonalen Richtungen in eine hochauflösende 3D-Bild von Dendriten gesammelt; (Ii) die Dendriten Verfolgung und Registrierung Abschnitt Spuren dendritischenDorne in 3D und registriert auf die Referenzspaltenanordnung dendritischen Spuren; (Iii) die dendritische Analyseabschnitt analysiert dendritische Muster in Bezug auf Spalten und Schichten, einschließlich der schichtspezifischen Termination und planar Projektionsrichtung dendritischer Dorne und leitet Schätzungen von dendritischen Verzweigungs und Termination Frequenzen. Die Protokolle verwenden benutzerdefinierte Plugins gebaut auf der Open-Source-MIPAV (Medical Imaging Verarbeitung, Analyse und Visualisierung) Plattform und benutzerdefinierte Toolboxen in der Matrix Laborsprache. Zusammen bieten diese Protokolle einen vollständigen Arbeitsablauf die dendritische Routing von Drosophila medulla Neuronen in Schichten und Säulen zur Analyse, Zelltypen zu identifizieren, und Defekte in Mutanten zu bestimmen.

Einleitung

Während der Entwicklung Neuronen aufwendige Dendriten in komplexen, aber klischee verzweigten Muster Synapsen mit ihren präsynaptischen Partnern zu bilden. Dendritische Verzweigungsmuster korrelieren mit neuronalen Identität und Funktionen. Die Standorte der dendritischen Dorne bestimmen die Art der präsynaptischen Eingänge sie erhalten, während die dendritischen Komplexität und Feldverzweigungsgrößen die Eingangsnummer regeln. Somit sind dendritische morphologischen Eigenschaften kritische Determinanten für die synaptische Verbindungen und neuronale Berechnung. In vielen Regionen der komplexen Gehirnen, wie beispielsweise die Fliegen optic Lappen und der wirbel Retina sind in Spalten und Schichten synaptischen Schaltungen organisiert Informationsverarbeitungs ^{1, 2} zu erleichtern. In einer solchen Spalte und Schicht Organisation, präsynaptischen Neuronen einer deutlichen Modalität Projekt Axone zu einer bestimmten Schicht zu beenden (sog Schicht-spezifisches Targeting) und eine geordnete zweidimensionale Anordnung zu bilden (so called topographische Karte), während postsynaptischen Neuronen Dendriten von geeigneter Größe in bestimmten Schichten erweitern präsynaptischen Eingänge der richtigen Typen und Zahlen zu erhalten. Während axonalen zu Schichten und Spalten Targeting gut ³ untersucht ^{wurde, 4,} ist viel weniger bekannt , wie Dendriten auf bestimmte Schichten geleitet werden und erweitern geeigneter Größe rezeptiven Felder ⁵ synaptischen Verbindungen mit den richtigen präsynaptischen Partnern zu bilden. Die Schwierigkeit der Bildgebung und Quantifizierung von dendritischen zu Schichten und Spalten Targeting hat die Studie von dendritischen Entwicklung in säulen und laminierten Hirnstrukturen behindert.

Drosophila Medulla Neuronen sind ein ideales Modell für dendritische Routing und Schaltungsanordnung in Spalten und Schichten zu studieren. Die Fliege Medulla neuropil wird als 3D-Gitter aus 10 Schichten organisiert und etwa 750 Spalten. Jede Spalte ist durch einen Satz von Afferenzen innervated, einschließlich photoreceptors R7 / R8 und Lamina Neuronen L1 - L5, deren axonalen Terminals bilden topographische Karten in einem schichtspezifisch ^6. Über 38 Arten von Medulla Neuronen sind in jedem Medulla Spalte und aufwendige Dendriten in bestimmten Schichten und mit entsprechenden Feldgrößen Eingänge aus diesen afferents ⁷ zu erhalten. Die synaptischen Schaltungen in der Medulla wurden bei der elektronenmikroskopischen Ebene rekonstruiert; Somit werden die synaptischen Partnerschaften gut ^{7 etabliert, 8.} Darüber hinaus genetische Werkzeuge für verschiedene Arten von Medulla Neuronen Kennzeichnung sind vorhanden ^{9, 10, 11.} Durch die Untersuchung drei Arten von transmedulla (Tm) Neuronen (Tm2, TM9 und TM20) haben wir bisher zwei identifizierten Zelltyp-spezifischen dendritischen Eigenschaften: (i) Tm Neuronen Dendriten in entweder der vorderen oder hinteren Richtung projizieren (planar projection Richtung) in Abhängigkeit von den Zelltypen und (ii) Dendriten der Medulla Neuronen enden in spezifischen medulla Schichten in einer zelltypspezifischen Weise (Schicht spezifische Terminierung) ^12. Planar Projektionsrichtung und schichtspezifische Terminierung sind ausreichend, um diese drei Arten von Tm Neuronen zu differenzieren, während Mutationen, die Tm Antworten auf Schicht und Spalten Cues beeinflussen verschiedene Aspekte dieser Attribute stören.

