Protokolle für die Untersuchung die Host-Gewebeverteilung, Transmission-Modus und Effekt auf der Host-Fitness eines Densovirus im Cotton Bollworm

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll der Host-Gewebeverteilung, Übertragungsmodus und Wirkung auf den Wirt Eignung eines densovirus innerhalb Lepidoptera-Spezies zu untersuchen, die Baumwollkapselwurm. Dieses Protokoll kann auch für die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen anderen oral übertragenen Viren und ihren Insekten Wirten verwendet werden.

Zusammenfassung

Viele neue Viren wurden in Tierwirten unter Verwendung der nächsten Generation Sequenzierungstechnologien entdeckt. Zuvor berichteten wir ein mutualistic Virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in einer Lepidoptera - Spezies der Baumwollkapselwurm, Helicoverpa armigera (Hubner). Hier beschreiben wir die Protokolle, die derzeit verwendet werden, um die Wirkung von HaDV2 auf seinem Wirt zu studieren. Erstens haben wir eine HaDV2 freie Baumwollkapselwurm Kolonie aus einem einzigen Zuchtpaar etablieren. Dann wir mündlich einige Neugeborener Larven Nachkommen mit impfen filtrierte Flüssigkeit HaDV2 haltigen zwei Kolonien mit dem gleichen genetischen Hintergrund zu produzieren: ein HaDV2-infiziert ist, der andere nicht infizieren. Ein Protokoll zum Leben Tabellenparameter (zB Larven, Puppen und Erwachsener Zeiten und Fruchtbarkeit) zwischen den HaDV2-infizierten und -uninfected Individuen vergleichen wird ebenfalls vorgestellt, wie die Protokolle sind für die Host-Gewebeverteilung und Übertragungseffizienz von HaDV2 bestimmen. Diese Protokolle WOuld auch geeignet sein, die Wirkung anderer mündlich übertragene Viren auf ihren Insekten Gastgeber, Lepidoptera-Hosts insbesondere zu untersuchen.

Einleitung

In den letzten Jahrzehnten hat sich die Entwicklung der Sequenzierungstechnologie wie Next-Generation - Sequencing (NGS) die Entdeckung vieler neuer DNA und RNA - Viren, vor allem nicht - pathogenen Viren erleichtert, sondern auch neue Isolate von bisher bekannten Viren ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12.} In dem Modellorganismus Drosophila melanogaster, mehr als 20 neue Teilvirusgenomen wurden unter Verwendung von ¹³ metagenomic Techniken nachgewiesen. Viele virale Sequenzen, einschließlich neuer Viren, wurden auch in anderen Insekten, wie Bienen, m identifiziertosquitoes, Asian citrus Psylliden, Libellen und mehrere Lepidoptera - Spezies ^{14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21.}

In Zukunft kann es, dass mehr neue Viren in Insekten entdeckt wird erwartet, dass diese erweiterten Technologien; damit unser Verständnis der Virus-Wirt - Interaktion kann entsprechend ^{6 ändern, 9.} Zum Beispiel sind Virus-Wirt - Interaktionen als komplizierter sein als bisher angenommen, weil viele neue Viren als mutualistic Partner definiert werden , anstatt strenge Erreger ^22. Zum Beispiel induziert der mutualistic densovirus DplDNV in Dysaphis plantaginea den geflügelten Morph und erhöht die Mobilität, die Zerstreuung des Wirtes sowie das Virus ²³ zu erleichtern. Darüber hinaus wurden im Hinblick auf die Säugetier-Gesundheit, die Trockenheit und Kältetoleranz von Pflanzen, und die Auswirkungen von bakteriellen Infektionen ²⁴ mutualistic Viren beschrieben. Seneca Tal - Virus-001 gezeigt selektive Zytotoxizität gegenüber Tumorzellen vermitteln mit neuroendokrinen Krebs ²⁵ kennzeichnet. Hepatitis A - Virusinfektionen unterdrücken die Replikation von Hepatitis C Virus und können bis zur Erholung von Hepatitis - C - ²⁶ führen. Herpes - Virus - Latenz verleiht symbiotischen Schutz vor bakterieller Infektion ^27. Das Hüllglykoprotein von humanen endogenen Retrovirus HERV-W induziert zelluläre Resistenz gegen Milznekrosevirus ^28. Curvularia Thermotoleranz-Virus (CThTV) aus einer Pilz Endophyt ist in der mutualistic Wechselwirkung zwischen diesem Pilze und einem tropischen panic Gras beteiligt"ref> 29. Daher Kenntnis der Wechselwirkungen zwischen den neu gefundenen Viren und ihren Wirten sollten neue Perspektiven auf ihre Biologie und Management generieren. Allerdings sind die neuen Viren, vor allem die versteckten Viren keine offensichtlichen Anzeichen typisch für eine akute Infektion anzeigt, haben selten wurden untersucht, und wir brauchen eine Pipeline und Protokolle, die Auswirkungen der neu gefundenen Viren auf ihren Wirten zu untersuchen.

