Synthese von biokompatiblen Liquid Crystal Elastomerschäume als Zellgerüste für 3D Spatial Zellkulturen

Zusammenfassung

Diese Studie stellt eine Methode zur Herstellung von 3D, biologisch abbaubare, schaumartige Gerüste Zelle basierend auf biokompatible Seitenkettenflüssigkristall Elastomere (LCEs). Die konfokale Mikroskopie Experimente zeigen, dass schaumartige LCEs ermöglichen Zellanheftung, Proliferation und die spontane Ausrichtung der C2C12s Myoblasten.

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt Herstellung eines 3D, biologisch abbaubaren, schaumartige Zellgerüst. Diese Gerüste wurden hergestellt durch vernetzende Stern-Block-Copolymere mit Cholesterin-Einheiten als Seitenketten-Seitengruppen, die sich in der smektischen A (SmA) Flüssigkristall Elastomere (LCEs). Schaumartige Gerüste, hergestellt Metall Vorlagen verfügen miteinander verbundene Mikrokanäle, so dass sie geeignet als 3D-Zellkulturgerüste. Die kombinierten Eigenschaften der regelmäßigen Struktur des Metallschaums und des Elastomer Ergebnis in einem 3D - Zell Gerüst , das nicht nur eine höhere Zellproliferation im Vergleich zu herkömmlichen porösen Templat Filme, sondern auch eine bessere Verwaltung der Massentransport (dh Nährstoffe, Gase, Abfall fördert usw.). Die Art der Metallschablone ermöglicht die einfache Bearbeitung von Schaumformen (dh Rollen oder Folien) und zur Herstellung von Gerüsten unterschiedlicher Porengrößen für unterschiedliche Zellstudien unter Beibehaltung die interconnected poröse Natur der Vorlage. Der Ätzprozess wirkt sich nicht auf die Chemie der Elastomere, ihre biokompatibel und biologisch abbaubar Natur zu bewahren. Wir zeigen, dass diese smektische LCEs, wenn sie für ausgedehnte Zeiträume gewachsen, die Untersuchung von klinisch relevanten und komplexen Gewebekonstrukte ermöglichen, während das Wachstum und die Vermehrung von Zellen zu fördern.

Einleitung

Es gibt mehrere Beispiele von biologischen und biologisch verträglichen synthetischen Materialien zur Anwendung , in Zellstudien und für die Geweberegeneration darauf abzielen, die Zellanheftung und Proliferation ^{1, 2, 3, 4, 5.} Es gibt einige Beispiele von biokompatiblen Materialien gewesen, bekannt als Flüssigkristall Elastomere (LCEs), die Molekular auf äußere Reize mit anisotropen reagieren könnten Bestellung ^{6, 7.} LCEs sind Stimuli reagierende Materialien , die die mechanischen und elastischen Eigenschaften von Elastomeren , die mit den optischen Funktionen und molekularen Anordnung von Flüssigkristallen ^{8, 9} verbinden. LCEs können Änderungen in der Form, mechanische Verformung, elastisches Verhalten auf, und die optischen Eigenschaften in Reaktion auf externe stimUli (dh., Wärme, Druck, Licht, etc.) ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16.} Frühere Studien haben gezeigt , dass Flüssigkristallen (LCs) ⁴ , das Wachstum und die Orientierung von Zellen abtasten ^{kann, 17.} Es ist möglich, dann davon ausgehen, dass LCEs für biologisch und medizinisch relevante Anwendungen geeignet sein kann, einschließlich Zellgerüsten und Ausrichtung. Wir haben bereits berichtet , die Herstellung von smektischen biokompatibles, biologisch abbaubarem, gussgeformt, und dünnen Filme von LCEs einen „Swiss-Käse - Typ“ poröse Morphologie ^{6, 18.} Wir haben auch nematische biokompatiblen LCEs mit globuläre Morphologie als Gerüste für das Zellwachstum ¹⁹ hergestellt ^{20. Unsere Arbeit wurde bei Abstimmung der mechanischen Eigenschaften der Materialien richtet 21 diejenigen des Gewebes von Interesse zu entsprechen. Außerdem konzentrieren sich diese Studien auf Elastomer-Zell-Wechselwirkungen zu verstehen, sowie zelluläre Reaktion, wenn die Elastomere auf äußere Reize unterliegen.}