Hier präsentieren wir einen kompletten Workflow für die Prüfung des dendritischen Strukturierung von Drosophila Medulla Neuronen in Spalten und Schichten (Abbildung 1). Zuerst zeigen wir ein Dual-View-Bildgebungsverfahren, die kundenspezifische Software verwendet zwei konfokalen Bild zu kombinieren, stapelt hochwertige isotropen Bilder zu erzeugen. Diese Methode erfordert nur konventionelle konfokale Mikroskopie qualitativ hochwertige Bilder zu erzeugen, die für die zuverlässige Verfolgung von dendritischen Verzweigungen erlauben, ohne Mikroskopie mit Superauflösung zurückgreifen, wie eins STED (Stimulated Emission Depletion) oder strukturelle Beleuchtung. Zweitens stellen wir ein Verfahren zur dendritischen Dorne Tracing und zu einer Referenzspaltenanordnung der resultierenden Neuriten Spuren Registrierung. Drittens zeigen wir die Berechnungsmethoden für die Informationen auf der ebenen Projektionsrichtung und schichtspezifische Beendigung von Dendriten Extraktion sowie für Schätzungen für dendritischen Verzweigungen und Beendigung Frequenzen abzuleiten. Zusammen ermöglichen diese Verfahren für die Charakterisierung von dendritischen Muster in 3D, die Klassifizierung der Zelltypen auf dendritischen Morphologien basiert, und die Identifizierung von möglichen Defekten in Mutanten.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

Hinweis: Das Protokoll enthält drei Abschnitte: Dual-View - Bildgebung (Abschnitte 1 - 3), dendritische Verfolgung und Registrierung (Abschnitte 4 - 6) und dendritischen Analyse (Abschnitte 7-9) (Bild 1). Die Codes und Beispieldateien sind in Tabelle der Materialien / Ausrüstung zur Verfügung gestellt.

1. Dual Image Acquisition

HINWEIS: Dieser Schritt ist so konzipiert, in zwei orthogonalen (horizontal und frontal) Orientierungen zwei Bildstapeln des Neurons von Interesse zu erwerben.

1. Bereiten Sie Fliege Gehirne , die spärlich markiert enthalten Medulla Neuronen (~ 10 Zellen / Hirnlappen) mit einer Membran GFP - Marker (mCD8GFP), wie zuvor beschrieben ^12. Beflecken das Gehirn mit Kaninchen-Anti-GFP (für medulla Neuron Dendriten) und Maus mAb24B10 (für Photorezeptor Axone), primären Antikörpern und fluoreszierend sekundären Antikörper (Alexa 488-anti-Kaninchen und Alexa 568-Anti-Maus-Antikörper), wie zuvor beschrieben,13. Deaktivieren Sie das Gehirn in 70% Glycerin in 1x PBS.
2. Um das Gehirn in der horizontalen Ausrichtung montieren (2A, B), übertragen Sie die Glycerin abgefertigt Fliegenhirn zu einer 20 & mgr; l Tropfen Antifade Eindeckmedium in der Mitte einer Folie.
3. Bringen Sie kleine Flecken aus Ton an den vier Ecken des Deckglases während der Montage des Deckglases aus Zerkleinern der Hirnprobe zu verhindern.
   HINWEIS: Die Ton-Patches Dämpfung bieten das Deckglas aus Zerkleinern der Probe zu verhindern. Jeder Ton Pflaster sollte etwa 1 mm im Durchmesser sein.
4. Unter einem Binokular, positionieren Sie die Gehirne in der ventralen-up-Position und legen Sie das Deckglas auf das Gehirn zu sichern. Verwenden Sie die konvexe dorsale Oberfläche des Gehirns als Wahrzeichen der Ausrichtung des Hirnprobe (2A) zu identifizieren.
5. Rufen Sie das erste Bildstapel (horizontale Ansicht) mit einem konfokalen Mikroskop. Verwenden eines Hoch NA Objektivlinse (wie beispielsweise ein 63X 1,3 NA Glycerin oder Ölkapselung objective-Objektiv) und 2,5X Digitalzoom (die Pixelgröße ist 0,105 & mgr; m pro Pixel; Mittelungszahl ist 2). Erwerben mehr als 180 optische Abschnitte (512 x 512 Pixel), die Medulla Neuropil mit einer Schrittweite von 0,2 & mgr; m abzudecken.
6. Montieren Sie das Gehirn, wie beschrieben in Schritten von 1,3 bis 1,4, aber auszurichten das Gehirn in der anterior-up-Position (Vorderansicht).
7. Erwerben Sie den zweiten Bildstapel (von vorne gesehen) des gleichen Neuron, wie in Schritt 1.5 beschrieben.
   HINWEIS: Um die gleiche Neuron zu finden, könnte eine Herausforderung sein, wenn es in den optischen Loben markiert zahlreiche Neuronen sind. Um die gleichen Neuronen aus beiden Orientierungen, niedrigere Vergrößerung Bildstapel aus beiden Ansichten identifizieren erforderlich sein könnten (beispielsweise verwenden, um einen Zoom von 0,7 und eine Schrittgröße von 0,45 & mgr; m mit niedriger Auflösung Bildstapel zu erwerben). Wenn das Bild größer als 512 x 512, sollte das Bild auf 512 x 512 vor der Bildkombination abgeschnitten werden, und die Pixelgröße bei 0,105 & mgr; m pro Pixel behalten sollte, während die große Feldabbildung. Signalverlustist ein potenzielles Problem für tiefe Gewebe. Wenn das Signal schwach ist, Bild die ventrale Hälfte des Gehirns. Zur Reduzierung der Photobleichens während des Scannens, verwenden Sie eine so niedrige Laserleistung wie möglich. Verwenden Sie die Bereichsanzeige für Überbelichtung zu überprüfen, bevor Bildstapel zu erwerben. Wenn möglich, verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit GaAsP Detektoren ausgestattet.
8. Identifizieren und die Position des Neurons von Interesse in Bezug auf die Medulla Neuropil (rechts / links [R / L] und dorsal / ventral [D / V]) aufzeichnen. Überprüfen Sie, ob die Probe durch die Untersuchung der Bildstapel während der Bildaufnahme bewegt.
   HINWEIS: Beispielbewegungs unsachgemäße Montage häufig zurückzuführen ist. Wenn Probenbewegung auftritt, kann der Bildstapel nicht für die Registrierung verwendet werden und muss entsorgt werden. Re-Montage der Probe und Bildstapel aus demselben Neuron erwerben.