Bisher haben wir die Prävalenz einen neuen monosense densovirus Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2) in dem Baumwollkapselwurm, Helicoverpa armigera berichteten, und präsentierten Beweise für eine mutualistic Beziehung zwischen HaDV2 und dem Baumwollkapselwurm ^{30, 31.} In diesem Beitrag werden wir das Laborprotokoll zu untersuchen im Detail die Interaktion zwischen HaDV2 und seinen Baumwolleule Host beschreiben. Das Protokoll hier vorgestellten kann auch von großer Bedeutung für Forscher, die r Prüfungole anderer Viren oral übertragen, vor allem in Lepidoptera-Schädlinge.

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Protokoll

1. Aufbau des HaDV2 freien Cotton Bollworm Colony

1. Hintere Baumwolleule Larven (H. armigera) auf einer künstliche Ernährung ³² in einem kontrollierten Wachstumsraum oder eine künstliche Klimakammer bei 25 ± 1 ° C mit 14 h Licht / 10 h Dunkelheit und 60% relativer Luftfeuchtigkeit.
2. Beihilfe einpaarigen Paarung von neu eclosed Motten durch einen Kunststoffkäfig pro Paar unter Verwendung von (10 cm Höhe, 5 cm Durchmesser) mit Baumwollgaze bedeckt guter Belüftung zu gewährleisten und als Eiablage Substrat zu dienen. Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, zur Herstellung einer virenfreien Kolonie zu erhalten, verwendet mindestens 30 Paare von einpaarigen Paarungen. Feed Falter mit einer 10% Zucker und 2% Vitaminlösung ³² getränkt auf einem Wattebausch und täglich aufgefüllt.
3. Als weibliche Erwachsene ihre Eier auf dem Baumwollgaze ca. 2 Tage nach der Paarung legen, täglich die Gaze ändern. Sammeln und Gaze enthält Eier in dem gleichen Wachstumsraum (oder künstliches Klima cham haltenber) als die Falter, bis die Eier schlüpfen.
4. Transfer sofort frisch geschlüpften Larven auf neue 24-Well-Platten, mit einer einzelnen pro Vertiefung.
5. Fünf Tage nach dem ersten Eierlegedatum, sammeln die Eltern Motten und speichern sie in flüssigem Stickstoff.
   HINWEIS: Das Sammeln der Motten 5 Tage nach dem ersten Eierlegedatum wird sichergestellt, dass die Eltern bei der Sammelstelle am Leben sind und daher vermeidet mögliche Auswirkungen der Verwendung von toten Motten auf DNA-Extraktionsgenauigkeit.
6. Isolieren genomischer DNA aus diesen Proben eine DNA Extraction Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
   1. Amplifizieren ein 574 bp-Fragment des Actin-Gens mit Primern, Actin F / Aktin-R (Actin F: 5-CATCTACGAGGGTTACGC-3 und R-Actin: 5-CATCTGTTGGAAGGTGGA-3). Visualisieren der Polymerasekettenreaktion (PCR) Produkte unter Verwendung von Agarose-Gelelektrophorese nach Standardprotokollen; Die erfolgreiche Amplifikation des Actin-Gens stellt sicher, dass die DNA von guter Qualität ist.
   2. beurteilen ter Anwesenheit von HaDV2 in den Muttermotten mittels PCR mit spezifischen Primern: DVVPF (GGATTGGCCTGGGAAATGAC) und DVVPR (CGTTGTTTTTATATCCGAGG) ^31.
7. Sobald ein sauberes Paar identifiziert wurde, hintere Nachkommen aus diesem einzigen HaDV2-nicht infizierte Zuchtpaar für mindestens fünf Generationen und hält dies als HaDV2 freie Kolonie (NONINF-Stamm); die HaDV2-infizierten Kolonie als INF-Stamm definiert.
8. Zur Bestätigung des HaDV2 Infektionsstatus in dem NONINF-Stamm (und die Wirkung von bekannten Bakterien oder Viren auf dem Host - Entwicklung auszuschließen), bewerten den Infektionsstatus für HaDV2, Wolbachia und H. armigera Nucleopolyhedrovirus (HaNPV) in acht zufällig ausgewählten Individuen Larven des NONINF-Stamm unter Verwendung von PCR (mit spezifischen Primern: DVVPF / DVVPR für HaDV2, NPVF / NPVR für HaNPV und 81F / 691R für Wolbachia ^{31, 33).}
   HINWEIS: Es ist bekannt, dass einige Viren spät sein könntennt im infizierten Wirt, mit einem Pegel nicht nachweisbar, auch wenn eine PCR-basierte Technik. NGS-Technologien könnten verwendet werden, um zu bestätigen, dass keine viralen Sequenzen in den genomischen DNA-Proben vorhanden sind.