Die wichtigsten Herausforderungen waren teilweise die Porosität des LCEs maßzuschneidern für die Zellanheftung und Permeation durch die Elastomermatrix und zum besseren Massentransport zu ermöglichen. Die Porosität dieser Dünnschichten ⁶ für Zellpermeation durch die Masse der Matrix erlaubt, aber nicht alle Poren vollständig miteinander verbunden waren oder hatten ein regelmäßigeres (homogen) Größe Pore. Wir berichten dann auf biokompatiblen nematischen LCE Elastomere mit globulären Morphologien. Diese nematische Elastomere für die Anheftung und Proliferation von Zellen erlaubt, aber die Porengröße lag im Bereich von 10 bis 30 nur um, was verhindert, oder die Verwendung von dieser beschränktElastomere mit einer größeren Vielfalt von Zelllinien ^{19, 20.}

Frühere Arbeiten von Kung et al. im Zusammenhang mit der Bildung von Graphen Schäumen einer „Opfer“ Metallschablone zeigte , dass der erhaltene Graphitschaum eine sehr regelmäßige poröse Morphologie durch die gewählte Metallschablone ²² diktiert hatte. Diese Methode bietet die volle Kontrolle über die Porosität und Porengröße. Zur gleichen Zeit, die Geschmeidigkeit und Flexibilität der Metallschablone ermöglichen die Bildung von verschiedener Vorlage Schaumherstellung vor prägt. Andere Techniken, wie beispielsweise Material Auslaugung ^23, Gas Templat ²⁴ oder elektrogesponnenen Fasern ^{25, 26} bieten auch das Potential für die Herstellung von porösen Materialien, aber sie sind zeitaufwendig , und in einigen Fällen wird die Porengröße begrenzt auf nur wenige Mikrometer. Schaum-ähnlichen 3D LCEs vorbereitet Metallschablonen für eine höhere Zellenlast erlauben verwendet; eine verbesserte Proliferationsrate; Cokultivieren; und last but not least, eine bessere Massentransportmanagement (dh Nährstoffe, Gase und Abfall) , um sicherzustellen , vollständige Gewebeentwicklung ^27. Schaumartige 3D LCEs scheint auch Zellausrichtung zu verbessern; Dies ist wahrscheinlich in Bezug auf die LC-Anhänger Abfühlen Zellwachstum und die Zellorientierung. Die Anwesenheit von LC-Einheiten innerhalb des LCE erscheint Zellenausrichtung mit Bezug auf Zellenposition innerhalb des LCE Gerüstes zu verbessern. Zellen auszurichten innerhalb der Streben des LCE, während keine klare Orientierung beobachtet wird , wo die Verstrebungen miteinander verbinden (junctions) ^27.

Insgesamt ist unsere LCE Zellgerüstplattform als Zellträgermedium bietet die Möglichkeit zur Abstimmung der Elastomer Morphologie und elastische Eigenschaften und insbesondere die Ausrichtung der (individuellen) Zelltypen zu lenken, eine geordnete, räumlichen Anordnungen o zu schaffenf Zellen ähnlich wie lebende Systeme. Abgesehen von einem Gerüst der Lage erhalt Bereitstellung und langfristiges Zellwachstum und -proliferation zu leiten, LCEs erlaubt auch für dynamische Experimente, in denen Zellorientierung und Wechselwirkungen können im laufenden Betrieb geändert werden.

Protokoll

HINWEIS: Die folgenden Schritte für die 3D LCE schaumartige Zubereitung des 3-armige Sternblockcopolymer verwendet , ist in Abbildung 1 dargestellt. Für Kernspinresonanz (NMR) Charakterisierung, die Spektren in deuteriertem Chloroform (CDCl ₃₎ bei Raumtemperatur auf einem Bruker DMX - 400-MHz - Instrumente und intern referenzierten Restpeaks bei 7,26 aufgezeichnet. Fourier-Transformations-Infrarot (FT-IR) Spektren aufgenommen werden, einen Bruker Vector 33 FT-IR-Spektrometer unter Verwendung unter Verwendung von abgeschwächter Totalreflexionsmodus. Für jeden Schritt des folgenden Protokolls ist es wichtig, geeignete persönliche Schutzkleidung (PSA) zu tragen.

