Beurteilung der neuronalen Lebensfähigkeit unter Verwendung von Fluorescein-Diacetat-Propidium-Iodid-Doppelfärbung in Cerebellar-Granulat-Neuron-Kultur

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die genaue Messung der neuronalen Lebensfähigkeit mit Fluorescein-Diacetat (FDA) und Propidium-Iodid (PI) Doppelfärbung in kultivierten Zerebellar-Granulat-Neuronen, einer primären neuronalen Kultur, die als in vitro- Modell in der Neurowissenschaften und der Neuropharmakologieforschung verwendet wird.

Zusammenfassung

Primärkultivierte Cerebelläre Granulatneuronen (CGNs) wurden weithin als In-vitro- Modell in der Neurowissenschaften und der Neuropharmakologieforschung verwendet. Allerdings könnte die Koexistenz von Gliazellen und Neuronen in der CGN-Kultur zu Vorspannungen bei der genauen Beurteilung der neuronalen Lebensfähigkeit führen. Fluorescein-Diacetat (FDA) und Propidium-Iodid (PI) -Phasenfärbung wurde verwendet, um die Zelllebensfähigkeit durch gleichzeitiges Auswerten der lebensfähigen und toten Zellen zu messen. Wir verwendeten FDA-PI-Doppelfärbung, um die Empfindlichkeiten der kolorimetrischen Assays zu verbessern und die neuronale Lebensfähigkeit in CGNs zu bewerten. Darüber hinaus haben wir blau fluoreszierende DNA-Flecken ( zB Hoechst) hinzugefügt, um die Genauigkeit zu verbessern. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Genauigkeit der Bewertung der neuronalen Lebensfähigkeit durch die Verwendung dieser Methoden in CGN Kultur zu verbessern. Mit diesem Protokoll kann die Anzahl der Gliazellen durch die Fluoreszenzmikroskopie ausgeschlossen werden. Eine ähnliche Strategie kann angewendet werden, um das unerwünschte Gli zu unterscheidenAl-Zellen aus Neuronen in verschiedenen gemischten Zellkulturen, wie primäre kortikale Kultur und Hippocampalkultur.

Einleitung

Farbmetrische zytotoxische Assays, wie der 3- (4, 5-Dimethyl-2-thiazolyl) -2, 5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromid (MTT) -Assay, werden üblicherweise zur Messung der Zelllebensfähigkeit in vitro verwendet. Primäre kultivierte Cerebelläre Granulatneuronen (CGNs) von Ratten sind empfindlich gegenüber verschiedenen Neurotoxinen, einschließlich 1-Methyl-4-phenylpyridiniumionen, Wasserstoffperoxid und Glutamat ^{1 , 2} . Daher können CGN-Kulturen als In-vitro- Modell im Bereich der Neurowissenschaften eingesetzt werden. CGN-Kulturen können eine Vielzahl von Zellen enthalten, einschließlich Neuronen und Gliazellen, die etwa 1% der gesamten Zellen in der CGN-Kultur ausmachen können. Allerdings reagieren Gliazellen anders als Neurotoxine im Vergleich zu Neuronen, was zu einer Vorspannung in der neuronalen Lebensfähigkeit führt, gemessen durch kolorimetrische Assays ³ .

In lebensfähigen Zellen kann Fluorescein-Diacetat (FDA) durch Esterase in Fluorescein umgewandelt werden.Propidium-Iodid (PI) kann mit der DNA nach dem Durchdringen von toten Zellen interagieren und kann verwendet werden, um Apoptose innerhalb der Kultur anzuzeigen. Daher kann die FDA-PI-Doppelfärbung gleichzeitig lebensfähige Zellen und tote Zellen auswerten, was darauf hindeutet, dass die Zelllebensfähigkeit durch Kombination von kolorimetrischen Methoden genauer gemessen werden kann. Darüber hinaus könnte durch die Zugabe von Hoechst, einem blauen Fluoreszenzfleck für Kerne, die Genauigkeit der Lebensfähigkeit der Zellen weiter verbessert werden. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die FDA-PI-Doppelfärbung und die FDA-PI-Hoechst-Dreifachfärbung, mit der die neuronale Lebensfähigkeit in primär kultivierten CGNs genau analysiert werden kann.