2. Herstellung von HaDV2 haltigen flüssigen Fluiden

HINWEIS: Wir haben gezeigt , dass die versuchte Reinigung des HaDV2 Viruspartikels ihre Infektiosität und Aktivität hemmt ^31; Daher wird das folgende Protokoll der infektiöse HaDV2 Lösung zu erreichen, durch Filtern der HaDV2-infizierten Personen durchgeführt.

1. Sammeln Falter einzeln und sofort speichern sie in flüssigem Stickstoff.
2. Völlig mahlt die gesammelten einzelnen Motten in flüssigem Stickstoff ein sterilisiertes Mörser und Stößel. Etwa 10 ug Schutt ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen. Übertragen Sie die restlichen Trümmer in ein neues Röhrchen und sofort lagern bei -80 ° C.
3. Extrahieren von DNA aus dem 10 & mgr; g von Schutt, folloFlügel der vom Hersteller bereitgestellten Protokolle. Sobald die moth DNA isoliert worden ist, überprüft HaDV2 unter Verwendung des Protokolls, wie 1.6 in Schritt beschrieben.
4. Gemäß den erhaltenen Ergebnisse in Schritt 2.3, teilt die verbleibenden Trümmer in zwei Gruppen: HaDV2-positive und HaDV2-negativ, je nach ihrer Infektionsstatus. 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na ₂ HPO ₄ und 1,5 mM KH ₂ PO _4; pH 7,5) zu jeder einzelnen vollständig die verbleibende larvalen Schutt zu lösen.
5. Zentrifuge des Homogenat (aus Schritt 2.4) bei 6.500 × g für 15 min bei 4 ° C. Filtern des flüssigen Überstand mit einem 0,22-um-Membranfilter. Sammeln der gefilterten Flüssigkeiten (200 & mgr; l pro Röhrchen) und sofort im Kühlschrank bei -80 ° C.
   HINWEIS: Die 0,22-um-Membranfilter filtert die meisten der unerwünschten Partikel, Bakterien aus und Pilz. Erste Vorkühlung die Zentrifuge auf 4 ° C. Führen Sie alle Protokolle involving den Betrieb der filtrierten Flüssigkeit auf Eis des Homogenats von Bräunung und Koagulieren zu verhindern.