2. Bilddekonvolution

HINWEIS: Der Entfaltungsschritt verwendet Bilddekonvolution Software, um die aufgenommenen Bilder wiederherzustellen, die abgebaut werden, durch Verwischenund Rauschen. Während dieser Schritt ist optional, es verbessert die Bildqualität signifikant. Es wird empfohlen, in Abschnitt 3 entfalteten Bildstapel für Bildregistrierung und Kombination zu verwenden.

1. Starten Sie die Entfaltungsprogramm im interaktiven Modus. Legen Sie das Bildstapel (in lsm oder spezifische mikroskopische Format), indem Sie Menü: Datei / Öffnen (oder Ctrl-o) im Hauptfenster.
2. Klicken Sie auf das geladene Bild Stapel zu wählen, und wählen Sie Menü: Ops das Bild Betriebsfenster zu öffnen. Verwenden Sie den Standard Klassische Maximum Likelihood Estimation (CMLE) Algorithmus.
3. Im Bild Betrieb Fenster auf die Registerkarte "Parameter". Geben Sie die entsprechenden Parameter für die Linse Immersionsmedium, Einbettungsmittel, und die numerische Apertur (zB Öl, Glycerin, etc.) (ZB Sionsöl, etc.) (NA; hier wurden 1,3) verwendet. Überprüfen Sie die übrigen Parameter, um sicherzustellen, dass sie korrekt die Abbildungsbedingungen zu reflektieren. Klicken Sie auf die "alle überprüften Stellen" Registerkarte finalize die Parametereinstellungen.
4. Im Bild Betrieb Fenster auf die "Operation" Registerkarte. Zuweisen einer Ausgabeziel (z, c). Geben Sie die entsprechenden Zahlen in "Signal / Rausch - pro - Kanal" (zB "12 12 12 12" ist ein guter Ausgangspunkt, während die Standardeinstellung ist "20 20 20 20"). Verwenden Sie die Standardeinstellungen für die restlichen Parameter.
5. Klicken Sie auf den "Run Command" Registerkarte zum Starten der Bildstapel Entfalten; dieser Vorgang bis zu zehn Minuten dauern kann, zu vervollständigen, auf dem Computer ab.
6. Im Hauptfenster klicken und den entfalteten Bildstapel aus. Wählen Sie Menü: Speichern unter den entfalteten Bild in der ICS-Bilddateiformat (.ics und .ids) zu speichern.
   HINWEIS: Jeder Bildstapel hat zwei Dateien: die ics-Datei enthält die Header-Informationen und die Iden-Datei enthält die Raw-Bildinformationen.
   1. Benennen Sie die Bildstapel Dateien entsprechend der Abbildungs Orientierung (zB Name der horizontale Betrachtungsbild sStifte H.ids und H.ics und der frontalen Ansicht Bildstapel F.ids und F.ics).

3. Dual-View Bildkombination

Hinweis: Dieser Schritt verbindet zwei Bildstapeln hochauflösende 3D-Bilder mit der MIPAV Software zu erzeugen.