Dieses Protokoll nutzt die Visualisierung und Unterscheidung von CGNs und Gliazellen durch ihre unterschiedlichen Größen und Formen. Nach der Färbung werden die Anzahl der lebensfähigen Neuronen und toten Neuronen aus repräsentativen Bildern der Fluoreszenzmikroskopie gezählt. Die großformatigen Gliazellen werden durch den Vergleich typischer CGNs t ausgeschlossenUnter dem Fluoreszenzmodus mit denen, die unter Phasenkontrastmodus aufgenommen wurden. Eine ähnliche Strategie kann durchgeführt werden, um die neuronale Lebensfähigkeit in gemischten Zellkulturen zu messen, die Neuronen und Gliazellen enthalten, wie primäre kortikale Kulturen und Hippocampalkulturen.

Protokoll

Alle Verfahren folgten dem National Institutes of Health (NIH) Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH Publikationen Nr. 80-23, überarbeitet 1996) und wurden von der Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Ningbo University ( SYXK-2008-0110).

1. Vorbereitung von Lösungen und Kulturmedien

Hinweis: Reagenzien und Bestände müssen unter sterilen Bedingungen vorbereitet werden. Sterilisieren durch Filtrieren unter Verwendung eines Filters mit einer Porengröße von 0,22 μm.

1. Vorbereitung der Poly-L-Lysin (PLL) Stammlösung durch Zugabe von 5 mg PLL zu 10 ml doppelt destilliertem Wasser (ddH ₂ O). Sterilisieren durch Filtern. Aliquot und lagert die PLL-Stammlösung bei -20 ° C für mehrere Monate.
2. Man erhält Krebs-Puffer durch Zugabe von 7,25 g NaCl, 0,4 g KCl, 0,14 g NaH ₂ PO ₄ , 2,6 g D-Glucose und 5,94 g 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazin-methansulfonsäure zu 100 mL DdH _{2 <}/ Sub> O Sterilisieren durch Filtern. Lagern Sie die Krebs-Pufferlösung bei 4 ° C für bis zu einem Monat.
3. 3,82% Mg ₂ SO ₄ -Lösung durch Zugabe von 3,82 g Mg ₂ SO ₄ zu 100 ml ddH ₂ O zubereiten. Sterilisieren durch Filtrieren. Die Mg ₂ SO ₄ -Lösung bei 4 ° C für mehrere Monate aufbewahren.
4. Die 1,2% ige CaCl & sub2 _; -Lösung wird durch Zugabe von 1,2 g CaCl & sub2 _; auf 100 ml ddH _& sub2 _; O hergestellt. Sterilisieren durch Filtrieren. Die CaCl ₂ -Lösung bei 4 ° C für mehrere Monate aufbewahren.
5. 2M KCl-Lösung durch Zugabe von 15 g KCl zu 100 ml ddH ₂ O zubereiten. Sterilisieren durch Filtrieren. Die KCl-Lösung bei 4 ° C für mehrere Monate aufbewahren.
6. Die D-Glucose-Stammlösung wird durch Zugabe von 1,8 g D-Glucose zu 100 ml ddH ₂ O hergestellt. Sterilisieren durch Filtrieren. Aliquot und lagert die D-Glucose-Lösung bei 4 ° C für bis zu einem Monat.
7. Bereiten Sie Cytosin-β-D-Arabinofuranosid (Ara-C) Stammlöser vorIonen durch Zugabe von 0,24 g Ara-C zu 10 ml ddH ₂ O. Sterilisieren durch Filtrieren. Aliquot und lagern die Ara-C-Stammlösung bei 4 ° C für mehrere Monate.
8. Bereiten Sie 250 ml Kulturmedium (für 25-30 Welpen) mit 25 ml Fetal-Rinder-Serum (FBS), 2,5 ml 100x Glutamin, 2,78 ml 2M KCl-Lösung und 2,5 ml 100x Antibiotika in Basal Medium Eagle (BME) . Stellen Sie die Lautstärke auf 250 ml ein und sterilisieren Sie sie durch Filtern.
9. Vorbereiten des 25K-Mediums unter Verwendung von 2,5 ml 100x Glutamin, 2,78 ml 2M KCl-Lösung und 2,5 ml 100x Antibiotika in BME. Stellen Sie die Lautstärke auf 250 mL ein und sterilisieren Sie sie durch Filtern.
10. Bereiten Sie 5K Medium mit 2,5 ml 100x Glutamin und 2,5 ml 100X Antibiotika in BME vor. Stellen Sie die Lautstärke auf 250 ml ein und sterilisieren Sie sie durch Filtern.
    HINWEIS: Das Kulturmedium, 25K Medium und 5K Medium müssen frisch zubereitet werden
11. Vorbereitung der FDA-Stammlösung durch Zugabe von 5 mg FDA zu 1 ml Aceton. Lagern Sie die FDA-Stammlösung bei 4 ° C für die Langzeitlagerung.
12. Vorbereitung der PI-Stammlösung durch Zugabe von 1 mg PI zu 1 ml ddH ₂ O. Lagern Sie die PI-Stammlösung bei 4 ° C für mehrere Monate.
13. Vorbereitung der Hoechst-Stammlösung durch Zugabe von 5 mg Hoechst 33342 zu 1 ml ddH ₂ O. Lagern Sie die Hoechst-Stammlösung bei 4 ° C für mehrere Monate.