1. Synthese von α-Chlor-ε-caprolacton (Monomer) (nach dem Verfahren in Jérôme et al. ²⁸⁾

1. Vor der Synthese beginnt, reinigen 27 g 3-Chlorperbenzoesäure wie folgt:
   1. In 800 ml destilliertem Wasser, fügen 1,28 g NatriumPhosphat monobasisches Monohydrat und 8,24 g dibasisches Natriumphosphat-Heptahydrat. Den pH-Wert auf 7,4 (mit Natriumhydroxid oder Chlorwasserstoffsäure) und Reserve 30 ml dieser Lösung; dies ist die Pufferlösung.
   2. Unter Verwendung eines Scheidetrichter, lösen sich 3-Chlorperbenzoesäure in 35 ml Diethylether. Wasche die organische Lösung mit 10 ml Pufferlösung (hergestellt in Schritt 1.1.1.). Wiederholen Sie die Wäsche dreimal.
   3. Fügen 3 g Natriumsulfat direkt in die organische Lösung; Das Trocknungsmittel absorbiert Wasser aus der organischen Lösung.
   4. Die Lösung wird filtriert das Trocknungsmittel zu entfernen. Man engt das Filtrat unter vermindertem Druck mittels eines Rotationsverdampfer bei 850 mbar und 40 ° C verwendet wird.
2. Solubilisieren 18,5 g gereinigtem 3-Chlorperbenzoesäure in 150 ml trockenem Dichlormethan, indem in einem Ultraschallbad gerührt werden; Dieser Vorgang dauert typischerweise 20 min. Legen Sie die Lösung in einem Trenntrichter.
3. Innerhalb eines Zweihalsrundkolben,lösen sich 13,1 g 2-Chlorcyclohexanon in 15 ml trockenem Dichlormethan eines Magnetrührers unter einer Stickstoffgas. Halten gerührt wurde.
4. Den Scheidetrichter, enthaltend 3-Chlorbenzoesäure-Lösung (aus Stufe 1.2) zu dem Zweihalskolben in Schritt 1.3. Spülen Sie das System mit Stickstoffgas. Justieren der Öffnung des Trenntrichter, so daß die Chlorperbenzoesäure Lösung tropfenweise in den 2-Chlorcyclohexanon Lösung fällt (1 Tropfen alle zwei Sekunden) und weiter für 96 h das Gemisch unter Stickstoffgas gerührt wurde.
5. Man kühlt das Reaktionsgemisch auf -20 ° C für 1 h , um die m - Chlorbenzoesäure (m -CBA) Nebenprodukt auszufällen.
6. Filtern Sie die m - Chlorbenzoesäure (m -CBA) und wäscht die verbleibende Lösung mit einer gesättigten Lösung von Natriumthiosulfat, Natriumhydrogencarbonat, und Natriumchlorid.
7. Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer bei 850 mbar und 40 ° C verwendet wird. Reinige den hellgelben, viskosen Liquid durch Destillation unter vermindertem Druck bei 2,3 Torr und 96 ° C.
8. Überwacht den Erfolg der Synthese der folgenden ¹ H - NMR - Peaks unter Verwendung. ¹ H NMR (400 MHz, _CDCI3, δ [ppm]): 4,75-4,68 (m, 1H, C H ClCO), 4,37-4,26 (m, 1H, C H ₂ O), 4,18 bis 4,05 (m, 1 H , C H ₂ O) und 2,06 bis 1,58 (m, 6H, -C H ₂ -) ^{6, 27.}

2. Synthese von α-dreiarmigen Stern Blockcopolymer (SBC-αCl) durch Ringöffnungscopolymerisation (Sharma et al. ⁶ und Amsden et al. ²⁹⁾