1. Generieren von Matrizen für Bildkombination.
   1. Starten Sie das Programm MIPAV. Laden Sie die H und F-Bildstapeln unter Menü: Datei / Bild öffnen (A) von der Festplatte (oder Ctrl-f) /H.ids und F.ids; das Fenster zwei Bilder zeigen.
   2. Wählen Sie das H Bild durch Klick auf das Bild und wählen Menü: Utilities / Conversion Tools / RGB / Grays; Das Fenster zeigt GrayG, GrayB und GrayR Bilder.
   3. Schließen GrayR und GrayB, halten nur GrayG auf dem Fenster.
   4. Wählen Sie das F-Bild durch das Bild klicken und wählen Menü: Utilities / Conversion Tools / RGB / Grays. Das Fenster zeigt GrayG1, GrayB1 und GrayR1 Bilder.
   5. Schließen GrayR1 und GrayB1 und nur GrayG1 auf dem Fenster zu halten. Bei diesem Schritt nur GrAyg und GrayG1 sind auf dem Fenster.
   6. Wählen Sie das GrayG (markieren) Wählen Sie Menü: Algorithmen / Registrierung / Optimierte automatische Bildregistrierung; die "Optimierte automatische Bildregistrierung 3D" wird im Dialogfeld eingeblendet.
      1. In den Eingabeoptionen, ändern Sie die "Freiheitsgrade" von default "Affine-12" bis "Spezifische rescale-9". In "Verdrehungen" Schlüssel in -105 bis 105 in der "Drehwinkel Sampling-Bereich" (Standard: -30 bis 30 Grad), 10 in der "Coarse Winkelinkrement" (Standard: 15 Grad) und 3 im "Fein Winkelinkrement "(Standard: 6 Grad).
   7. OK klicken; die erste Matrix "GrayG_To_GrayG1.mtx" im Bild-Ordner erstellt und gespeichert werden. Schließen Sie alle Bildfenster und gehen Sie zum nächsten Schritt; Dieser Schritt wird mindestens 15 Minuten dauern.
   8. Laden Sie die H und F-Bildstapeln unter Menü: Datei / Bild öffnen (A) von der Festplatte (oder Ctrl-f) /H.ids und F.ids, wie in Schritt 3.1.1.
   9. Wählen Sie das H Bild durch Klick auf das Bild und wählen Menü: Utilities / Conversion Tools / RGB / Grau; die "RGB-> Gray" wird im Dialogfeld eingeblendet. OK klicken; das Fenster "HGray" Bilder zeigen. Halten Sie HGray und das H Bild zu schließen.
   10. Wiederholen Sie Schritt 3.1.9 für das F-Bild; die "FGray" Bilder werden auf dem Fenster angezeigt. Halten Sie FGray und schließen Sie das F-Bild; nur HGray und FGray wird auf dem Fenster belassen werden.
   11. Wählen Sie das HGray Bild (markieren) und gehen Sie zu Menü: Algorithmen / Transformation Tools / Transformation. Die "Transform / Bild neu berechnen" Dialogfeld erscheint. Klicken Sie auf die "Resampling" Registerkarte und ändern Sie das Resampling der Größe von "HGray" auf "FGray". Als nächstes klicken Sie auf den "Transform" Tab und Last "GrayG_To_GrayG1.mtx" durch die Auswahl von "Read-Matrix aus einer Datei." OK klicken; das Fenster wird das HGray_transform Bild zeigen. Schließen Sie das HGray Bild so nur HGray_transform und FGray sind auf dem Fenster links.
   12. Wählen Sie den "HGray_transform & #34; Bild (markieren) und gehen Sie zu Menü: Algorithmen / Registrierung / Optimierte automatische Bildregistrierung. Die "Optimierte automatische Bildregistrierung 3D" Dialogfeld erscheint. In "Verdrehungen" Schlüssel -5 bis 5 in der "Drehwinkel Sampling-Bereich" (Standard: -30 bis 30 Grad), 3 in der "Coarse Winkelinkrement" (Standard: 15 Grad) und 1 im "Fein Winkelinkrement "(Standard: 6 Grad). OK klicken.
       HINWEIS: Die Affine Matrix (HGray_transform_To_FGray.mtx) im Bildordner und dem "HGray_Transform_register" Bild erzeugt und gespeichert werden auf dem Fenster angezeigt. Dieser Schritt wird mindestens 40 Minuten dauern.
   13. Schließen Sie das "HGray_transform" Bild; nur "HGray_Transform_register" und "FGray" sollte auf das Fenster verlassen werden.
   14. Wählen Sie den "HGray_Transform_register" Bild (markieren) und gehen Sie zu Menü: Algorithmen / Registrierung / B-Spline Automatische Registrierung 2D / 3D. Die "B-Spline Automatische Registration-3D-Intensität "wird im Dialogfeld eingeblendet. Wählen Sie" Least Squares "in der Kostenfunktion (die Standardeinstellung ist Correlation Ratio).