2. Vorbereitung von Dissektionslösungen

HINWEIS: Mache das 1 d vor der Sektion.

1. Bereiten Sie die Dissektionslösung vor, indem Sie 15 ml Krebs-Puffer, 1,2 ml 3,82% Mg ₂ SO ₄ -Lösung und 0,45 g Rinderserumalbumin (BSA) auf 150 ml ddH ₂ O zugeben. Den pH-Wert mit NaOH auf 7,4 einstellen.
2. Etikett 5 x 50 ml Röhrchen wie folgt: 1, 2, 3, 4 und 5.
3. Legen Sie 40 ml Dissektionslösung in eine 50 ml Spritze mit einem Filter. Filtern Sie 30 ml Dissektionslösung in Röhrchen 1 und 2 ml jeweils auf mehrere 35 mm Zellkulturschalen, die zur Verarbeitung von Geweben verwendet werden.
4. Zu tUbe 2, füge 12,5 mg Trypsin in 50 ml Dissektionslösung hinzu. Mischen Sie vollständig durch Vortexen. Sterilisieren durch Filtern.
5. Zu Röhrchen 3 fügen Sie 1,2 mg DNAse I, 7,8 mg Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor und 150 μl 3,82% Mg ₂ SO ₄ -Lösung in 15 ml Dissektionslösung hinzu. Mischen Sie vollständig durch Vortexen. Sterilisieren durch Filtern.
6. Zu Röhrchen 4 fügen Sie 5 ml der Lösung aus dem Rohr 3 hinzu. Fügen Sie 10,5 ml Dissektionslösung hinzu. Sterilisieren durch Filtern.
7. Zu Röhrchen 5 werden 100 μl 3,82% Mg ₂ SO ₄ -Lösung und 15 μl 1,2% CaCl ₂ -Lösung in 12,5 ml Dissektionslösung gegeben. Mischen Sie vollständig durch Vortexen. Sterilisieren durch Filtern.
8. Alle Röhrchen vor Gebrauch bei 4 ° C aufbewahren.

3. Beschichtung der Zellkulturplatten

HINWEIS: Mache das 1 d vor der Sektion.

1. Füge 1 ml PLL-Stammlösung zu 100 ml ddH ₂ O hinzu (Endkonzentration: 5 μg / ml). Mantel aus Kunststoff6-Well- oder 12-Well-Zellkulturplatten (2 ml pro Well für 6-Well-Zellkulturplatten oder 1 ml pro Well für 12-Well-Zellkulturplatten) durch Zugabe von 5 & mgr; g / ml Poly-L-Lysinlösung.
2. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Tag (oder bei 37 ° C für 2 h). 1-2 h vor der zerlegung, entfernen sie die lösung mit einer pipette. Einmal mit ddH ₂ O waschen und in der Zellkulturhaube trocknen.