1. Vor der Synthese, silanisieren eine 20 ml-Ampulle, indem er mit einer 2% (v / v) Lösung von 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyltriethoxysilan in Toluol und Rühren für etwa 24 h zu füllen. Spülen mit Isopropylalkohol und trocknen Sie ihn, indem sie in einem Ofen bei 140 ° C für 30 Minuten platziert.
2. In 3.64 g destilliertes ε-Caprolacton, 0,5 g α-Chlor-ε-Caprolacton und 0,25 ml Glycerin in die Ampulle. Mischen unter Verwendung eines Vortex für 1 min.
3. In 4,90 g D, L - Lactid in die Ampulle und mit Stickstoff spülen. Platzieren Sie die Ampulle in einem Ofen bei 120 ° C , um das D, L - Lactid zu schmelzen; Dieser Prozess dauert in der Regel ca. 2 h. Mischen Sie wieder einen Wirbel mit , um sicherzustellen , dass alle Inhalte gut gemischt sind und fügen Sie 66 ul Zinn (II) -2-ethylhexanoat (Sn (Oct) ₂₎ in die Ampulle.
   HINWEIS: D, L - Lactid wird während dieses Prozesses abkühlen und müssen in den Ofen wieder erwärmt werden , zu schmelzen.
4. Energisch ein letztes Mal mit dem Vortex mischen und mit Stickstoff spülen.
5. Schließen Sie die Ampulle mit einem Gummistopfen. Platzieren eine Nadel mit einem Vakuumschlauch verbunden (das Haus Vakuum ist in der Regel ausreichend) durch das Gummistopfen. Schalten Sie das Vakuum und eine Flamme, in der Schmelze die langen Hals des Glases, Zwirnen langsam, bis die glass kollabiert auf sich. Achten Sie darauf, nicht das Gummistopfen zu schmelzen. Nachdem die Ampulle schmolzenen ist, legen sie in einem Sandbad, ein Ofen oder entsprechenden Heizelement bei 140 ° C für 48 h.
6. Nehmen Sie die Ampulle aus und lassen Sie es bei Raumtemperatur abkühlen lassen.
7. Brechen der Ampulle an der versiegelten Markierung und lösen sich die hochviskose Flüssigkeit durch Zugabe von 10 ml Dichlormethan gegeben. Die Lösung wird in einen Trenntrichter.
8. Bereiten Sie einen Kolben mit 100 ml kaltem Methanol (gekühlt mit Hilfe eines Trockeneis / Aceton-Bad bei einer Temperatur um -78 ° C). Fixiert die Scheidetrichter (Schritt 2.7) auf der Oberseite des Kolbens. Justieren der Öffnung des Trenntrichter, so daß etwa zwei Tropfen alle zwei Sekunden (tropfenweise) fallen.
9. Sammelt den weißen Niederschlag durch Filtration (unter Verwendung eines Papierfilter) und trocknet im Vakuumofen zwischen 50 und 60 ° C.
10. Überwacht den Erfolg der Synthese unter Verwendung der folgenden ¹ H - NMR und FT-IR - Peaks. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl ₃, Δ [ppm]): 5,29-5,03 (m, COC H C H _3), 4,43-4,25 (m, C H Cl), 4,24 bis 4,12 (m, C H ₂ O), 4,11 bis 4,03 (t, J = 4,6 Hz, C H ₂ O), 3,80-3,68 (m, C H C H _2), 3,09-2,64 (breit, s, O H), 2,39 (t, J = 4,5 Hz, α- H), 2,33 (t, J = 5,1 Hz, α- H) und 1,77-1,25 (m, C H _2, C H _3); FT-IR (1 / λ [cm - ^1]): 2932 (s), 2869 (m), 1741 (s), 961 (s), 866, und 735 (m) , ^{6, 27.}
    Hinweis: Um eine hydrophilere 3D LCE vorzubereiten, bereiten ein lineares Blockcopolymer (LBC) anstelle einer SBC, im Anschluss an die Ringöffnungscopolymerisation (ROP) oben beschriebenen Verfahrens.
    1. Zugabe von 0,3 g Polyethylenglykol (PEG), 3,15 g ε-Caprolacton, 1,0 g α-Chlor-ε-Caprolacton und 5,0 g D, L-Lactid auf die silanisierte Fläschchen Mischung.

3. Synthetisches Modifizierung von α-Cl-dreiarmigen SBC zu & alpha; n ₃ -Three Arm SBC _(SBC-3 & alpha; N) (Nach Sharma et al. ⁶⁾

1. In einem Rundkolben überführt und unter Stickstoff, lösen sie 5 g SBC-αCl in 30 ml trockenen N, N - Dimethylformamid.
2. In 0,22 g Natriumazid und lassen über Nacht bei Raumtemperatur reagieren gelassen.
   Vorsicht: Natriumazid ist giftig; Tragen Sie geeignete Schutzkleidung (PPE).
3. Entfernen Sie die N, N - Dimethylformamid unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer bei 11 mbar und 40 ° C verwendet wird . Man löst die Mischung in 30 ml Toluol. Zentrifugierte die Lösung dreimal bei 2.800 xg für 15 min zur Entfernung des gebildeten Salzes. Man dampft das Toluol unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer bei 77 mbar und 40 ° C verwendet wird.
4. Überwachen Sie den Erfolg der Azid - Substitution unter Verwendung von ¹ H - NMR und FT-IR - Peaks.
   HINWEIS: ^{1 H - NMR - Spektrum wurde zu dem übergeordneten SBC-αCl ähnlich, mit Ausnahme des Auftretens eines Peaks bei 3,90 ppm zu der Azidgruppe bezogen; FT-IR (1 / λ [cm -1]): 2.928, 2.108 (s, Azid), 1754 (s), 1,450 (s), 960 (m), 865 (s), 733 (s), und 696 (m).}