3. Aufbau des HaDV2-infizierten Cotton Bollworm Colony

1. Horizontale Übertragungsfähigkeit von HaDV2
   1. Generieren Sie eine HaDV2 Standardkurve.
      1. Amplifizieren, die Fragmente enthalten Primer (VPF: CTGGTGAGGCGATGGACATG; VPR: TGACAAGATCCAGCGTAGACATC) und Sonde (VP-Sonde: GCCACCACTAGAGGACCCACCAGATG), die für die Quantifizierung von HaDV2 Virus verwendet werden, wobei die de novo-Primern (PF: GGACAATGCTGGTGAGGC; PR: AATCCTCTTTGTCCGTTATCTATG). Verwenden Sie das folgende Programm: 30 s bei 94 ° C, 30 s bei 53 ° C und 60 s bei 72 ° C für 40 Zyklen auf einer PCR - Maschine ^31. 1 & mgr; l genomischer DNA, enthaltend das HaDV2 Genom (Schritt 2,3) zu der 25 & mgr; l PCR-Reaktion als Matrizen-DNA. Klonen der amplifizierten Fragmente in einen Klonierungsvektor nach Protokollen des Herstellers.
      2. Berechnen Sie die KopienzahlPlasmide mit der folgenden Gleichung: Kopien / & mgr; L = (N _A × C) / (n × M × 10 ^9), wobei N _A die Avogadro-Zahl (6,02 × 10 ²³ Moleküle / mol) ist; C ist die Massenkonzentration von Plasmiden (ng / & mgr; l), die Mikrospektrophotometrie gemessen werden kann unter Verwendung von ; n ist die Länge des rekombinanten Plasmids , das das PCR - Produkt (5195 bp) enthält; und M das Molekulargewicht einer durchschnittlichen Basenpaare doppelsträngiger DNA (660 g / mol).
      3. Vorbereiten sechs 10fache Reihenverdünnungen in 1,5 ml - Mikrozentrifugenröhrchen mit Konzentrationen von 1,5 × 10 ⁹ 1,5 × 10 ⁸ 1,5 × 10 ^7, 1,5 × 10 ^6, 1,5 × 10 ⁵ und 1,5 x 10 ⁴ Kopienzahl / ul.
      4. Führen quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) unter Verwendung spezifischer Primer (VPF / VPR) und eine Sonde (VP-Sonde) Zyklus zu erzeugen dreSHOLD (CT) Werte der in Schritt 3.1.1.3 beschriebenen Plasmide. Führen Sie drei unabhängige technische Replikate und durchschnittlich sie für weitere Berechnungen.
      5. Unter Verwendung der obigen Ergebnisse, um eine Standardkurve erzeugen Korrelieren log2-transformierten HaDV2 Konzentrationen auf die zugehörigen gemittelten CT-Werte.
   2. Quantifizieren HaDV2 in den gefilterten flüssigen Fluiden.
      1. Pipettieren eine 100 & mgr; l Testprobe, des gefilterten flüssigen Fluids (Schritt 2.6), enthaltenden HaDV2 zur DNA-Extraktion.
      2. Verwenden Echtzeit-qPCR der CT-Werte für die flüssigen Fluide zu erhalten, und die Kopienzahl zu berechnen, unter Verwendung der Standardkurve in Schritt 3.1.1.
   3. Bestimmen Sie die orale Infektionseffizienz mit HaDV2-infizierten gefilterten Flüssigkeiten unterschiedlicher Konzentrationen.
      1. Verdünne das flüssige Fluid enthält HaDV2 zu den folgenden Konzentrationen: 10 ^8, 10 ^7, 10 ^6, 10 ^5, 10 ^4, 0 und Kopienzahl / & mgr; L.
      2. Verbreiten Sie die künstliche diet gleichmäßig auf ein 9 cm-Durchmesser-Petrischalen vor dem Erstarren. für jede Konzentration filtrierte Flüssigkeit (200 ul) auf der Oberfläche des festen Kunstfutters gleichmäßig HaDV2-enthalten. Tun Sie dies in einer Abzugshaube.
      3. Übertragen Sie 100 frisch geschlüpften Larven in die HaDV2, künstliche Ernährung in einer Petrischale. Klopfen Sie leicht die Baumwollgaze (mit frisch geschlüpften Larven), um die Larven aus der Gaze zu einem weißen Blatt Papier zu übertragen. Schlagen Sie das Papier vorsichtig, so dass die Larven Spin Seide und „Ballon“ aus dem Papier. Verwendung sterilisierte Zange die Seide zu berühren, und die Larven in eine Petrischale zu bewegen.
      4. Nach 48 h, übertragen die Larven auf die künstliche Ernährung zu 24-Well-Platten (eine einzelne pro Vertiefung).
      5. Hinten die mit HaDV2 beimpft Larven bei den oben genannten Konzentrationen zum erwachsenen Stadium.
      6. Sammeln die Falter, die DNA extrahieren, und detektieren HaDV2 PCR verwendet, wie in Schritt 1.5 beschrieben.
         HINWEIS: eine 100% HaDV2 Infektionsrate des Co Hier erhaltentton Kapselwurm der 10 ⁸ Kopienzahl / uL verwendet und somit stellt die HaDV2-infizierten Kolonie (INF-Stamm).
2. Vertikale Übertragungsfähigkeit von HaDV2
   1. Wählen Falter aus den NONINF und INF-Stämme einzelne Paare von ♀- / ♂-, erzeugen ♀ + / ♂-, ♀- / ♂ und ♀ + + / + ♂ (+: positiv für HaDV2 Infektion; -: negativ HaDV2 Infektion).
   2. Übertragen der Nachkommen aus den oben genannten Paaren virusfreien 24-Well-Platten; hinten die Larven in den dritten Häutungsstadium.
   3. Extrahieren der DNA aus den gesammelten dritten Larvenstadium als Matrize zu verwenden, um die Anwesenheit von HaDV2, um zu bestimmen, wie in Schritt 1.5 beschrieben.

