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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Papier präsentiert einen hochauflösenden Mikroskopie-Workflow zur gleichzeitigen Quantifizierung von intrazellulären ROS-Niveaus sowie mitochondrialem Membranpotential und Morphologie - gemeinsam als mitochondriale Morphofunktion bezeichnet - in lebenden adhärenten Zellen unter Verwendung der zellpermeablen fluoreszierenden Reportermoleküle 5- (und- 6) -chlormethyl-2 ', 7'-dichlordihydrofluoresceindiacetat, Acetylester (CM-H 2 DCFDA) und Tetramethylrhodaminmethylester (TMRM).

Zusammenfassung

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) regulieren essentielle zelluläre Prozesse einschließlich Genexpression, Migration, Differenzierung und Proliferation. Allerdings induzieren übermäßige ROS-Spiegel einen Zustand von oxidativem Stress, der von irreversiblen oxidativen Schäden an DNA, Lipiden und Proteinen begleitet wird. Somit liefert die Quantifizierung von ROS einen direkten Proxy für den zellulären Gesundheitszustand. Da Mitochondrien zu den wichtigsten zellulären Quellen und Zielen von ROS gehören, ist die gemeinsame Analyse der mitochondrialen Funktion und der ROS-Produktion in denselben Zellen entscheidend für ein besseres Verständnis der Zusammenschaltung in pathophysiologischen Bedingungen. Daher wurde für die gleichzeitige Quantifizierung von intrazellulären ROS-Niveaus, mitochondrialem Membranpotential (ΔΨ m ) und mitochondrialer Morphologie eine hochgradige mikroskopiebasierte Strategie entwickelt. Es basiert auf automatisierte Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie und Bildanalyse von lebenden adhärenten Zellen, die in Multi-Well-Platten gewachsen sind, und staineD mit den zellpermeablen fluoreszierenden Reportermolekülen CM-H 2 DCFDA (ROS) und TMRM (ΔΨ m und mitochondrialer Morphologie). Im Gegensatz zur Fluorimetrie oder Durchflusszytometrie erlaubt diese Strategie die Quantifizierung von subzellulären Parametern auf der Ebene der einzelnen Zelle mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung, sowohl vor als auch nach der experimentellen Stimulation. Wichtig ist, dass die bildbasierte Natur des Verfahrens die Extraktion von morphologischen Parametern zusätzlich zu den Signalintensitäten ermöglicht. Der kombinierte Feature-Set wird für die explorative und statistische multivariate Datenanalyse verwendet, um Unterschiede zwischen Subpopulationen, Zelltypen und / oder Behandlungen zu erkennen. Hier wird eine detaillierte Beschreibung des Assays gegeben, zusammen mit einem Beispielversuch, das sein Potenzial für eine eindeutige Diskriminierung zwischen zellulären Zuständen nach chemischer Störung beweist.

Einleitung

Die Konzentration des intrazellulären ROS wird durch ein dynamisches Zusammenspiel zwischen ROS-produzierenden und ROS-Entschärfungssystemen akribisch reguliert. Ungleichgewicht zwischen den beiden provoziert einen Zustand des oxidativen Stresses. Unter den Hauptquellen der ROS sind Mitochondrien 1 . Angesichts ihrer Rolle bei der Zellatmung sind sie verantwortlich für den Großteil der intrazellulären Superoxid (O 2 • - ) - Moleküle 2 . Dies ergibt sich meist aus Elektronenleckage zu O 2 am Komplex 1 der Elektronentransportkette unter Bedingungen eines starken negativen inneren mitochondrialen Membranpotentials (Δψ m ), dh mitochondrialer Hyperpolarisation. Auf der anderen Seite wurde auch die mitochondriale Depolarisation mit einer erhöhten ROS-Produktion korreliert, die auf mehrere Wirkmechanismen 3 , 4 , 5 ,> 6 , 7 , 8 Darüber hinaus wird durch Redox-Modifikationen in Proteinen der Spalt-Fusions-Maschinerie ROS die mitochondriale Morphologie 9 regulieren. Beispielsweise ist die Fragmentierung mit einer erhöhten ROS-Produktion und Apoptose 10 , 11 korreliert, während filamentöse Mitochondrien mit Nährstoffverhungern und Schutz verbunden sind Mitophagie 12 Angesichts der komplizierten Beziehung zwischen zellulärem ROS und mitochondrialer Morphofunktion sollten beide idealerweise gleichzeitig in lebenden Zellen quantifiziert werden. Um dies genau zu tun, wurde ein hochauflösender Bildgebungsassay auf der Grundlage einer automatisierten Breitfeldmikroskopie und einer Bildanalyse von adhärenten Zellkulturen entwickelt, die mit den Fluoreszenzsonden CM-H 2 DCFDA (ROS) und TMRM (mitochondrialem Δψ m und Morphologie) gefärbt wurden. High-Content-Imaging bezieht sich auf die Extraktion von spAtiotemporell reiche ( dh große Anzahl von beschreibenden Merkmalen) Informationen über zelluläre Phänotypen mit mehreren komplementären Markern und automatisierten Bildanalysen. In Kombination mit automatisierter Mikroskopie können viele Proben parallel ( dh Hochdurchsatz) abgeschirmt werden, wodurch die statistische Kraft des Assays erhöht wird. In der Tat ist ein Hauptbestandteil des Protokolls, dass es die gleichzeitige Quantifizierung von mehreren Parametern in der gleichen Zelle ermöglicht, und dies für eine große Anzahl von Zellen und Bedingungen.