       1. Klicken Sie auf "Perform zwei Pass Registrierung". Im Pass 1 Abschnitt Schlüssel in 2 in "Gradient Descent Minimieren Schrittgröße (Probeneinheiten)" (Standard ist 1) und Schlüssel in 10 in die "maximale Anzahl von Iterationen:" (die Standardeinstellung ist 10). Im Pass 2 Abschnitt, Schlüssel in 1 in "Gradient Descent Minimieren Schrittgröße (Probeneinheiten)" (die Standardeinstellung ist 0.5) und Schlüssel in 2 in die "maximale Anzahl von Iterationen:" (die Standardeinstellung ist 10).
          HINWEIS: Die NLT Matrix "HGray_transform_register.nlt", wird in dem Bildordner und die "HGray_transform_register_registered" Bild auf dem Fenster angezeigt gespeichert werden. Dieser Schritt wird mindestens 5 Minuten dauern.
   15. Schließen Sie alle Bilder auf dem Fenster.
2. Die Erzeugung des Referenzbild für Bildkombination.
   Hinweis: dieser Schritt wird, soll generaß eine registrierte horizontale Bild für die Kombination.
   1. Laden H und F-Bildstapeln unter Menü: Datei / Bild öffnen (A) von der Festplatte (oder Ctrl-f) /H.ids und F.ids; zwei Bilder werden auf dem Fenster angezeigt.
   2. Wählen Sie das H Bild (markieren) und gehen Sie zu Menü: Algorithmen / Transformation Tools / Transform; die "Transform / Bild neu berechnen" im Dialogfeld öffnet sich. Klicken Sie auf die "Resampling" Registerkarte und ändern Sie das Resampling von einer Größe von "H" auf "F." Als nächstes klicken Sie auf den "Transform" Tab und Last "GrayG_To_GrayG1.mtx" durch Auswahl von "Read-Matrix aus einer Datei." OK klicken; das H_transform Bild wird auf dem Fenster angezeigt. Schließen Sie das H Bild aber halten H_transform und F im Fenster.
   3. Wählen Sie den "H_transform" Bild (markieren) und gehen Sie zu Menü: Algorithmen / Transformation Tools / Transform; die "Transform / Bild neu berechnen" im Dialogfeld öffnet sich. Klicken Sie auf die "Resampling" Registerkarte und ändern Sie das Resampling von einer Größe von "H_transform" bis "F. & #34; Als nächstes klicken Sie auf den "Transform" Tab und Last "HGray_transform_To_FGray.mtx" durch Auswahl von "Read-Matrix aus einer Datei." OK klicken; die "H_transform_transform" Bild wird auf dem Fenster angezeigt. Schließen Sie das H_transform Bild; an diesem Punkt wird nur H_transform_transform und F auf dem Fenster belassen werden.
   4. Wählen Sie den "H_transform_transform" Bild (markieren) und gehen Sie zu Menü: Algorithmen / Transformation Tools / Transnichtlineare; die "Nonlinear B-Spline-Transformation" Dialogfeld erscheint. Als nächstes load "HGray_transform_register.nlt" und klicken Sie auf OK; die "H_transform_transform_registered" Bild wird auf dem Fenster angezeigt. Speichern Sie das Bild als ics-Datei. Schließen Sie alle Bilder auf dem Fenster.
3. Die Kombination von Bildstapeln
   HINWEIS: Dieser Schritt ist zwei Bildstapel in orthogonalen Richtungen erworben zu kombinieren (horizontal und frontal) in einen hochauflösenden Stack.
   1. Gehen Sie zum Menü: Plugins / Generic / Drosophila Retinal Registrationl; die "Drosophila Retinal Registrierung v2.9" Dialogfeld erscheint. Upload "H.ics" in Bild H "H_transform_transform_registered" von Schritt 3.2.4 in Bild H-registrierter, "F.ics" in Bild F "GrayG_To_GrayG1.mtx" von Schritt 3.1.7 in Transformation 1-Grün (optional ), "HGray_transform_To_FGray.mtx" von Schritt 3.1.12 in Transformation 2-Affine und "HGray_transform_register.nlt" von Schritt 3.1.14 in Transformation 3-Nonlinear (optional).
      1. Wählen Sie sqrt (Intensity-H x Intensity-F) und No rescale in "Rescale H F." Behalten Sie die Standardoptionen für die restlichen Parameter. OK klicken; Dieser Schritt dauert ca. 3 Minuten dauern.
         HINWEIS: Nach der Verarbeitung, 3 Sätze von Bildern generiert: combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids (die endgültige rekombiniert Bild), greenChannelsImage-Gxreg-Gy-Gcomp.IDS (grünen Kanal für H, F, und die endgültige rekombiniert Bild) und redChannelsImage- Rxreg-Ry-Rcomp.ids (roter Kanal foR H, F, und das endgültige Bild rekombiniert); alle Ausgabedateien werden auf 512 x 512 x 512 Größe verändert werden.
   2. Open "combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids" unter dem Bild Visualisierungssoftware. Speichern Sie die Bildstapel im ims Format und benennen Sie die Datei; diese rekombiniert Bilddatei wird für Neuriten Tracing und Anmeldung verwendet werden.