4. Gewebeverteilung von HaDV2

1. Um eine Kontamination durch Viren und Bakterien zu verhindern, Sterilisieren der Zange und Schere in 75% -igem Ethanol drei Mal und dann in der Flamme eines Alkohols Lampe aufzuheizen.
   HINWEIS: Pinzetten sterilization ist notwendig, wenn Verschmutzung auftritt.
2. Unter Verwendung einer Analysenwaage wiegen die leeren Rohre, die verwendet werden sollen, um die Gewebe zu speichern.
3. Legen Sie die Larven und adulten Motten aus dem INF-Stamm auf Eis für etwa 5 min.
4. Sezieren die folgenden Gewebe unter einem Stereomikroskop in Larven, erwachsenen Weibchen und Männchen in einem sauberen Petrischale mit PBS-Puffer.
   1. Für Larven, pipet Hämolymphe und seziert die Vorder-, Mittel-, Enddarm, Fettkörper und Malpighischen Gefäße (Abbildung 1A). überträgt sofort jedes Gewebe in die Röhrchen in flüssigem Stickstoff.
      1. Fixiert die gefrorenen Larven auf cystosepiment mit zwei Insektenstiften (200 & mgr; m im Durchmesser, 20 mm in der Länge), Einsetzen in die intersegmentalen Membranen in der Nähe des Kopfes und der Bauch letztes Segment (1A).
      2. Schneiden Sie die proleg im hinteren Bauchraum der Larven, so dass die Larven Hämolymphe ausströmt. Pipette, um die Larven Hämolymphe innerhalb von 10 s eine microP mitipette Bräunung und Koagulieren der Hämolymphe zu verhindern.
         HINWEIS: Phenylthioharnstoff (50 ug / ml) kann bei 1:20 Vol / Vol-Verhältnis mit Hämolymphe gemischt wird Melanisierung zu verhindern.
      3. Unter Verwendung einer Schere, einen Einschnitt in die Kutikula machen von der letzten intersegmentalen Membran zum Kopf hin. Sezieren alle verbleibenden Gewebe unter einem Stereomikroskop mit zwei Zangen; das Bild für jedes Gewebe wird in 1A gezeigt.
      4. Mischen Sie Gewebeproben aus drei Personen zusammen als eine Replikation.
      5. Um die Verunreinigung der übrigen Gewebe mit der Hämolymphe während der Präparation zu verhindern, wasche die sezierten Gewebe in PBS dreimal puffern. Dann testen Sie den HaDV2-Infektion Status des zum Waschen verwendeten PBS. Wenn der letzte Waschpuffer HaDV2 frei ist, sollte das Gewebe vor einer Kontamination mit Hämolymphe sauber sein.
   2. Für erwachsene Frauen, sezieren den Kopf (Gehirn), Muskeln, Fett-Körper, gut, Malpighischen Gefäße und Ovar (1B) unter einem Stereomikroskop in PBS - Puffer. Für erwachsene Männer, sezieren den Kopf (Gehirn), Muskeln, Fett-Körper, gut, Malpighischen Gefäße und Hoden (1C) unter einem Stereomikroskop in PBS - Puffer. überträgt sofort jedes Gewebe in die Röhrchen in flüssigem Stickstoff.
      1. Mit einer Pinzette und Schere, entfernen Sie die Flügel des Falters und waschen Sie die verbleibende Körper dreimal an die Waage zu löschen.
      2. Trennt den Kopf, Brust, Bauch und Schere.
      3. Entfernen Sie die endoskeleton des Thorax und den Muskel sammeln.
      4. Mit einer Pinzette, entfernen die Kutikula des Bauches und seziert die anderen Gewebe folgenden Figuren 1B und 1C.
      5. Mischen Sie die Gewebeproben aus drei Personen zusammen als eine Replikation. Waschen Sie die sezierten Gewebe in PBS dreimal puffern.
5. Wiegen Sie die Rohre und die oben genannten Gewebe, wenn sie eingefroren sind und dafür sorgen, dass der mEsel von den verschiedenen Geweben sind fast gleich.
   Masse (Gewebe) = Masse (Röhren / Gewebeprobe) - Masse (Rohr nur)
6. Extrahieren der DNA aus diesen Geweben und führen qPCR, wie es in Schritt 3.1.2 beschrieben.
7. Berechnen der Kopienzahl pro mg jeder der Standardkurve in Schritt erzeugt wird unter Verwendung von Gewebe 3.1.1. Verwenden des Virustiters pro Masseneinheit für die Probenspannung von jedem Unterschied in der Menge an Gewebe verwendet für die DNA-Extraktion verursacht zu korrigieren.
8. Berechnen des Prozentsatzes der HaDV2 in dem spezifischen Gewebe wie folgt: Anzahl von für jedes Gewebe HaDV2 = HaDV2 Kopienzahl pro mg getesteten Gewebe / (Summe der Kopienzahl pro mg aller Gewebe).