4. Verarbeitung von Geweben für 8 Tage alte Sprague-Dawley-Ratten.

1. Setzen Sie eine 100 mm Schale auf Eis. Entkuppeln Sie die Rattenwelpen in die Schale mit einem Paar sterilisierter Schere.
2. Setzen Sie die Schere in das Foramen magnum und schneiden Sie die beiden Seiten des Schädels, von den Ohren zu den Augen. Heben Sie den Schädel mit einer Pinzette an. Stellen Sie sicher, dass das ganze Gehirn im Schädel ist. Das Zerebellum isolieren und in die oben genannte 35 mm Schale mit einer Pinzette geben.
3. Arbeiten unter einem Sektionsmikroskop. Entfernen Sie die Hirnhäute und Blutgefäße mit zwei Pinzettenpaaren.
4. Hacken Sie die Gewebe mit einer Klinge. Das Gewebe in Röhrchen 1 geben. 5 min bei RT und 1500 x g zentrifugieren.
5. Sauge den Überstand. Sparen Sie das Pellet.
6. Die Lösung in das Rohr 2 zum Pellet geben. Resuspend durch Schütteln sanft.
7. Legen Sie den Schlauch in ein 37 ° C Wasserbad für 15 min. Schütteln Sie alle 3 Minuten vorsichtig.
8. Füge die Lösung in Rohr 4 zu dieser Lösung hinzu. Schütteln und zentrifugieren für 5 min bei RT und 1.500 x g.
9. Sauge den Überstand. Sparen Sie das Pellet.
10. Füge die Lösung in Röhrchen 3 hinzu, um das Pellet zu resuspendieren.
11. Zwei 15-ml-Röhrchen vorbereiten. Lege die Hälfte der Zellen in jedes Röhrchen. Pipettieren Sie nach unten und unten 60-70x mit einer Wattestäbchen Pasteurpipette, um die Zellen zu homogenisieren.
12. Füge 3 ml der Lösung in Röhrchen 5 zu jedem 15-ml-Röhrchen hinzu. Lassen Sie sie für 10 Minuten bei RT sitzen und dann den Überstand vorsichtig mit einer Pasteurpipette aus Baumwolle abziehen. Den Überstand in neue 15 ml Röhrchen geben und 5 min bei RT und 1500 x g zentrifugieren.
13. EINSpirate den Überstand. Sparen Sie das Pellet.
14. Fügen Sie Kulturmedium in das Pellet hinzu, um eine Zelldichte von etwa 1,5 x 10 & ^sup6; Zellen / ml (etwa 100 ml für 10 Welpen) zu erhalten.
15. Die Zellen in Kulturplatten geben und im Inkubator bei 37 ° C und 5% CO ₂ kultivieren.

5. Zugabe von Ara-C und D-Glukose während der Kultivierung

1. Nach 24 h wird die Ara-C-Stammlösung (10 & mgr; l / Vertiefung für 12-Well-Zellkulturplatten oder 20 & mgr; l / Vertiefung für 6-Well-Zellkulturplatten, Endkonzentration: 1 mM) zugegeben, um das Wachstum der Gliazellen zu hemmen.
2. Am Tag 7 werden 50 & mgr; l D-Glucose-Stammlösung pro Vertiefung für 12-Well-Zellkulturplatten oder 100 & mgr; l pro Vertiefung für 6-Well-Zellkulturplatten zugegeben, so dass die Endkonzentration 1 mM beträgt.