Das Protokoll wird in 8 Teile aufgeteilt (im Detail beschrieben im Protokoll): 1) Seeding-Zellen in einer 96-Well-Platte; 2) Vorbereitung von Stammlösungen, Arbeitslösungen und Bildgebungspuffer; 3) Aufstellung des Mikroskops; 4) Beladen der Zellen mit CM-H 2 DCFDA und TMRM; 5) Erste Live-Imaging-Runde zur Messung der basalen ROS-Werte und der mitochondrialen Morphofunktion; 6) Zweite Live-Bildgebung nach Zugabe von tert. -ButylPeroxid (TBHP) zur Messung induzierter ROS-Werte; 7) Automatisierte Bildanalyse; 8) Datenanalyse, Qualitätskontrolle und Visualisierung.

Der Assay wurde ursprünglich für normale menschliche dermale Fibroblasten (NHDF) entwickelt. Da diese Zellen groß und flach sind, eignen sie sich gut zur Beurteilung der mitochondrialen Morphologie in 2D-Weitfeldbildern 13 , 14 . Bei kleineren Modifikationen ist diese Methode jedoch auf andere adhärente Zelltypen anwendbar. Darüber hinaus entspricht neben der Kombination von CM-H 2 DCFDA und TMRM der Workflow einer Vielzahl von fluoreszierenden Farbstoffpaaren mit unterschiedlichen molekularen Spezifitäten 1 , 15 .

Protokoll

Das nachstehende Protokoll wird für NHDF-Zellen und unter Verwendung der in der Materialdatei angegebenen Multiwell-Platten beschrieben. Siehe Abbildung 1 für einen allgemeinen Überblick über den Workflow.

1. Vorbereitung der Reagenzien

  1. Bereiten Sie das vollständige Medium vor, indem Sie Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% v / v Fetal Bovine Serum (FBS) und 100 IE / ml Penicillin und 100 IE / ml Streptomycin (PS) ergänzen. Für 500 ml vollständiges Medium werden 50 ml FBS und 5 ml PS auf 445 ml DMEM gegeben.
  2. Bereiten Sie HBSS-HEPES (HH) Imaging-Puffer vor, indem Sie Hank's Balanced Salt Solution (mit Magnesium und Calcium, aber ohne Phenolrot) mit 20 mM HEPES ergänzen. Für 500 ml HH werden 10 ml 1M HEPES-Stammlösung auf 490 ml HBSS gegeben. Den pH-Wert überprüfen und ggf. auf pH 7.2 einstellen.
  3. 1 mM CM-H 2 DCFDA-Stammlösung durch Auflösen von 50 μg CM-H 2 DCFDA lyophilisiertem Pulver in 86,5 &# 181; L wasserfreies DMSO. Mischen durch Vortexen oder Pipettieren auf und ab und machen 20 μl Aliquote in braunen Mikrozentrifugenröhrchen. Im Dunkeln bei -20 ° C aufbewahren und innerhalb von 1 Woche verwenden. Bei Lagerung unter N 2 -Status-Haltbarkeit kann bis zu mindestens 1 Monat erhöht werden.
    1. 1 mM TMRM-Stammlösung durch Auflösen von 25 mg TMRM-Pulver in 50 ml wasserfreiem DMSO vorbereiten. Mischen durch Vortexen oder Pipettieren auf und ab und machen 10 μl Aliquote in braunen Mikrozentrifugenröhrchen. Im Dunkeln bei -20 ° C aufbewahren. Diese Lösung ist für mindestens ein Jahr stabil.
  4. Bereiten Sie für jedes Experiment ein frisches Aliquot von Tert -Butylperoxid (TBHP) -Stand (~ 7 M) vor, indem Sie direkt ein Volumen aus der 70% igen Stammlösung (10 μl / 96-Well-Platte) pipettieren. Halten Sie dieses Aliquot bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung.
  5. Vorbereiten der Antikörper-Arbeitslösung (AB) durch Verdünnen von zwei sekundären Antikörpern (Alexa Fluor 488 Esel-Anti-Kaninchen und CY3-Esel-Anti-Kaninchen) 1.000 Mal in 1x HH-buFfer.

2. Einrichten des Mikroskops und des Erfassungsprotokolls (± 15 min)

HINWEIS: Die Bildaufnahme erfolgt mit einem Weitfeldmikroskop, das mit einer automatisierten Bühne und Rollläden ausgestattet ist, und ein hardwarebasiertes Autofokus-System mit einem 20fachen Flugplan-korrigierten Objektiv (NA = 0,75) und einer EM-CCD-Kamera. Bei der erstmaligen Einrichtung des Assays wird eine Testplatte mit Kontrollzellen, die gemäß den Anweisungen des Protokolls gefärbt ist, zur Kalibrierung der XY-Stufe und zur Optimierung der Erfassungseinstellungen verwendet. Wenn die Erfassungseinstellungen bereits festgestellt wurden, kann die Kalibrierung mit einer leeren Platte erfolgen.