5. Biotests Testen der Wirkung von HaDV2 auf Host-Entwicklung

1. Ort mindestens 100 Puppen oder frisch geschlüpfte Falter abgeleitet von dem NONINF-Stamm in einem Baumwoll-Gaze ​​bedeckte, 5-L, Drahtgitterkäfig. Nach 2 Tagen beginnen verpaart erwachsene Weibchen Eier auf dem Baumwollgewebe zu legen. Sammeln und pflegendie Baumwollgaze, die Eier enthalten; Die Eier werden in etwa drei Tagen schlüpfen.
2. Beimpfung des Neugeborenen Larven mit HaDV2.
   1. Übertragen Sie die Neugeborenen Larven des NONINF-Stammes zur künstlichen Ernährung mit HaDV2 (10 ⁸ Kopienzahl / ul) , um den INF-Stamm zu etablieren.
   2. In ähnlicher Weise überträgt neonate Larven zur künstlichen Ernährung bedeckt mit HaDV2 frei filtrierte Flüssigkeit (Schritt 2.4), um die Kontrollgruppen (NONINF-Stamm) zu etablieren. Umfasst mindestens 240 Larven in jeder Behandlung (2A).
      HINWEIS: Die Larven, die die NONINF- und INF-Stämme verwendet werden, zu konstruieren, wird aus derselben Mutter Kohorte und Luken zugleich abgeleitet ist, den gleichen genetischen Hintergrund zu gewährleisten. Stellen Sie sicher, dass die NONINF- und INF-Stämme in derselben Klimakammer (bei 25 ± 1 ° C mit 14 h Licht / 10 h Dunkelheit und 60% relative Luftfeuchtigkeit) für eine synchrone Geschwindigkeit der Entwicklung gehalten werden; Die Geschwindigkeit kann in Abhängigkeit von Temperatur und Feuchtigkeit variiert. Behandeln Sie die delicsanft aß Larven.
3. Nach 48 h, übertragen die Larven einzeln auf 24-Well - Platten (eine einzelne pro Vertiefung) (2B).
   1. Sequenziell Anzahl jeder Larve in jeder Vertiefung und die instar Bühne und das Überleben Status täglich aufzuzeichnen.
   2. Etwa 5 Tage später, als die künstliche Ernährung verschlechtert, überträgt gleichzeitig diese Personen zu einer neuen 24-Well - Platte mit frischer künstlicher Ernährung (2C).
   3. Wiegen Sie die Larven von Tag 7 bis 11 nach dem Schlüpfen einer Analysenwaage mit einer Genauigkeit von 0,0001 g verwendet wird. Einzeln gibt die Larven an die 24-Well-Platte nach dem Wiegen.
4. Nach der Häutung zu dem fünften Instar nach dem vierten ecdysis (etwa zehn Tage nach dem Schlüpfen), übertragen die Larven Glasröhren (10 cm Höhe, Durchmesser 2 cm) (2D); fünftes Larvenstadium kann auch durch die Breite der Kopfkapsel (etwa 2,6 mm), identifiziert werden.
   HINWEIS: Übertragen Sie die Personenauf das Glasrohr jeden Tag zur gleichen Zeit.
   1. Code jede Larve mit seinen ursprünglichen Referenznummer auf dem Rohrglas mit Farbe oder Marker. Notieren Sie sich den Larvenstatus täglich; in den Glasröhren, werden die Larven Verpuppung nach etwa fünf Tagen-Stadium der Puppen etwa 11 Tage dauert.