6. FDA-PI Doppel-Färbung und FDA-PI-Hoechst Triple Färbung in CGN Kultur

1. FDA-PI-Arbeitslösung durch Zugabe von 20 μl FDA-Stammlösung (Endkonzentration: 10 & mgr; g / ml) und 50 & mgr; l PI-Stammlösung (Endkonzentration: 50 & mgr; g / ml) in 10 ml PBS. Mischen durch Vortexen und legen Sie diese auf Eis.
   1. Für die FDA-PI-Hoechst-Arbeitslösung werden 20 μl FDA-Stammlösung (Endkonzentration: 10 μg / mL), 50 μl PI-Stammlösung (Endkonzentration: 50 μg / mL) und 10 μl Hoechst-Stammlösung zugegeben (Endkonzentration: 5 & mgr; g / ml) in 10 ml PBS. Mischen durch Vortexen und legen Sie diese auf Eis.
      HINWEIS: FDA-PI-Arbeitslösung und FDA-PI-Hoechst-Arbeitslösung vor der Anwendung frisch vorbereiten.
2. Nimm die Zellkulturplatte aus dem Inkubator. Setzen Sie es auf Eis.
3. Aspirieren Sie das Kulturmedium und ersetzen Sie es mit kaltem PBS.
   HINWEIS: Der Lösungswechsel muss langsam und sorgfältig durchgeführt werden. Vermeiden Sie es, die Zellen mit Pipettenspitzen zu berühren.
4. Aspirieren Sie die kalte PBS und ersetzen Sie sie mit kalter FDA-PI oder FDA-PI-Hoechst Arbeitslösung (500 μl / weLl für 12-Well-Zellkulturplatten oder 1 ml / Vertiefung für 6-Well-Zellkulturplatten). 5 Minuten auf Eis gehen lassen.
5. Ansaugen der FDA-PI- oder FDA-PI-Hoechst-Arbeitslösung und Zugabe von kaltem PBS (100 & mgr; l / Vertiefung für 12-Well-Zellkulturplatten oder 50 & mgr; l / Vertiefung für 6-Well-Zellkulturplatten).
   HINWEIS: Die Zellen dürfen beim Fotografieren nicht trocknen.
6. Nehmen Sie Bilder mit Fluoreszenz-Mikroskopie. Verwenden Sie einen Anregungsfilter mit einem Durchlassband von 450 - 490 nm. Erfassen Sie die Fluoreszenzemissionen für FDA, PI und Hoechst bei 520, 620 bzw. 460 nm. Unter den gleichen Bedingungen, nehmen Sie ein Bild unter normalem Licht mit dem Phasenkontrast Modus der Fluoreszenz-Mikroskopie.
   HINWEIS: Nehmen Sie Bilder innerhalb von 15 Minuten nach FDA-PI oder FDA-PI-Hoechst Färbung. Die Belichtungszeit beträgt 100-300 ms und die analoge Verstärkung beträgt 2,8x.

7. Bewertung der neuronalen Lebensfähigkeit

1. Für FDA-PI Doppel-Färbung, überlagern die Bilder der Zellen nach dem Filtern erkanntDurch unterschiedliche Fluoreszenzfilter durch Ziehen der FDA-positiven Schicht auf der PI-positiven Schicht in einer Grafik-Editor-Software.
   1. Passen Sie die Deckkraft der FDA-positiven Ebene an, indem Sie im Feld "Deckkraft" im Feld "Ebenen" "50%" eingeben. Füge zwei Ebenen zusammen, indem du im Menü "Layer" auf die Schaltfläche "Merge Visible" klickst. Setzen Sie den Kontrast der Overlay-Bilder durch Eingabe von "50" im Feld "Kontrast" unter "Bild" "Anpassungen" | "Helligkeit Kontrast." Stellen Sie sicher, dass es keine FDA- und PI-Doppel-Positiv-Zelle in den Overlay-Bildern gibt.
2. Für die FDA-PI-Hoechst-Dreifachfärbung überlagern die Bilder der Zellen nach dem Filtern verschiedener Fluoreszenzfilter, indem sie die FDA-positive Schicht auf der PI-positiven Schicht in einer Grafik-Editor-Software ziehen. Passen Sie die Deckkraft der FDA-positiven Ebene an, indem Sie "50%" im Feld "Deckkraft" der "Ebenen & #34; Tafel
   1. Füge zwei Ebenen zusammen, indem du im Menü "Layer" auf die Schaltfläche "Merge Visible" klickst. Ziehe die Hoechst-positive Schicht auf die verschmolzene Schicht. Passen Sie die Deckkraft der Hoechst-positiven Schicht an, indem Sie im Feld "Deckkraft" im Feld "Ebenen" "50%" eingeben. Fügen Sie die beiden Ebenen zusammen, indem Sie im Menü "Layer" auf die Schaltfläche "Merge Visible" klicken.
3. Visuelle Unterscheidung von großen, unregelmäßigen Gliazellen aus CGNs durch Vergleich der im Fluoreszenzmodus aufgenommenen Bilder mit denen, die unter Phasenkontrastmodus aufgenommen wurden - Zellen mit dreifach größeren Durchmessern als CGNs gelten als Gliazellen und sollten ausgeschlossen werden.
4. Zähle die Anzahl der lebensfähigen Neuronen bzw. toten Neuronen unter Verwendung eines Zellenzähler-Plugins in einem Bildverarbeitungsprogramm ( zB ImageJ) ⁴ .
   1. Für FDA-PI Doppel-Färbung, manuell markieren kleine FDA-positiven Zellen alsLebensfähige neuronen Manuell markieren PI-positive Zellen als tote Neuronen. Für FDA-PI-Hoechst Triple Färbung, manuell markieren kleine FDA- und Hoechst-Doppel-positive Zellen als lebensfähige Neuronen. Manuell markieren PI- und Hoechst-Doppel-positive Zellen als tote Neuronen.
5. Berechnen Sie den Prozentsatz der neuronalen Lebensfähigkeit unter Verwendung der folgenden Gleichung:% der neuronalen Lebensfähigkeit = [Anzahl der lebensfähigen Neuronen / (Anzahl der toten Neuronen + Anzahl der lebensfähigen Neuronen)] x 100%. Für jeden Brunnen, wählen Sie fünf zufällige Felder und durchschnittlich den Prozentsatz der neuronalen Lebensfähigkeit.