  1. Senken Sie das Ziel auf die absolute Basisebene und kalibrieren Sie die XY-Bühne nach Software-Anweisungen.
  2. Stellen Sie sicher, dass die richtigen Filterwürfel installiert sind. Zur Visualisierung von CM-H 2 DCFDA verwenden Sie einen Standard-GFP-Filterwürfel mit einem 472/30 nm Anregungsbandpassfilter, einem 495 nm Cutoff DichroIc-Spiegel und ein 520/35 nm Bandpass-Emissionsfilter. Für TMRM verwenden Sie einen Filterwürfel für TRITC mit einem 540/25 nm Bandpass-Anregungsfilter, einem 225 nm Cutoff-dichroitischen Spiegel und einem 605/55 nm Bandpass-Emissionsfilter.
  3. Erstellen Sie ein Imaging-Protokoll mit der Erfassungssoftware.
    1. Wählen Sie die richtige Art von Multiwell-Platte (Hersteller und Code) aus der Liste der verfügbaren Platten in der Software zur Verfügung gestellt. Alternativ definieren Sie Ihr eigenes Multiwell-Plattenformat mit Teller und Well-Dimensionen.
    2. Richten Sie die Well-Platte entsprechend den Anweisungen der Software aus, z. B. indem Sie zwei Ecken der vier äußeren Eckbrunnen definieren. Dieser Schritt umfasst für die Kameraorientierung.
    3. Wählen Sie die Brunnen aus, die erworben werden sollen. Wenn diese Option in der Software nicht verfügbar ist, verwenden Sie einen Satz von manuell definierten XY-Standorten, die den ausgewählten Vertiefungen entsprechen.
    4. Optimieren Sie die Erfassungseinstellungen (Belichtungszeit, Lampenintensität, EM-Verstärkung) für thE zwei Kanäle separat mit der Testplatte. Minimieren Sie Belichtung und Intensität, da Fluoreszenzanregungslicht selbst ROS induziert. Aber stellen Sie sicher, dass das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis mindestens 2 für basale CM-H 2 DCFDA und 3 für TMRM vor TBHP-Behandlung ist und dass es keine Sättigung nach TBHP-Behandlung gibt. Die Akquisitionseinstellungen hängen stark von der verwendeten Mikroskopie-Setup- und Zellentypen ab, aber als Referenz sind indikative Einstellungen bei Verwendung einer Metallhalogenid-Glühbirne von 130 W als Lichtquelle und NHDF-Zellen, die gemäß den Anweisungen des Protokolls gefärbt sind, wie folgt: für beide CM- H 2 DCFDA und TMRM werden eine Belichtungszeit von 200 ms und ND-Filter 8 verwendet, kombiniert mit einer EM-Verstärkung von 15 (13 MHz, 14 Bit) bzw. 4 (27 MHz; 14-Bit). Einmal optimiert für einen bestimmten Setup- und Zelltyp, kann dieser Schritt übersprungen werden.
      HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Erfassungseinstellungen während des gesamten Bildgebungsprozesses gleich bleiben. Für großräumige, mehrtägige Experimente, Lampe staDurch regelmäßige Qualitätskontrolle gerechtfertigt werden.
    5. Definieren Sie ein Erfassungsprotokoll, das aus einer sequentiellen Lambda (Wellenlänge) Erfassung besteht. Wählen Sie zuerst den CM-H 2 DCFDA-Kanal aus, um die Lichtbelichtung vor der Messung zu minimieren.
    6. Definieren Sie eine Well-Teller-Schleife, um 4 regelmäßig beabstandete, nicht überlappende Bilder zu erfassen, die um das Zentrum jeder Vertiefung der Wannenauswahl unter Verwendung des in 2.3.4 definierten Erfassungsprotokolls positioniert sind. Wählen Sie die mäandernde Bildaufnahme, dh zuerst von links nach rechts, von gut B02 nach B11, dann zurück von rechts nach links von gut C11 nach C02 und so weiter ( Abbildung 2A ). Das spart Zeit im Vergleich zur Links-zu-Rechts-Bildaufnahme. Wenn diese Option nicht in der Software verfügbar ist, passen Sie den benutzerdefinierten Satz von XY-Standorten an, die in 2.3.3 erstellt wurden, um dieses Bildgebungsmuster zu übernehmen.
    7. Speichern Sie die XY-Koordinaten der Imaging-Positionen ( zB in einer separaten XML-Datei), um ein einfaches Revisiti zu ermöglichenNg im Falle einer Mikroskop-Rekalibrierung. Dies ist besonders wichtig, wenn das Auslesen aus diesem Assay mit einer post-hoc-Immunfluoreszenz (IF) -Färbung für dieselben Zellen korreliert werden muss.