   2. Notieren Sie sich die Puppen und das Schlüpfen Datum für jeden einzelnen in der Glasröhre. Notieren Sie sich die Masse von 3 Tage alten Puppen.
5. Nach dem Schlüpfen, legte eine weibliche und eine männlichen in einen einzigen Käfig mit 10% Saccharose und 2% Vitaminlösung (Abbildung 2E). Füllt die jeden Tag Saccharoselösung. Notieren Sie sich den Zeitpunkt des Todes für jede Motte.
6. Wenn Eier gelegt werden, ändern sich täglich die Baumwollgaze. Zähle die Anzahl der Eier sofort. Graf frisch geschlüpften Nachwuchs, während sie schlüpfen.
7. Während der Biotests, wählen Sie zufällig acht Personen für jede Behandlung des Infektionsstatus von HaDV2 zu bestätigen. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA dieser Proben unter Verwendung handelsüblicher Trypsin-Reagensgemäß dem Protokoll des Herstellers. Synthese der cDNA des ersten Stranges nach dem Protokoll des Herstellers und verwenden Sie es als Vorlage zu testen, ob die Viren erfolgreich transkribiert werden.

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Ergebnisse

Nachkommen von den Eltern , die HaDV2 frei (3A) waren , wurden als NONINF-Dehnungs aufgezogen. Wir amplifizierten erfolgreich die Actin - Gen der gleichen DNA - Vorlagen verwendet wird , was darauf hindeutet , dass die DNA - Matrizen waren von guter Qualität (3B). Darüber hinaus waren die zufällig ausgewählten acht Nachkommen auch frei von HaDV2 (3C), HaNPV (3D) und Wolbachia (3E). ...

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Diskussion

In den letzten Jahrzehnten sind die meisten Studien über Insekten-Virus - Interaktionen auf die Gesundheit Honigbiene ³⁴ konzentriert ^{haben, 35, 36,} Vektoren der Krankheit beim Menschen ^37, Viren Anlage ^38, und einige insektenpathogenen Viren , die ein großes Potenzial haben als biologische Bekämpfungsmittel ^39. Wenig Aufmerksamkeit wurde auf verdeckte V...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plate	Corning	07-200-740	Multiple suppliers available.
DNA extraction kit	TIANGEN	DP304-03	Multiple suppliers available.
thermal cycler	Veriti; Applied Biosystems	4375786
PBS	Corning	21-040-CV
0.22 µm membrane filter	Millipore	SLGS025NB
pEASY-T Cloning Vector	TransGen, Beijing, China	CT301-02
Tweezers	IDEAL-TEK	2.SA
Premix Ex Taq (Probe qPCR)	Takara	RR390A
Probes	Invitrogen	Custom order
Primers	Invitrogen	Custom order
microspectrophotometry NanoDrop 2000c	Thermo scientific	not available
7500 Real-Time PCR system	Applied Biosystems	not available
stereomicroscope SZX-16	Olympus	not available
sucrose			Multiple suppliers available.
vitamin complex			Multiple suppliers available.