Ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Protein in mCD1d Insektenzellen.

Zusammenfassung

Eine Methode, um Insektenzellen vorzubereiten und infizieren sie mit Baculovirus für die Zwecke der Produktion von rekombinanten mCD1d proteinand Erzeugung mCD1d Tetramere.

Zusammenfassung

CD1-Proteine ​​bilden eine dritte Klasse von Antigen-präsentierenden Molekülen. Sie sind Zelloberfläche Glykoproteine, wie etwa 50-kDa glykosylierten schweren Ketten, die kovalent mit beta2-Mikroglobulin assoziiert sind Ausdruck. Sie binden Lipide als Peptide. Obwohl die Struktur bestätigt die Ähnlichkeit der CD1-Proteine ​​auf MHC Klasse I und Klasse II Antigen-präsentierenden Molekülen ist die mCD1d Nut relativ schmal, tief und stark hydrophob und hat zwei Bindungstaschen statt der mehrere flache Taschen für die klassische beschriebenen MHC- kodierte Antigen-präsentierenden Molekülen. Basierend auf ihren Aminosäuresequenzen, bietet eine solche hydrobphobic Nut ein ideales Umfeld für die Bindung von Lipid-Antigene.

Die Natural Killer T (NKT-Zellen) nutzen ihre TCR an Glykolipide gebunden oder presented by CD1d erkennen. Reaktive T-Zellen, Lipide zu CD1 präsentiert haben in den Schutz gegen Autoimmun-und Infektionskrankheiten sowie in Tumorabstoßung beteiligt. So ist die Fähigkeit zu erkennen, zu reinigen, und verfolgen Sie die Reaktion der CD1-reaktiven NKT Zellen von großer Bedeutung. Die Erzeugung von Tetrameren von alpha Galactosylceramid (a-GalCer) mit CD1d hat einen tiefen Einblick in die Biologie von NKT-Zellen. Tetramere aus anderen CD1-Moleküle konstruiert wurden ebenfalls erzeugt und diese neue Reagenzien haben stark das Wissen um die Funktionen von Lipid-reaktiven T-Zellen erweitert, mit potenziellen Einsatz bei der Überwachung der Reaktion auf Lipid-basierte Impfstoffe und in der Diagnostik von Autoimmunerkrankungen und andere Behandlungen.

Protokoll

I. auftauen Cells

Nehmen Sie das Gefriergut Fläschchen TN5-Zellen und Auftauen in einem 37 ° C Wasserbad. Fügen Sie 5ml von Insekten Express-Medium (Invitrogen, Katalog-Nummer-10486) in 25cm ² TC Kolben. Beachten Sie, dass Express fünf, ohne Glutamin kommt; müssen 10ml 100X Glutamin Stift Strep oder Glutamin allein zu 1 lt Medien hinzufügen. Add TN5 Zellen hinein und inkubieren für 30 Minuten in ein 27 ° C Inkubator. Dann saugen das Medium mit DMSO vorsichtig, ohne die Zellen an der Unterseite der Flasche. Add 5 ml frisches Medium.

II. Anbau und Ausbau der Zellen

Überwachen Sie die Zellen jeden Tag. Wenn Kolben fast 70% konfluent ist, bringen die Zellen in Suspension durch Klopfen der Flasche auf beiden Seiten und den Transfer der Zellen bis 175cm ² Flasche, indem 21 ml des Insect ausdrückliche mittel-und 5 ml Zellkultur. Jeder T175 Flasche sollte etwa 25-30ml Medium als ein Endvolumen haben. Split konfluenten Flasche (ca. 1 Mio. / ml konz.) 4.1 oder 5.1, wie gebraucht. Lassen Sie sich nicht Zellen überwuchern. Zählen Sie die Anzahl der Durchgänge, dass Sie die Zellen aufgeteilt. Nicht über Durchgang Nummer 30 wachsen, weil sie dazu führen können Alterung der Zellen, die Zell-Lyse. Wenn Sie die gewünschte Lautstärke erreicht bei einer Konzentration von 1 Mio / ml, infizieren die Zellen.

I in der Regel werden bis zu 2 bis 2,5 Liter, die in der Regel Beträge bis siebzig 175cm ² Flaschen und ca.. 25 bis 30 ml / Kolben oder fünf 1-Liter-Erlenmeyerkolben und ca.. 400ml und 500 ml in jeder Flasche

Hinweis: Sie können entweder Zellen in T-175 Kegeldichtung Kolben oder Corning Erlenmeyerkolben wachsen. Wachsende Zellen in Erlenmeyerkolben ist schneller und einfacher.

III. Titrierung der Virus durch End Point Dilution Method

1. Platte 3000-5000 Zellen pro Well in Flachboden 96 well Platte in 200 &mgr; l der Express fünf SFM Medium. Lassen Sie die Zellen bei 27 ° C für mindestens 30 Minuten absetzen.
2. Machen Verdünnungsreihe Baculovirus Lager. Man sollte 1 / 10 Verdünnung in einer Linie von 96-Well-U Bodenplatte zu tun, mit 250ul pro Vertiefung. Verdünnungen sind in Express Five SFM-Medium hergestellt.
3. Mit einer Mehrkanal-Pipette einen festen Betrag (meist 20 ul) aus verschiedenen Verdünnungen in die Zellen.
4. Kultur bei 27 ° C für 7 Tage. Um die Verdunstung von der Kante Reihen, wickeln Sie die Kanten der Platte mit Parafilm.
5. Nach 7 Tagen, überprüfen Sie die Platte und bestimmen, welche Verdünnung des Virus erhält eine 50%-Infektion - die Hälfte der Brunnen an dieser Viruskonzentration infiziert sind). Dann nutzen Sie eine Formel, um den Titer, die in pfu / ml (pfu-Plaque-bildenden Einheiten) ausgedrückt ist zu berechnen. Die Formel ist in den meisten Baculovirus Handbüchern.