3 Seeding Cells in einer 96-Well-Platte (45 - 90 min, abhängig von der Anzahl der verschiedenen Zelllinien)

  1. Arbeiten in sterilen Umgebungen wie einem Biosicherheitsschrank der Klasse 2 und tragen Handschuhe.
  2. Dekontaminieren Sie alle Oberflächen und Materialien mit 70% V / V Ethanol in destilliertem Wasser.
  3. Nehmen Sie einen Zellkulturkolben mit einer 90% konfluenten Zellkultur aus dem Inkubator und legen Sie ihn in den Biosicherheitsschrank.
  4. Die Zellen zweimal mit PBS 1x waschen.
  5. Fügen Sie die geeignete Menge an 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung auf die Zellen hinzu, wobei darauf zu achten ist, dass die gesamte Zelloberfläche bedeckt ist ( z. B. 1 ml für einen T25-Kolben) und inkubieren für 2 min bei 37 ° C und 5% CO 2 .
  6. Wenn alle Zellen abgelöst sind (mit einem Mikroskop überprüfen) ), Addieren Kulturmedium (DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin-Streptomycin, ± 4 ml in einem T25-Kolben), um die Trypsin-EDTA-Lösung zu inaktivieren.
  7. 5 min bei 300 xg bei Raumtemperatur zentrifugieren.
  8. Den Überstand verwerfen und das Zellpellet in Kulturmedium resuspendieren. Bestimmen Sie die Menge an Medium für jeden Zelltyp, um eine Zellkonzentration zu erhalten, die mit der Zellzählung kompatibel ist. Typischerweise enthält ein 90% konfluenter T25-Kolben aus NHDF etwa 1-1,5 Millionen Zellen, die in 3-4 ml Kulturmedium resuspendiert werden.
  9. Zählen Sie die Zellen mit einer Zellzählkammer oder Coulter Zähler.
  10. Seed 8.000-10.000 Zellen in jedem der inneren 60 Vertiefungen einer schwarzen 96-Well-Platte mit einem dünnen kontinuierlichen Polystyrol oder Glasboden (schwarz, um Streuung und Übersprechen zwischen benachbarten Brunnen während der Bildgebung zu vermeiden). Bei Verwendung unterschiedlicher Bedingungen / Behandlungen / Zelllinien verteilen Sie ihre Saatplätze homogen auf die Platte, um Platteneffekte zu minimieren (Abb. "Abb. 2A) Die äußeren Brunnen, mit Ausnahme der Brunnen B01 und A01, werden nicht verwendet, weil sie anfälliger für Randeffekte sind.
  11. Samen 8.000-10.000 Zellen in B01. Diese gut wird für die Fokuseinstellung verwendet, kurz vor der Bilderfassung.
  12. Füllen Sie die leeren äußeren Brunnen mit Medium, um die Steigungen (Temperatur, Feuchtigkeit, etc. ) zwischen den Brunnen und der Umgebung zu minimieren.
  13. Schütteln Sie den Teller dreimal vorsichtig, bevor Sie ihn wieder in den Inkubator legen, um zu vermeiden, dass Zellen in Patches wachsen.
  14. Kultur die Zellen für 24 h oder bis zu einem Konfluenzgrad von ca. 70%
  15. Speichern Sie die Behandlungsinformationen für das Experiment in eine Kalkulationstabelle mit dem Namen "Setup.xlsx". Die Datei sollte vier Spalten enthalten und wird verwendet, um Behandlungen mit Brunnen und Bildinformationen während der Datenanalyse zu verknüpfen. Die vier Spalten sind: "Nun", "Behandlungsnummer", "Behandlung" und "Kontrolle" (eine Zeile pro Brunnen). Jede Behandlung ist gekoppeltMit einer einzigartigen Behandlungsnummer, die bei der Datenvisualisierung verwendet wird, um die Reihenfolge der Behandlungen auf der X-Achse der Plots zu bestimmen. Die Kontrollspalte spezifiziert die Behandlung, die als Kontrolle für die Behandlung in der aktuellen Zeile fungiert. Abbildungen von einem typischen experimentellen Layout und einer entsprechenden Setup-Datei sind in Abbildung 2 dargestellt.

4. Beladen der Zellen mit CM-H 2 DCFDA und TMRM (± 45 min)

HINWEIS: Die Handhabung der Zellen am Tag des Experiments kann in einer sterilen Umgebung (Biosicherheitskabinett) durchgeführt werden, aber dies ist nicht zwingend erforderlich, da die Zellen direkt nach dem Assay entsorgt oder fixiert werden.

  1. Den HH-Puffer auf 37 ° C erhitzen.
  2. Vorbereitung einer 20 μM TMRM-Arbeitslösung durch Verdünnen der 1 mM Stammlösung 50 mal in HH-Puffer (Zugabe von 490 μl HH-Puffer zu 1 Aliquot von 10 μl TMRM Stammlösung).
  3. Vorbereitung einer LastLösung mit 2 μM CM-H 2 DCFDA und 100 nM TMRM. Zu diesem Zweck die 1 mM CM-H 2 DCFDA-Stammlösung 500x und die 20 μM TMRM-Arbeitslösung 200x in HH-Puffer verdünnen.
    1. Typischerweise werden für 60 Vertiefungen 7,5 ml Beladungslösung durch Zugabe von 15 & mgr; l CM-H 2 DCFDA und 37,5 & mgr; l TMRM-Lösung auf 7447,5 & mgr; l HH hergestellt.
  4. Verwerfe das Kulturmedium aus den Zellen, indem du die Platte in einer einzigen Flüssigkeitsbewegung umgedreht hast.
  5. Die Zellen zweimal mit HH-Puffer mit einer Mehrkanalpipette (100 μl / Vertiefung) zweimal abwaschen. Verwerfen Sie den HH-Puffer zwischen den Waschschritten, indem Sie die Platte in einer einzigen Flüssigkeitsbewegung umgedreht drehen.
  6. Laden Sie die Zellen mit CM-H 2 DCFDA und TMRM durch Zugabe von 100 μl der Beladungslösung zu jeder Vertiefung, wiederum unter Verwendung einer Mehrkanalpipette. Inkubieren für 25 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. Vergiss nicht gut B01.
  7. Während dieser 25 min, bereiten Sie Arbeitslösungen des Oxidationsmittels TBHP vor und stellen Sie sicher, dass das Mikroskop und die Zusatzhardware eingeschaltet sind.
    1. Arbeitslösung I vorbereiten: 7M Stammlösung 70x bis 100 mM verdünnen (10 μl Lager in 690 μl HH-Puffer).
    2. Arbeitslösung vorbereiten II: WS I 100x bis 1 mM verdünnen (10 μl WS I in 990 μl HH-Puffer).
    3. Arbeitslösung vorbereiten III: WS III 25x bis 40 μM verdünnen (für 60 Vertiefungen 300 μl WS II in 7200 μL HH Puffer hinzufügen).
  8. Nach 25 min die Zellen zweimal mit 100 μl HH-Puffer wie zuvor beschrieben waschen.
  9. Füge 100 μl HH-Puffer zu allen 60 inneren Vertiefungen hinzu.

5. Erste Live-Imaging-Runde zur Messung der Basal-ROS-Stufen und der mitochondrialen Morphofunktion (± 15 min)

  1. Stellen Sie sicher, dass die Erfassungssoftware betriebsbereit ist und das Imaging-Protokoll geladen ist.
  2. Installiere die Platte auf dem Mikroskop, schalte die Hardware einSed Autofokus-System und verwenden Sie gut B01, um den Autofokus-Offset mit dem TMRM-Kanal anzupassen. Da dieses Verfahren eine Erhöhung der CM-H & sub2 ; DCFDA-Signalintensität induziert, wird diese Vertiefung von der nachgeschalteten Bildanalyse ausgeschlossen.
  3. Führen Sie das Imaging-Protokoll aus.