4. Synthese von Cholesteryl 5-hexinoat (LC Rest) (Nach Sharma et al. ⁶ und Donaldson et al. ³⁰⁾

1. In einem Rundkolben wird die Mischung 3 g 5-hexinsäure und 130 ml Dichlormethan gegeben. Man kühlt auf 0 ° C mit einem Eisbad.
2. In einem anderen Rundkolben, Mischung 8,28 g N, N' - Dicyclohexylcarbodiimid, 10,3 g Cholesterol und 0,2 g 4-Dimethylaminopyridin.
3. Übertragen der 5-hexinsäure Lösung tropfenweise zu dem Kolben, der die Cholesterol Mischung und Aufrechterhaltung der Endmischung bei 0 ° C für 1 h enthält.
4. Lassen Sie die Mischung über Nacht auf Raumtemperatur erwärmen.
5. Entfernen Sie die resultierende Dicyclohexylharnstoff Niederschlag durch Filtration eine 415 Grad Papierfilter und entsorgen.
6. Man engt das Filtrat unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer bei 850 mbar und 40 ° C verwendet wird. Man löst den gesammelten Rückstand in 150 ml Hexan.
7. Dampfe das Lösungsmittel unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer bei 335 mbar und 40 ° C verwendet wird. In 350 ml Ethanol zu dem öligen Rückstand des Endprodukt zu sammeln. Waschen Sie die weißlicher Feststoff mit Ethanol gebildet und Trocknen des festen Produktes unter Vakuum bei 50 ° C.
8. Überwacht die Synthese der folgenden ¹ H - NMR und FT-IR - Peaks verwenden. ¹ H NMR (400 MHz, _CDCI3, δ [ppm]): 5,39 (d, J = 4,7 Hz, 1H, C H = C), 4,70 bis 4,58 (m, 1H, C H OCO), 2,44 (t, J = 2,5 Hz, 2H, C H ₂ CO), 2,34 (m, 2H, C H ₂ -C H =), 2,31 (m, 2H, C H ₂ CH ₂ -COO), 2,28 (s, 1 H, HC≡C), 2,27 (d, J = 2,3 Hz, 2H, ≡CC H _2), 2,07 bis 1,06 (m, 2H, C H _2, C H), 0,94 (s, 3H, C H _3), 0,89 (d, J = 1,8 Hz, 3H, C H ₃ C H) und 0,88 (d, J = 1,8 Hz, 6H, CH ₃ -C H), 0,67 (s, 3H, C H _3). FT-IR (1 / λ [cm ^-1]): 2,830-2,990 (breit und starker Peak), 2104 (m), 1695 (s), 1428 (m), 1135 (m), 999 (s), 798 (s) und 667 (s).

5. Synthetische Modifizierung von α-N ₃ -Three Arm SBC a-Cholesteryl-dreiarmige SBC (SBC-αCLC) über eine Azid-Alkin Huisgen Cycloadditionsreaktion ( "Klicken" Reaktion) zu erhalten SBC-Chol (Nach Sharma et al. ⁶⁾

1. In einem Rundkolben, auflösen 1 Moläquivalent _SBC-3 & alpha; N (1,5 g) in 100 ml frisch destilliertem Tetrahydrofuran (THF). In 1,2 Mol equivalent von Cholesteryl-5-hexinoat (1,94 g), 0,1 molares Äquivalent Kupfer (I) iodid (0,06 g) und 0,1 Moläquivalent Triethylamin (0,03 g). Man rührt die Mischung über Nacht bei 35 ° C unter Stickstoff zugegeben.
2. Dampfe das Lösungsmittel unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer bei 357 mbar und 40 ° C verwendet wird.
3. Man löst das verbleibende Gemisch in 80 ml Dichlormethan und Zentrifuge für 5 min bei 2800 xg bei Raumtemperatur nicht umgesetzte Materialien und Nebenprodukte zu entfernen.
4. Überwacht die Synthese der folgenden ¹ H - NMR und FT-IR - Peaks verwenden. ¹ H NMR (400 MHz, _CDCI3, δ [ppm]): 7,54 (s, CH = C-Triazol), 5,43 bis 5,34 (m, C = CH - Cholesterin), 5,10-5,06 (m, COCHCH _3), 4,68 -4.55 (m, O-CH - Cholesterin), 4,24-4,19 (m, CH ₂ O), 4,18-4,13 (t, J = 5,0 Hz, CH ₂ O), 4,11 bis 4,05 (t, J = 4,4 Hz, CH ₂ O), 2,47 bis 2,41 (t, J = 4,9 Hz, COCH _2), 2,31-2,25 (m, COCH _2), 2,07-1,02 (m, CH ₂ , CH _3), 1,05-1,03 (s, CH _2, CH _3), 0,96 bis 0,92 (d, J = 3,3 Hz, CH _2, CH _3), 0,91-0,87 (dd, J = 1,9 Hz, J = 1,8 Hz, CH _3), 0,71-0,68 (s, CH _3). FT-IR (1 / λ [cm - ^1]): 3260 (s), 2,920 (s), 1,710 (s), 1460 (s), 1370 (s), 1,240 (m), 1,190 (s), 733 (s) und 668 (s).