IV. Infektion der Zellen

Es ist sehr wichtig, die genaue Titer der Viren wissen. Fügen Sie benötigte Menge an Virus. Bei viralen Stoffaufbereitung der Zellen sollte bei Multiplizität der Infektion (MOI) von nicht mehr als 1 (1pfu to Five Zelle 1High) Höhere MOI führt zur Produktion von Virus-Mutationen infiziert werden. Für Protein-Produktion, ist übliche Menge MO1 5-10.

Beispiel:

Der Titer mCD1d Baculovirus = 1X108 pfu / ml

Add MOI = 1 (um den Virus zu verstärken) = 20X10 ^ 6 Zellen / Kolben / 1x10 ^ 8 pfu / ml = 200 ul / Kolben

MOI = 5 bis 10 (für die Protein-Produktion) = 1 ml bis 2 ml Für 20x10 ^ 6 Zellen / Kolben

Am Tag 4 nach der Infektion bei den infizierten Zellen zu suchen. Sie sollten gelöst werden, schwimmende, geschwollen und bilden Würstchen.

V. Wiederherstellen Überstände

Nehmen Sie das Medium von infizierten Kolben, und Transfer zum 250ml blaue Kappe Falcon Spinning-Flaschen. Sie können autoklaviert und wiederverwendet werden. Füllen Sie die Flaschen gleichmäßig und Zentrifuge die Zellen in Sorvall GSA Rotor bei 200rpm, 20 Minuten, 4 ° C. Sammeln Sie den Überstand und fahren zur weiteren Reinigung.

VI. Reinigung von rekombinantem mCD1d

1. Dialyse und Konzentration in 150 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,4)
2. Mit Ni-NTA Agarose-Chromatographie eluieren Protein mCD1d + b2m mit 150mm Natriumphosphat +200 mm Immidazole
3. Run Entsalzungssäule mit 20 mM Tris-HCl-Puffer pH 8 loswerden Immidazole
4. Run Anionenaustauschchromatographie mit MonoQ Spalte, um die restlichen Verunreinigungen zu beseitigen.
5. Konzentrieren Sie sich auf 1mg/ml mit YM 30-Konzentrator (Millipore)
   
6. BirA enzymatische biotynlation von mCD1d nach dem Protokoll des Herstellers (Avidität)
   
7. Das freie Biotin wird durch S200-Säule (Size Exclusion Chromatograpy) mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 eliminiert. Ein Durchschnitt von 2 bis 3 mg des biotynlated Protein könnte aus 2 Liter Überstand erhalten
8. Herstellung von a-GalCer CD1d Tetramer.

Um CD1d Molekül mit a-GalCer Last, lösliche biotynlated CD1d-b2m wird über Nacht bei Raumtemperatur mit drei fachen molaren Überschuss an a-GalCer, in 0,5% zwischen -20 in PBS,% o, 9 Natriumchlorid aufgelöst inkubiert. Streptavidin und Inkubation für 4 Stunden bei Raumtemperatur - Tetramere werden durch Mischen von a-GalCer geladen CD1d Monomeren mit 4-fach molaren Überschuss von PE erzeugt. Lagerung bei 48 ° C.

Diskussion

In diesem Verfahren wird gezeigt, wie zu initiieren, zu wachsen, zu infizieren Insektenzellen und wie die Baculovirus Verwendung dieser Zellen Titer. Die wichtigsten Aspekte dieses Verfahrens sind Wartung von Zellen und die genaue Titer von Baculovirus wissen. Sobald Sie CD1 Tetramere erzeugt wird, kann sie als ein mächtiges Werkzeug zur Analyse von Glycolipid reaktiven T-Zellen verwendet werden. Baculovirus-Systeme sind ebenfalls weit verbreitet, rekombinante Proteine, darunter MHC-Klasse-II-Tetramere so dieses Verfahren hat eine viel bre...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Express Five SFM	Serum Free Medium	Invitrogen	10486025
High Five TM	Insect Cells	Invitrogen	B855-02
Glutamine Pen strep	Antibiotics	Invitrogen	10378-016
25cm2 TC Flask	Plastic	Fisher Scientific	10-126-28
175 cm2 TC Flask	Plug seal flask	Fisher Scientific	10-126-8
Erlenmeyer Flask	Cell Culture Flask	Fisher Scientific	07 200 672
YM 30 Concenterator	30,000 MWCO	EMD Millipore	UFC 903096
FPLC equipment		GE Healthcare
BrA Enzyme and Buffer	Biotinylation Kit	Avidity	BIRA500
Ni-NTA Agarose Column	His Tag Protein Purification Column	GE Healthcare
Desalting column	To get Rod of Salt from Protein	GE Healthcare
MonoQ Column	Anion Exchange Chromatgraphy	GE Healthcare
S200 Column	Size Exclusion Chromatography	GE Healthcare
alpha-Galcer	Glycolipid
PE- Streptavidin	For conjugating Protein	Molecular Probes, Life Technologies	S-866