6. Zweite Live-Imaging-Runde nach der Addition von TBHP zur Messung induzierter ROS-Werte (± 20 min)

  1. Entfernen Sie vorsichtig die 96-Well-Platte aus dem Mikroskop.
  2. Füge 100 μl TBHP WS III (40 μM) zu jeder Vertiefung unter Verwendung einer Mehrkanalpipette hinzu (dies führt zu einer 20 μM TBHP-Konzentration in den Vertiefungen). Diese Verbindung wird als interne Positivkontrolle für die CM-H 2 DCFDA-Färbung (das Signal sollte steigen) sowie ein Mittel zur Messung induzierter ROS-Werte verwendet.
    HINWEIS: H 2 O 2 kann auch anstelle von TBHP verwendet werden, aber diese Verbindung ist weniger stabil und daher weniger zuverlässig.
  3. Warten Sie mindestens 3 min, um eine vollständige Reaktion von TBHP zu ermöglichenIth CM-H 2 DCFDA.
  4. Während dieser Zeit 100 μl Antikörper-Arbeitslösung (1 / 1.000) zu gut A01 zugeben.
  5. Befestigen Sie die Platte wieder auf dem Mikroskop und überprüfen Sie den Fokus wieder mit gut B01.
  6. Erwerben Sie die gleichen Positionen wie in der ersten Abbildungsrunde mit demselben Abbildungsprotokoll.
  7. Exportieren Sie die erfassten Datensätze in einem einzelnen Ordner als einzelne TIFF-Dateien mit standardisierter Nomenklatur, die den Verweis auf die Platte, die Vor- oder Nach-TBHP-Behandlung, das Feld, den Kanal und den Kanal enthält, getrennt durch Unterstriche, z . 'P01_Pre_B02_0001_C1' für Platte 1, Vor-TBHP-Behandlung, Brunnen B02, Feld 1 und Kanal 1. Diese Information wird bei der Bildanalyse verwendet ( zB zur Auswahl der entsprechenden Segmentierungseinstellungen) sowie bei der Datenanalyse (zur Analyse von Analysedaten Mit den richtigen Behandlungen).
  8. Erfassen Sie flache Feldbilder für beide Kanäle an allen vier Positionen um die Mitte des Brunnens A01 mit dem Erfassungsprotokoll. Sparen Sie thEm als einzelne TIFF-Dateien im selben Ordner wie die anderen Bilder unter Verwendung der folgenden standardisierten Nomenklatur: 'P01_FF_A01_0001_C1' für Platte 1, Feld 1 und Kanal 1. Vergewissern Sie sich, dass sich die Signale im Dynamikbereich befinden. Im Falle der Sättigung eine geringere Konzentration an Antikörper-Arbeitslösung verwenden.
  9. Verwerfen Sie die Platte oder speichern Sie für die weitere Verarbeitung.
    HINWEIS: Anstatt die Platte aus dem Mikroskop zu entfernen und eine Mehrkanalpipette zu verwenden, um die TBHP-Lösung hinzuzufügen, kann eine automatisierte Pipette auf der Mikroskopstufe installiert und mit der Erfassungssoftware verbunden werden, um so bei einem Trigger zu funktionieren. Dies ermöglicht das Hinzufügen von TBHP zu jedem Brunnen direkt nach der ersten Akquisition, bevor er zum nächsten Brunnen geht. Auf diese Weise, wenn die erste bildgebende Runde beendet ist, kann die zweite sofort beginnen und alle Brunnen haben eine gleiche Inkubationszeit mit dem TBHP gehabt.

7. Bildverarbeitung und -analyse (± 30 min pro96-Well-Platte)

HINWEIS: Die gesamte Bildverarbeitung erfolgt in FIJI (http://fiji.sc), einer verpackten Version von ImageJ Freeware. Ein dediziertes Skript wurde für die automatisierte Analyse von intrazellulären ROS- und mitochondrialen Signalen sowie morphologischen Parametern (RedoxMetrics.ijm, auf Anfrage erhältlich) geschrieben. Die zugrunde liegenden Algorithmen sind in Sieprath et al. 1