6. Synthese von 2,2-Bis (1-Caprolacton-4-yl) propan (Vernetzerklasse, BCP) (Nach Gao et al. ²⁷ und Albertsson et al. ³¹⁾

1. In einem Rundkolben, wird eine Lösung von 10,8 g 2-Bis (4-hydroxycyclohexyl) -propan und 52 ml Essigsäure enthält.
2. Es wird eine Lösung von 11 g Chromtrioxid in 50 ml Essigsäure und 8 ml destilliertes Wasser enthält. Diese Lösung wird tropfenweise zu der Lösung , hergestellt in Schritt 6.1 , während die Mischungstemperatur zwischen 17 und 20 ° C gehalten wird (zB in einemWasserbad); Dieser Vorgang dauert tropfenweise 2 Stunden. Sobald der Prozess abgeschlossen ist, lassen Sie die Lösung für etwa 30 min rühren.
3. In 50 ml 2-Propanol. Rühren Sie die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur.
4. Man engt die dunkelpurpurfarbene Lösung unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer bei 137 mbar und 40 ° C verwendet wird. Hinzufügen von 300 ml destilliertem Wasser auszufällen; der Niederschlag sollte leicht lila sein.
5. Filtrieren das Rohprodukt eine Klasse 415 Papierfilter. Waschen des festen Materials mit ~ 250 ml destilliertem Wasser, oder bis der Feststoff wird weiß.
6. Man löst den Feststoff in 15 ml Benzol bei 40 ° C und läßt es bei 25 ° C rekristallisiert.
7. Hinzufügen 8,34 g trockenen Diketon, gelöst in trockenem Dichlormethan gelöst und eine Lösung, die 6,0 g 3-Chlorperbenzoesäure in 75 ml Dichlormethan in den Kolben gegeben.
8. Rückflußtemperatur der Lösung bei 40 ° C für 24 h.
9. Man kühlt das Reaktionsgemisch auf -20 ° C für 10 min , um den m auszuzufällen Chlorbenzoesäure Nebeneffekt.
10. Entfernen m - Chlorbenzoesäure durch Filtration (unter Verwendung eines Papierfilter) und konzentrieren die Lösung unter vermindertem Druck.
11. Waschen Sie die Viskose Rohprodukt mit 200 ml 2-Heptanon und trocknet den Niederschlag unter Vakuum bei 50 ° C über Nacht.
12. Überwacht die Synthese der folgenden ¹ H - NMR und FT-IR - Peaks verwenden. ¹ H NMR (400 MHz, _CDCI3, δ [ppm]): 4,42-4,37 (dd, J = 14,2, 7,4 Hz, 2H, C H ₂ OC = O), 4,21-4,15 (t, 2H, J = 11,3 Hz, C H ₂ OC = O), 2,80-2,75 (ddt, J = 14,3, 6,5, 1,6 Hz, 2H, C H ₂ COO), 2,63-2,57 (tt, J = 13,3, 2,1 Hz, 2H, C H ₂ COO), 2,04 bis 1,93 (m, 4H, -C H ₂ CH ₂ OC = O), 1,70-1,56 (m, 4H, -C H ₂ CH ₂ COO), 1,48 bis 1,38 (m, 2H, - C H C (CH _{3) 2),} 0,84 (s, 6H, C H ₃ C-).

7. Schaffung von Poröse 3D Scaffold Elastomer Verwendung entweder Hexamethylendiisocyanat (HDI) oder 2,2-Bis (1-Caprolacton-4-yl) propan (BCP) ²⁷ als Vernetzer (Nach Gao et al. ²⁷⁾