4. Neuriten Tracing und Referenzpunktbelegung

Hinweis: Dieser Schritt ist Neuriten (4.1) und zuweisen Referenzpunkte für die Registrierung (4.2) unter Verwendung der Bildvisualisierungssoftware zu verfolgen.

1. Tracing Neuriten
   1. Starten Sie die Bildvisualisierungssoftware. Öffnen Sie die rekombiniert Bilddatei. Zum Menü: Bearbeiten / Show Anzeige Einstellung und schalten Sie den Photorezeptorkanal (rot) ab.
   2. Visualisieren Sie das Bild in "Surpass" -Modus. Schalten Sie "Stereo" und verwenden Sie den "Quad Buffer" Modus von 3D-Bildern sichtbar zu machen, wenn der Computer equipped mit einem Stereobild-System.
   3. Zum Menü: Surpass / Filaments zu neuen Fäden hinzuzufügen. Klicken Sie auf die "automatische Erstellung überspringen, manuell bearbeiten" aus.
   4. Klicken Sie auf die "Draw" und wählen Sie "AutoDepth."
   5. Wählen Sie "Einstellungen" und klicken Sie auf "Linie" und Schlüssel in einer entsprechenden Pixelzahl zur besseren Visualisierung (4-Pixel-Linie wird in diesem Protokoll verwendet). Überprüfen Sie "Show Dendriten", "Anfangspunkt" und "Branching-Punkte". Stellen Sie "Render-Qualität" auf 100%.
   6. Wählen Sie die "Draw" Tab und starten Neuriten Tracing. Beginnen Sie mit dem Axon und dann an den Dendriten (2D) zu bewegen. Das Axon und Dendriten von transmedulla Neuronen sind leicht zu unterscheiden.
      HINWEIS: Ein Tm Neuron erweitert seine Axon vom Zellkörper und projiziert den ganzen Weg zu den höheren visuellen Verarbeitungszentrum, das Lobula. Das System wird den ersten langen Filament als ein Axon und die verbleibenden kurzen Fäden automatisch definierenDendriten. Halten Sie den Ausgangspunkt zu Beginn des Filaments (Axon) während der Verfolgung und stellen Sie sicher, dass die zurückverfolgt Neuriten verbunden sind. Untersuchen Sie die Verzweigungspunkte und den Anfangspunkt. Wenn die Dendriten nicht verbunden sind, wird ein neuer Anfang Punkt, an dem nicht verbundenen Faden definiert werden.
   7. Nach dem Aufspüren, um zurück zu gehen "Einstellungen" und deaktivieren Sie "Anfangspunkt" und "Branching Point," und zum Menü gehen: Surpass / Export ausgewählten Objekte ../. Speichern Sie den Faden als Erfinder-Datei (* .IV).
2. Zuordnen von Referenzpunkten
   1. Wählen Sie "Show Display Einstellung" und schalten Sie beide Abbildungskanäle. In diesem Beispiel Kanal 1 ist der Photorezeptor-Färbung und Kanal 2 ist der TM20 Neuron (GFP).
   2. Zum Menü: Surpass / Mess. Wählen Sie die Registerkarte "Bearbeiten" und aktivieren Sie "spezifischen Channel:" (Anwahl des Photorezeptor-Kanal [rot]).
   3. Bezugspunkte für die obere Schicht zuordnen. Zum Menü: / Surpass / Mess Points neue Messpunkte zu schaffen. Markieren Sie den Beginn der M1-Schicht als oberste Schicht. Die Reihenfolge der Punkte ist wie folgt: äquatorialen, anterior-äquatorialen, vordere, anterior-ventralen, ventralen, posterior-ventralen, posterior, posterior-äquatorialen und in der Mitte (Abbildung 3F); definieren den Mittelpunkt Photorezeptor als mit den meisten dendritischen Prozesse verbunden.
   4. Ordnen Sie die R8 und R7 Schichten , wie in Schritt 4.2.3 (Abbildung 3G). Drei einzelnen Messpunkte sollten in Schritten 4.2.3 und 4.2.4 erstellt werden.
   5. Exportieren der Koordinaten der Punkte für jede Schicht. Klicken Sie auf die Registerkarte "Statistik", wählen Sie "Detaillierte", "Spezifische Werte" und "Position"; und klicken Sie auf "Export Statistik Tab Anzeige zu Datei." Speichern unter "Comma Separated Values" (* .csv).
   6. Öffnen Sie die drei CSV-Dateien (aus den Schritten 4.2.3 - 4.2.4) und kombinieren Sie die Koordinaten der 27 Referenzpunkte in eine neue CSV-Datei durch Kopieren und Einfügen (the ist, um nach oben, R8 und R7). Sehen Sie sich die Materialien / Ausrüstung Tabelle und folgen Sie dem Format der Beispieldatei.