  1. Stellen Sie sicher, dass FIJI installiert und betriebsbereit ist.
  2. Starten Sie FIJI und installieren Sie das Makro-Set (Plugins -> Makros -> Installieren ...). Dies ruft eine Reihe neuer Makrobefehle sowie eine Reihe von Aktionswerkzeugen auf, um die Analyseeinstellungen zu optimieren, wie in Abbildung 3A gezeigt .
  3. Öffnen Sie die Setup-Schnittstelle, um die Analyseeinstellungen einzustellen, indem Sie auf die Schaltfläche 'S' klicken (Abbildung 3B ).
    1. Wählen Sie den Bildtyp, die Anzahl der Kanäle und den verwendeten Brunnen ausZum Erwerb von Flatfield-Bildern.
    2. Geben Sie an, welcher Kanal Zellen enthält (CM-H 2 DCFDA-Kanal) oder Mitochondrien (TMRM-Kanal) und stellen Sie die Vorverarbeitungs- und Segmentierungsparameter für jeden Kanal in Abhängigkeit von der Bildqualität ein (Abbildung 3B ). Markieren Sie die Kontrollkästchen 'Hintergrund' und 'Kontrast', um eine Hintergrund-Subtraktion oder eine kontrastbegrenzte adaptive Histogramm-Entzerrung 16 durchzuführen. Definiere ein Sigma für die Gaußsche Verschwommenheit der Zellen und die Laplace-Verstärkung der Mitochondrien. Wählen Sie einen automatischen Schwellenwert-Algorithmus aus und füllen Sie die Größenausschlussgrenzen (in Pixeln) aus. Wenn anstelle eines automatischen Schwellenwertalgorithmus eine feste Schwelle gewählt wird, füllen Sie den oberen Schwellenwert aus.
    3. Testen Sie die Segmentierungseinstellungen auf ein paar ausgewählten Bildern der erfassten Datensätze, indem Sie sie öffnen und auf die Schaltflächen "C" oder "M" im Menü für die Zell- oder Mitochondriensegmentierung klicken,Und ggf. die Einstellungen anpassen. Ein Beispielergebnis ist in Fig. 3C gezeigt .
  4. Führen Sie die Batch-Analyse auf dem / den Ordner aus, indem Sie auf die Schaltfläche '#' klicken und den Ordner mit den Bildern auswählen. Pro Ordner wird ein neues 'Output'-Verzeichnis erstellt, das einzelne ROI-Sets (Zip-Dateien) und Ergebnisdateien (.txt) pro Bild enthält. Für beide Kanäle enthält die Ergebnisdatei Intensität und morphologische Deskriptoren. Die CM-H 2 DCFDA-Kanal (Zellen) Ergebnisdatei enthält pro Deskriptor den Mittelwert für die kombinierten ROIs innerhalb eines Bildes. Für den TMRM-Kanal enthält die Ergebnisdatei pro Deskriptor den Wert für jeden einzeln segmentierten mitochondrialen ROI.
  5. Nach der Chargenanalyse überprüft man die Segmentierungsleistung auf einem "Verifizierungsstapel" visuell, ein Hyperstapel aller Bilder mit dem jeweiligen ROI-Overlay, indem du auf die Schaltfläche 'V' klickst. Auf diese Weise sind Artefakte wie Over-/ Untersegmentierung, unscharfe Bilder oder Staubpartikel / Fasern in Bildern können schon schnell erkannt werden. Eine weitere Kuration kann während der Datenqualitätskontrolle durchgeführt werden (siehe § 8).

8. Datenanalyse, Qualitätskontrolle (QC) und Visualisierung

Die Verarbeitung und Auswertung der Rohdaten erfolgt über R statistische Freeware (http://www.rproject.org - Version 3.3.2) und RStudio (http://www.rstudio.com/ - Version 1.0.44). Um die Ergebnisse schnell zu erhalten und zu visualisieren, wurde eine intuitive Shiny-Applikation 17 (auf Anfrage) konzipiert, die die Daten in Wärmeabbildungen und Boxplots integriert und visualisiert und statistische Analysen durchführt. Im Allgemeinen besteht der Arbeitsablauf aus zwei aufeinanderfolgenden Schritten. Zuerst werden die Daten pro 96-Well-Platte verarbeitet und überprüft, um fehlerhafte Datenpunkte zu detektieren. Zweitens werden kuratierte Daten aus allen Platten eines gegebenen Experiments kombiniert und mit nichtparametrischem Multi analysiertVariationstests 18 und eine Hauptkomponentenanalyse.

  1. Stellen Sie sicher, dass R und RStudio installiert und betriebsbereit sind.
  2. Starten Sie RStudio.
  3. Öffnen Sie die redoxMetrics glänzende Anwendung und führen Sie die App aus (wählen Sie, um sie in einem externen Browser auszuführen).
  4. Wählen Sie auf der Seite 'Eingabe' das Verzeichnis aus, in dem sich die Ergebnisdateien von RedoxMetrics.ijm befinden.
  5. Stellen Sie sicher, dass "Setup.xlsx" (erstellt in Schritt 3.15) auch in diesem Verzeichnis vorhanden ist.
  6. Die Ergebnisdateien und Setup-Informationen werden automatisch importiert, neu arrangiert und visualisiert.
    1. Die Seite "experimentelle Einrichtung" zeigt das Layout des Experiments. Verwenden Sie diese Seite zur Bestätigung.
    2. Die nächste Seite, 'Ergebnisse pro Platte' zeigt die Daten für jede Platte separat in einem farbcodierten Multi-Well-Plattenlayout sowie in Boxplots mit Ausreißern mit Namens- und Bildnummer. Letzteres erlaubt eine einfache Inspektion und identIfizierung von fehlerhaften Datenpunkten (extrem hohe oder niedrige Werte im Vergleich zu den für diese spezifische Behandlung gemessenen Durchschnittswerten - siehe Abbildung 4 für ein Beispiel).
      Mit diesen Informationen überprüfen Sie die Bilder, die den aberranten Punkten entsprechen. Wenn Anomalien erkannt werden, müssen sie aus der Analyse entfernt werden. Die meisten Anomalien werden durch falsche Segmentierung verursacht, wenn (Teil) des Bildes unscharf ist oder wenn hoch fluoreszierende Staubpartikel die richtige Segmentierung stören. Extreme Fälle können bereits schnell mit dem Bestätigungsstapelwerkzeug entdeckt werden (Schritt 7.5), aber bei diesem Schritt werden noch subtilere Vorkommnisse entdeckt. Wenn kein offensichtlicher oder technischer Grund für den fehlerhaften Wert gefunden werden kann, sollte das Bild nicht aus der Analyse entfernt werden.
    3. Optional: Erstellen Sie eine neue Tabellenkalkulation mit dem Namen 'Drop.xlsx' mit nur einer Spalte mit dem Namen 'Drop'. In dieser Spalte können Sie die Dateinamen (einschließlich ".tif" -Erweiterung) aller Bilder auflistenDie aus der Analyse entfernt werden müssen (identifiziert in Schritt 7.5 oder Schritt 8.6.2). Laden Sie diese Datei mit der 'input' -Seite hoch.
    4. Die 'Gesamtexperiment' Seite zeigt die Ergebnisse aller Platten zusammen. Wenn eine Drop-Datei hochgeladen wurde, wird diese Datei verwendet, um die angegebenen Datenpunkte aus der Analyse zu entfernen.
      Für jeden Parameter einzeln werden die Daten pro Platte entsprechend ihrer jeweiligen Steuerung normiert. Daten von allen Platten werden dann kombiniert, gefolgt von nichtparametrischen multivariaten Tests aus dem nparcomp-Paket 18 . Wenn nur 2 Behandlungen verglichen werden, werden zwei Probentests für das nichtparametrische Behrens-Fisher-Problem durchgeführt. Für mehr als 2 Behandlungen wird ein nicht parametrischer kontrastbasierter Mehrfachvergleichstest verwendet. Die Ergebnisse werden mit Boxplots visualisiert.
    5. Die Seite "Clusteranalyse" zeigt die Ergebnisse einer Hauptkomponentenanalyse (PCA - R Kern 'Stats' Paket). Daten aus 5 Parametern (baSal & induziertes ROS und mitochondriales Membranpotential, Größe & Zirkularität) kombiniert werden, um die verschiedenen Behandlungen auf der Grundlage eines empfindlichen Redoxprofils zu unterscheiden. Zu diesem Zweck wird eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) durchgeführt (R core 'stats' package). Die Ergebnisse werden mit einem Biplot (ggbiplot Paket - http://github.com/vqv/ggbiplot) visualisiert.
    6. Verwenden Sie die Seite "Downloaddaten", um die Backend-Datenrahmen herunterzuladen, die die verarbeiteten und umgeordneten Daten enthalten, so dass sie für fortgeschrittenere Datenvisualisierung oder statistische Analysen wiederverwendet werden können.
      HINWEIS: Typische Fallstricke und mögliche Lösungen sind in Tabelle 1 aufgelistet.