1. Bereiten dreiarmige Elastomermischung unter Verwendung von 0,75 g der SBC-αCLC durch Zugabe von 0,25 ml HDI (oder 0,45 ml BCP) und 0,24 ml destilliertes ε-Caprolacton Monomer. In 60 & mgr; l Sn (Oct) _2. Bei Verwendung von BCP anstelle von HDI, mischen SBC-αCLC und BCP einen Wirbel unter Verwendung und sie in einem Ofen bei 140 ° C, bis die BCP vollständig schmilzt und löst sich (dieser Schritt bis 2 h in Anspruch nehmen kann). Sobald der BCP aufgelöst wurde, nehmen Sie es aus dem Ofen und die Sn (Oct) ₂ und Wirbel.
2. Vorbereiten einer „Opfer“ Nickelschaum Vorlage durch ein 1 x 4 cm Metallstück zu schneiden. Rollen sie von einem der kurzen Enden , so daß die Endrolle ist etwa 1 x 1 cm Metallstück (siehe Abbildung 4).
3. Setzen Sie den Nickelschaum in einer Glasfläschchen oder Aluminiumfolienpackung und gießt das Gemisch in Schritt hergestellten 7,1 bis vollständig den Schaum für 2 min abdecken. Entfernen Sie die überschüssige Mischung mit einer Pasteur-Pipette. Lassen Sie es in einem Ofen über Nacht bei 80 ° C.
4. Abziehen der Aluminiumfolie oder brechen das Glas ab. Mit einer Rasierklinge rasiert das Elastomer um den Metallschaum das Nickelmetall zu belichten.
5. Herstellung von 1 M Eisen (III) -chlorid (FeCl ₃₎ Lösung in 100 ml Wasser. Setzen Sie den Schaum in einem Kolben und fügen Sie 70 ml FeCl ₃ -Lösung. Rühren Sie drei Tage bei Raumtemperatur und die jeden Tag _FeCl3 Lösung ändern. Vor jeder Änderung, rühren Sie den Schaum mit ionisiertem Wasser für 0,5 Stunden.
   HINWEIS: Der Ätzprozess typischerweise nach drei Tagen abgeschlossen ist. Um sicherzustellen, dass der Ätzprozess abgeschlossen ist, führen taktile Druckversuche, bis die Schäume weich anfühlen. Schaumbeständigkeit taktile Kompressionstests zeigt das Vorhandensein einer Restmetallschablone.
6. Spülen Sie die elastGomer Schaum mit Ethanol und in einem Vakuumofen über Nacht bei 40 ° C.
7. Charakterisieren der Materialien unter Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (SEM), Differential - Scanning - Kalorimetrie (DSC), mechanische Kompressionstests und thermische gravimetrische Analyse (TGA) ^27.
   HINWEIS: Für ein hydrophilere 3D LCE Vorbereitung, ersetzt den SBC mit LBC (um sicherzustellen, dass das LBC auch eine LC-Einheit enthält) im Anschluss an den in Schritt 7.5 beschriebenen Schritte.

8. Seeding von Elastomer Scaffold mit SH-SY5Y Neuroblastomzellen und Kultur Sterile Techniken

1. Sterilisiert das Elastomer durch sie zweimal mit 1 ml 70% igem Ethanol gewaschen wird. Führen der UV-Bestrahlung für 10 min und Waschen mit 1 ml 70% Ethanol. Spülen Sie sie zweimal mit 1 ml sterilem Wasser und 1 ml phosphatgepufferte Salzlösung (PBS). Legen Sie die Elastomere in 24-Well-Kulturplatten.
2. Bereiten Zellwachstumsmedium für SH-SY5Y, enthaltend 90% Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) NachtrENTED mit 10% fötalen Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep).
3. Nachdem die Zellen Zählen einer Zählkammer unter Verwendung bereiten in 100 & mgr; l Wachstumsmedium suspendiert 1,5 x 10 ⁵ SH-SY5Y - Zellen (Keimlösung). Fügen Sie die Lösung auf der Elastomere, um sicherzustellen, einen Tropfen zu bilden.
4. Inkubiere die gesäten Elastomeren bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 2 h Zelladhäsion zu fördern. In 0,5 ml Wachstumsmedium. Inkubieren wieder bei 37 ° C mit 5% CO _2.
5. Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag, nachdem sie mit 1 ml PBS gewaschen.

9. Die mikroskopische Bildgebung von Elastomer Baukonstruktion

1. Fix die auf Elastomeren mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 15 min gezüchteten Zellen. Spülen mit 3 ml PBS dreimal für jeweils 5 Minuten und legen das Elastomer mit den fixierten Zellen in einer Kulturschale mit einem daran befestigten Deckglas.
   Achtung: PFA ist giftig. Tragen Sie geeignete Schutzkleidung (PPE).
2. Stain den festen Proben mit 0,1% 4' , 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in 500 ul PBS für 10 min und spült zweimal mit 1 ml PBS für 5 min.
3. Unmittelbar Bild der Elastomere Konfokalmikroskopie mit DAPI-Fluoreszenz unter Verwendung Bildstapel Erwerb, der die Probe überspannen.
   HINWEIS: Hier Bildstapeln wurden unter Verwendung eines 20X Ziel erworben und ein 60X Ziel.
4. Analysieren der optischen konfokalen Bildstapel mit ImageJ ^32.