Ergebnisse

Die doppelte Immunfärbung von GAP43 (rot) und GFAP (grün) wurde verwendet, um die Form von Neuronen und Gliazellen bzw. ^{2 , 5 zu} analysieren. Sowohl Neuronen als auch Gliazellen sind in der CGN-Kultur vorhanden. Die GFAP-positiven Gliazellen sind groß und unregelmäßig in der Form, wie durch die Pfeile in den Bildern angedeutet (Abbildung 1 ). Traditionelle Assays für Zellvitalität können keine Gliazellen ...

Diskussion

Dieses Protokoll wurde von Prozeduren modifiziert, die zuvor beschrieben wurden ^{6 , 7} . Forscher haben Zeit damit verbracht, das nicht-neuronale Zellwachstum zu reduzieren, indem sie die Bedingungen bei der Kultivierung primärer Neuronen in vitro verbessern. Doch auch bei verbesserten Kulturbedingungen bleiben einige Gliazellen erhalten. Darüber hinaus sind nicht-neuronale Zellen in primären neuronalen Kulturen notwendig, weil sie mit neuronalem Wach...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine (PLL)	Sigma	P2636
D-glucose	Sigma	G8270
Cytosine β-D-Arabinofuranoside	Sigma	C1768
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099141	high quality FBS is essential for culture
100x glutamine	Gibco	25030081
100x antibiotics	Gibco	15240062
Basal Medium Eagle (BME)	Gibco	21010046
Fluorescein diacetate (FDA)	Sigma	F7378
Propidium Iodide (PI)	Sigma	P4170
Hoechst 33342	Yesen	40731ES10
rabbit Anti-GAP43 antibody	Abcam	ab75810
mouse Anti-GFAP antibody	Cellsignaling	3670
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sangon Biotech	A602440
Trypsin	Sigma	T4665
DNAse	Sigma	D5025
Soybean trypsin inhibitor	Sigma	T9003
Pasteur pipette	Volac	Z310727	burn the tip round before use
12-well cell culture plates	TPP	Z707783
6-well cell culture plates	TPP	Z707759	high quality cell culture plate is essential for culture
Filter	Millipore	SLGP033RB
Pipet 5 mL	Excell Bio	CS017-0003
Pipet 10 mL	Excell Bio	CS017-0004
Dissect microscope	Shanghai Caikang	XTL2400
CO2 Incubator	Thermo Scientific	311
Fluorescence microscope	Nikon	TI-S
Fluorescence filter and emmision cubes	Nikon	B-2A, G-2A, UV-2A
Photo software	Nikon	NIS-Elements
Graphics editor softeware	Adobe	Photoshop CS
Image processing software	NIH	ImageJ