Ergebnisse

Der Assay wurde mit mehreren Kontrollversuchen benchmarkiert, deren Ergebnisse in Sieprath et al. 1 In kurzer Zeit wurde die Fluoreszenzantwort von CM-H 2 DCFDA und TMRM auf fremd induzierte Veränderungen in intrazellulärem ROS und Δψ m quantifiziert, um den dynamischen Bereich zu bestimmen. Für CM-H 2 DCFDA zeigte NHDF eine lineare Erhöhung des Fluoreszenzsignals bei der Behandlung mit steigenden Konzentrationen von...

Diskussion

Dieses Papier beschreibt eine hochauflösende Mikroskopie-Methode zur gleichzeitigen Quantifizierung von intrazellulären ROS-Niveaus und mitochondrialer Morphofunktion in NHDF. Seine Leistung wurde mit einer Fallstudie über SQV-behandelten NHDF nachgewiesen. Die Ergebnisse unterstützen frühere Hinweise aus der Literatur, bei denen nach der Behandlung mit HIV-Protease-Inhibitoren des Typs 1 erhöhte ROS-Spiegel oder mitochondriale Dysfunktion beobachtet wurden, wenn auch in separaten Experimenten 19...

Offenlegungen

Die Autoren geben an, dass es keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte gibt. Der entsprechende Autor sorgt auch dafür, dass alle Autoren aufgefordert wurden, alle Interessenkonflikte zu offenbaren.

Danksagungen

This research was supported by the University of Antwerp (TTBOF/29267, TTBOF/30112), the Special Research Fund of Ghent University (project BOF/11267/09), NB-Photonics (Project code 01-MR0110) and the CSBR (Centers for Systems Biology Research) initiative from the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO; No: CSBR09/013V). Parts of this manuscript have been adapted from another publication1, with permission of Springer. The authors thank Geert Meesen for his help with the widefield microscope.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM)ThermoFisher ScientificT668
CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator)ThermoFisher ScientificC6827
Dimethyl sulfoxideSigma)AldrichD8418
MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass LiddedBrooks life science systemsMGB096-1-2-LG-L
HBSS w/o Phenol Red 500 mLLonzaBE10-527F
DMEM high glucose with L-glutamineLonzaBE12-604F
Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and MgLonzaBE17-516F
HEPES 1 M 500 mLLonza17-737F
Trypsin-Versene (EDTA) SolutionLonzaBE17-161E
Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson711-166-152Antibody used for acquiring flat-field image
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson711-546-152Antibody used for acquiring flat-field image
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Nikon Ti eclipse widefield microscopeNikon
Perfect Focus System (PFS)Nikonhardware-based autofocus system
CFI Plan Apo Lambda 20X objectiveNikon
NameCompanyCatalog NumberComments
Software
NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS moduleNikonThis software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol
ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g
RStudio Version 1.0.44Rstudio
R version 3.3.2