Ergebnisse

Dieser Bericht zeigt die Herstellungsverfahren eines porösen 3D LCE als Gerüst für die Zellkultur einer Nickel-Metall-Vorlage. Der erhaltene 3D LCE zeigt ein Komplex miteinander verbundenes Kanalnetzwerk , das ebenso wie weitere geeigneten Massentransport ²⁷ für eine einfache Zellinfiltration ermöglicht. Es wurde festgestellt, dass die Zellen der Lage sind, in vollem Umfang das miteinander verbundene Kanalnetzwerk eindringen und ebenfalls innerhalb des LCE au...

Diskussion

Flüssigkristalline Elastomere als biokompatible Zellgerüste untersucht aufgrund ihrer Reize Ansprechbarkeit kürzlich. Sie haben sich als ideale Plattformen als Zellgerüste sein. Jedoch ist ein wichtiger Faktor im Auge zu behalten bei der Vorbereitung und ein neues LCE Gerüstes Gestaltung ist Porosität. Die Einarbeitung von auslaugbaren Feststoffen oder Gas ²³ führt nicht immer in homogener Porosität oder vollständig miteinander verbundene Poren. Die Verwendung einer Metallschablone, die ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane	Alfa Aesar	L16606	Silanizing agent
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane	TCI	B0928	Reagent
2-chlorohexanone	Alfa Aesar	A18613	Reagent
2-heptanone	Sigma Aldrich	W254401	Solvent
2-propanol	Sigma Aldrich	278475	Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA	Sigma Aldrich	273031	Reagent
4-dimethylaminopyridine	Alfa Aesar	A13016	Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI	Invitrogen	D1306	Nuclear Stain
5-hexynoic acid	Alfa Aesar	B25132-06	Reagent
Acetic acid	VWR	36289	Solvent
Acetone	Sigma Aldrich	34850	Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade	VWR	71001-866	Reagent
Benzene	Alfa Aesar	AA33290	Solvent
ε-caprolactone	Alfa Aesar	A10299-0E	Reagent
Chloroform	VWR	BDH1109	Solvent
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8503	Reagent
Chromium(VI) oxide	Sigma Aldrich	232653	Reagent
Copper(I) iodide	Strem Chemicals	100211-060	Reagent
D,L-Lactide	Alfa Aesar	L09026	Reagent
Dichloromethane	Sigma Aldrich	320269	Solvent
Diethyl ether	Emd Millipore	EX0190	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME	CORNING Cellgo	10-013	Cell Media
Ethanol	Alfa Aesar	33361	Solvent
Formaldehyde	SIGMA Life Science	F8775	Fixative
Fetal bovine serum, FBS	HyClone	SH30071.01	Media Component
Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe	VWR	28320	Filtration
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Central node (3-arm)
Hexamethylene diisocyanate, HDI	Sigma Aldrich	52649	Crosslinker
Iron(III) chloride	Alfa Aesar	12357	Etching agent
Isopropyl alcohol	VWR	BDH1133	Solvent
Methanol	Alfa Aesar	L13255	Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide	Aldrich	D80002	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Nickel metal template	American Elements	Ni-860	Foam template
Neuroblastomas cells (SH-SY5Y)	ATCC	CRL-2266	Cell line
Penicillin streptomycin	Thermo SCIENTIFIC	15140122	Antibiotics
Polyethylene glycol 2000, PEG	Alfa Aesar	B22181	Reagent
Sodium azide	VWR	97064-646	Reagent
Sodium bicarbonate	AMRESCO	865	Drying salt
Sodium chloride	BDH	BDH9286	Drying salt
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Fisher Scientific	S-374	Drying salt
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma Aldrich	S9638	Drying salt
Sodium sulfate	Sigma Aldrich	239313	Drying salt
Tetrahydrofuran	Alfa Aesar	41819	Solvent
Thiosulfate de sodium	AMRESCO	393	Drying salt
Tin(II) 2-ethylhexanoate	Aldrich	S3252	Reagent
Toluene	Alfa Aesar	22903	Solvent
Triethylamine	Sigma Aldrich	471283	Reagent
Trypsin	HyClone	SH30042.01	Cell Detachment
Olympus FV1000