5. Starrkörper und TPS Nonlinear Registrierung

HINWEIS: Dieser Schritt ist es, die Neuriten-Spuren (in iv-Format) auf die Referenzspaltenanordnung zu registrieren und eine registrierte SWC-Datei mit dem MIPAV Programm zu generieren. Dieser Abschnitt erfordert die folgenden Dateien: das rekombiniert Bildstapel (.ids) aus Schritt 3.3, der Referenzpunkt-Datei (.csv) aus Schritt 4.2 und die Neuriten Spur Glühfaden-Datei (.IV) aus Schritt 4.1.

1. Gehen Sie zum Menü: Plugins / Generic / DrosophilaStandardColumnRegistration. Die "DrosophilaStandardColumnRegistration v6.6.1" Fenster erscheint.
2. Legen Sie die Bilddateien (.ids), die Referenzpunkte-Datei (.csv), und der Faden-Datei (.IV).
3. Wählen Sie 9 Punkte pro Schicht.
4. Wählen Sie die Position des abgebildeten Neuron (LV / RD oder RV / LD).
5. Wählen Sie "Rigid Registratiauf und TPS "und" Rigid Registration "auf nicht-lineare und Starrkörper Registrierung sind.
6. Check "SWC-Datei erstellen" die folgenden Ausgabedateien zu erzeugen: eine eingetragene Neuriten Trace-Datei in SWC-Format (siehe spezifische Materialien / Ausrüstung für die Definition), einer eingetragenen IV-Datei (.IV), koordiniert von der standardisierten Neuriten (.txt), transformierten Koordinaten (.txt), und das kombinierte Bild (.ids).
7. Ändern Sie den Namen der SWC-Datei. Tragen Sie die Abkürzung des Standortes an das Ende des Dateinamens (Schritt 1.7). Verwenden Sie zum Beispiel "Tm20_3_RV.swc" für TM20 Neuron # 3 an der ventralen Hälfte des rechten Medulla gelegen.

6. Standardisierung auf der rechten ventralen Konfiguration

HINWEIS: Dieser Schritt ist es, die Neuriten-Spuren (in SWC-Format) zur Standard-RV (rechte ventrale) Konfiguration mit dem benutzerdefinierten Skript zu konvertieren "RV_standardization.m." Hier wurde das Skript in der Matrix Labor Sprache geschrieben. Das"NeuronName _ _ Anzahl Konfiguration .swc" (zB Tm20_3_LV.swc): Namen der Eingangs SWC - Dateien in folgendem Format sein sollte.

1. Öffnen Sie die "RV_standardization.m" Skript.
2. Bearbeiten Sie die folgenden Parameter in der "Benutzereingabe" Abschnitt:
   1. Geben Sie die Namen der Neuronen ohne Nummerierung (zB Tm2, TM20, etc.) in "neuron_names."
      HINWEIS: Die Standardeinstellung in "file_end_in" ist "_ * SWC.", Die für Dateien mit Namen enthält, sieht ( "*" als Platzhalter für eine beliebige Anzahl von Zeichen entspricht) "_ * SWC.". Die Standardeinstellung von "swc_file_end_out" ist "_f.swc", die "_f" bis zum Ende des Dateinamens nach Standardisierung hinzufügen.
   2. Geben Sie das Verzeichnis, in dem die SWC-Dateien in "directory_in" sind. Geben Sie das Verzeichnis, in dem die standardisierten Dateien in "directory_swcout" gehen wird.
3. Führen Sie das Skript.
4. Optional: Verwenden Sie Vaa3D ¹⁴ die SWC - Dateien zu visualisieren und die Umwandlung zu validieren.

7. Berechnen Dendritische Branching und Abschluss- Frequenzen

HINWEIS: Dieser Schritt verwendet Starrkörper SWC-Dateien registriert, die Kaplan-Meier-Schätzer für die Wahrscheinlichkeit zu berechnen, die eine dendritische Segment eine vorgegebene Länge ohne Abschluss erreichen. Dieses Skript verwendet zwei Dendritic_Tree_Toolbox Funktionen: extractDendriticSegmentLengthDistribution und estimateDendriticSegmentLengthProbability.

1. Öffnen Sie die "Branch_term_P.m" Skript.
2. Bearbeiten Sie die folgenden Parameter in der "Benutzereingabe" Abschnitt:
   1. Geben Sie den Pfad zu den Starrkörper registriert SWC - Dateien in "pathToSWCFiles" (zB / Rigid_Registered_swc /). Geben Sie den Pfad, der die Grafikausgabe in halten wird "pathToOutput." Geben Sie den Namen der Neuronen oder neuronalen Typen in "neuron_names" (zB Tm2, Tm20, etc.).
3. Führen Sie das Skript; die Ausgänge sind die Kaplan-Meier-Schätzung Kurve für dendritischen Verzweigung und Terminierung.
   HINWEIS: Optional: Tragen Sie die Funktion schlüssigen Verfahren zum Extrahieren von der Kaplan-Meier die lokale Wahrscheinlichkeit Schätzern, dass die dendritischen Segment verzweigen oder beendet.