Referenzen

  1. Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction. AAEC. 219, 149-177 (2016).
  2. Marchi, S., et al. Mitochondria-ros crosstalk in the control of cell death and aging). J Signal Transduct. 2012, 1-17 (2012).
  3. Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS lett. 416 (1), 15-18 (1997).
  4. Miwa, S., Brand, M. D. Mitochondrial matrix reactive oxygen species production is very sensitive to mild uncoupling. Biochem Soc Trans. 31 (Pt 6), 1300-1301 (2003).
  5. Verkaart, S., et al. Superoxide production is inversely related to complex I activity in inherited complex I deficiency. BBA-GEN SUBJECTS. 1772 (3), 373-381 (2007).
  6. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (pt 1), 1-13 (2009).
  7. Lebiedzinska, M., et al. Oxidative stress-dependent p66Shc phosphorylation in skin fibroblasts of children with mitochondrial disorders. BBA-GEN SUBJECTS. 1797 (6-7), 952-960 (2010).
  8. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. BBA-BIOENERGETICS. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  9. Willems, P. H. G. M., Rossignol, R., Dieteren, C. E. J., Murphy, M. P., Koopman, W. J. H. Redox Homeostasis and Mitochondrial Dynamics. Cell Metab. 22 (2), 207-218 (2015).
  10. Koopman, W. J. H., et al. Human NADH:ubiquinone oxidoreductase deficiency: radical changes in mitochondrial morphology?. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (1), C22-C29 (2007).
  11. Archer, S. L. Mitochondrial dynamics--mitochondrial fission and fusion in human diseases. N Engl J Med. 369 (23), 2236-2251 (2013).
  12. Rambold, A. S., Kostelecky, B., Elia, N., Lippincott-Schwartz, J. Tubular network formation protects mitochondria from autophagosomal degradation during nutrient starvation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10190-10195 (2011).
  13. Koopman, W. J. H., et al. Simultaneous quantification of oxidative stress and cell spreading using 5-(and-6)-chloromethyl-2 ",7 -"dichlorofluorescein. Cytometry A. 69A (12), 1184-1192 (2006).
  14. Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy. Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).
  15. Sieprath, T., et al. Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates. Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).
  16. Zuiderveld, K. Contrast limited adaptive histogram equalization. Graphics gems IV. , 474-485 (1994).
  17. Chang, W., Cheng, J., Allaire, J. J., Xie, Y., McPherson, J. . shiny: Web Application Framework for R. R package version 0.14.2. , (2017).
  18. Konietschke, F., Placzek, M., Schaarschmidt, F., Hothorn, L. A. nparcomp: An R Software Package for Nonparametric Multiple Comparisons and Simultaneous Confidence Intervals. J Stat Softw. 64 (9), 1-17 (2015).
  19. Estaquier, J., et al. Effects of antiretroviral drugs on human immunodeficiency virus type 1-induced CD4(+) T-cell death. J Virol. 76 (12), 5966-5973 (2002).
  20. Matarrese, P., et al. Mitochondrial membrane hyperpolarization hijacks activated T lymphocytes toward the apoptotic-prone phenotype: homeostatic mechanisms of HIV protease inhibitors. J Immunol. 170 (12), 6006-6015 (2003).
  21. Roumier, T., et al. HIV-1 protease inhibitors and cytomegalovirus vMIA induce mitochondrial fragmentation without triggering apoptosis. Cell Death Differ. 13 (2), 348-351 (2006).
  22. Chandra, S., Mondal, D., Agrawal, K. C. HIV-1 protease inhibitor induced oxidative stress suppresses glucose stimulated insulin release: protection with thymoquinone. Exp Biol Med (Maywood). 234 (4), 442-453 (2009).
  23. Touzet, O., Philips, A. Resveratrol protects against protease inhibitor-induced reactive oxygen species production, reticulum stress and lipid raft perturbation. AIDS. 24 (10), 1437-1447 (2010).
  24. Bociąga-Jasik, M., et al. Metabolic effects of the HIV protease inhibitor--saquinavir in differentiating human preadipocytes. Pharmacol Rep. 65 (4), 937-950 (2013).
  25. Xiang, T., Du, L., Pham, P., Zhu, B., Jiang, S. Nelfinavir, an HIV protease inhibitor, induces apoptosis and cell cycle arrest in human cervical cancer cells via the ROS-dependent mitochondrial pathway. Cancer Lett. 364 (1), 79-88 (2015).
  26. Blanchet, L., Smeitink, J. A. M., et al. Quantifying small molecule phenotypic effects using mitochondrial morpho-functional fingerprinting and machine learning. Sci. Rep. 5, 8035 (2015).
  27. . Reactive Oxygen Species (ROS) Detection Reagents Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp36103.pdf (2006)
  28. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
  29. Mihara, K., Nakayama, T., Saitoh, H. A Convenient Technique to Fix Suspension Cells on a Coverslip for Microscopy. Curr Protoc Cell Biol. 68, 4.30.1-4.30.10 (2015).
  30. Deutsch, M., Deutsch, A., et al. A novel miniature cell retainer for correlative high-content analysis of individual untethered non-adherent cells. Lab Chip. 6 (8), 995-996 (2006).
  31. Price, H. P., MacLean, L., Marrison, J., O'Toole, P. J., Smith, D. F. Validation of a new method for immobilising kinetoplastid parasites for live cell imaging. Mol Biochem Parasitol. 169 (1), 66-69 (2010).
  32. Sabati, T., Galmidi, B. S., Korngreen, A., Zurgil, N., Deutsch, M. Real-time monitoring of changes in plasma membrane potential via imaging of fluorescence resonance energy transfer at individual cell resolution in suspension. JBO. 18 (12), (2013).
  33. Fercher, A., O'Riordan, T. C., Zhdanov, A. V., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging of cellular oxygen and analysis of metabolic responses of mammalian cells. Meth Mol Biol. 591 (Chapter 16), 257-273 (2010).
  34. Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 95 (Chapter 3), 57-75 (2005).
  35. Gao, L., Shao, L., Chen, B. C., Betzig, E. 3D live fluorescence imaging of cellular dynamics using Bessel beam plane illumination microscopy. Nat. Protoc. 9 (5), 1083-1101 (2014).
  36. Meijer, M., Hendriks, H. S., Heusinkveld, H. J., Langeveld, W. T., Westerink, R. H. S. Comparison of plate reader-based methods with fluorescence microscopy for measurements of intracellular calcium levels for the assessment of in vitro neurotoxicity. Neurotoxicology. 45, 31-37 (2014).
  37. Bushway, P. J., Mercola, M., Price, J. H. A comparative analysis of standard microtiter plate reading versus imaging in cellular assays. Assay and drug development technologies. 6 (4), 557-567 (2008).
  38. Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).

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