8. Plot die Verteilung der Schichtspezifische Kündigung des Dendritische Dorne

HINWEIS: In diesem Schritt zeichnet die Verteilung von dendritischen Klemmen in verschiedenen Schichten Medulla als Balkendiagramm. Dies kann zu einem Neuron angewendet werden, eine Gruppe von Neuronen oder Neuronengruppen. Das Skript verwendet die extractDistributionAlongAxis Funktion von Dendritic_Tree_Toolbox.

1. Öffnen Sie die "Layer_term.m" Skript.
2. Bearbeiten Sie die folgenden Parameter in der "Benutzereingabe" Abschnitt:
   1. Geben Sie das Verzeichnis , das nicht - lineare registriert SWC - Dateien in "pathToSWCFiles" (zB / enthält Non_linear_Registered_swc /). Geben Sie das Verzeichnis für die Grafikausgabe in "pathToOutput." Geben Sie den Namen der Neuronen oder neuronalen Typen in "neuron_names" (zB Tm2, TM20, etc.).
3. Führen Sie das Tutorial-Skript. Der Ausgang ist ein Histogramm des Anteils der Endknoten in spezifischen medulla Schichten.

9. Plot der Planar Projektionsrichtung von Dendriten

HINWEIS: Dieser Schritt zeichnet die planaren Projektionsrichtungen von Dendriten als Polarplot. Das Skript verwendet die extractAngularDistribution Funktion von Dendritic_Tree_Toolbox.

1. Öffnen Sie das Skript "Planar_proj.m."
2. Bearbeiten Sie die folgenden Parameter in der "Benutzereingabe" Abschnitt.
   1. Geben Sie das Verzeichnis, das die nicht - lineare registriert SWC - Dateien in "pathToSWCFiles" (zB / Non_linear_Registered_swc /) enthält. Geben Sie das Verzeichnis für die Grafikausgabe in "pathToOutput." Geben Sie den Namendie Neuronen oder neuronalen Typen in "neuron_names" (zB Tm2, TM20, etc.).
3. Führen Sie das Skript; der Ausgang ist ein Polarplot planaren Projektionsrichtungen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Unter Verwendung des Dual-View-Bildgebungsverfahren hier vorgestellten ein Gehirn fly dünn markiertem TM20 Neuronen enthält, wurde in zwei orthogonalen Richtungen abgebildet. Vor der Bildgebung wurde das Gehirn mit den entsprechenden primären und sekundären Antikörper zur Visualisierung von membran tethered GFP und Photorezeptor Axone gefärbt. Für die Bildgebung wurde das Gehirn zuerst in der horizontalen Ausrichtung montiert (2A, B). Ein GFP-markiertem TM20 Neuro...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Hier zeigen wir , wie man Bild und analysieren dendritischen Dorne von Drosophila Medulla Neuronen. Der erste Abschnitt, Dual-View-Bildgebung, beschreibt die Entfaltungs und Kombination von zwei Bildstapeln in einem hochauflösenden Bildstapel. Der zweite Abschnitt, Dendriten Verfolgung und Anmeldung, beschreibt die Verfolgung und Registrierung von Dendriten der Medulla Neuronen auf die Referenzspaltenanordnung. Der dritte Abschnitt, dendritische Analyse, beschreibt die Verwendung von benutzerdefinierten Skript...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging	version 16.05	for image deconvolution (https://svi.nl).  commercial software
MIPAV		version 7.3.0	for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/); freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophila RetinalRegistration.class			freeware
MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandard ColumnRegistration.class			freeware
Imaris	Bitplane		for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com); commercial software
Vaa3D			for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/); freeware
Matlab	Mathworks	R2014b	for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com); commercial software
Matlab toolbox: TREES1.14		v1.14	for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html); freeware
Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox		v1.0	For calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware
Name	Company	Catalog number	Comments
Sample files
SWC file definition			http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
The codes and sample files for image combination and registration			https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
Reference point example			https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate= 1471880596000&api=v2
Name	Company	Catalog number	Comments
Computer system
MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later			3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal)
Optional: Quadro4000  (or above) graphic card	Nvidia		for stereographic visualization of dendrites.
Optional: NVIDIA 3D vision2	Nvidia		http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2			http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
Name	Company	Catalog number	Comments
Reagents for imaging
24B10 antibody	The Developmental Studies Hybridoma Bank	24B10
GFP Tag Antibody	Thermofisher Scientific	G10362
Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488	Thermofisher Scientific	A11034
Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568	Thermofisher Scientific	A21124
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000
Mounting Clay	Fisher	S04179
70% glycerol in 1x PBS
Cover glasses, high performance, D = 0.17 mm	Zeiss	474030-9000-000