Eine neuartige Methode zur Modellierung chronisch traumatischer Enzephalopathie in<em&gt; Drosophila</em

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir einen neuen Ansatz, um in Drosophila melanogaster eine geschlossene traumatische Hirnverletzung zuzufügen. Unsere Methode hat den Vorteil, direkt wiederkehrende Stöße mit einstellbarer Kraft auf den Kopf allein zu liefern. Eine weitere Erforschung des wirbellosen Systems wird dazu beitragen, die Pathogenese der chronischen traumatischen Enzephalopathie zu erhellen.

Zusammenfassung

Chronische traumatische Enzephalopathie (CTE) ist eine etablierte neurodegenerative Erkrankung, die eng mit der Exposition gegenüber repetitiver milder Traumatischer Hirnverletzung (mTBI) assoziiert ist. Die Mechanismen, die für ihre komplexen pathologischen Veränderungen verantwortlich sind, bleiben trotz eines kürzlichen Konsenses, um die neuropathologischen Kriterien zu definieren, weitgehend schwer. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, um ein Modell des CTE in Drosophila melanogaster ( Drosophila ) zu entwickeln, um die Schlüsselgene und Wege zu identifizieren, die zu der charakteristischen hyperphosphorylierten Tauakkumulation und dem neuronalen Tod im Gehirn führen. Einstellbare Festigkeitsstöße, um eine leichte, verletzte Verletzung zuzufügen, werden direkt an den Fliegenkopf abgegeben, wobei der Kopf einer schnellen Beschleunigung und Verzögerung ausgesetzt wird. Unsere Methode eliminiert die potenziellen Probleme, die mit anderen Drosophila- MTBI-Modellen verbunden sind ( zB kann der Todesfall durch Schäden verursacht werdenAndere Körperteile oder innere Organe). Die weniger arbeits- und kostenintensive Tierpflege, die kurze Lebensdauer und umfangreiche genetische Werkzeuge machen die Fruchtfliegen ideal, um die CTE-Pathogenese zu untersuchen und es möglich zu machen, großflächige, genomweit vorwärts genetische und pharmakologische Bildschirme durchzuführen. Wir gehen davon aus, dass die laufende Charakterisierung des Modells wichtige mechanistische Erkenntnisse über Krankheitsverhütung und therapeutische Ansätze generieren wird.

Einleitung

Chronische Traumatische Enzephalopathie (CTE) wurde vor kurzem als eine deutliche neurodegenerative Erkrankung, getrennt von anderen Tauopathien wie Alzheimer-Krankheit ¹ erkannt. Im Gegensatz zu Alzheimer-Krankheit und anderen üblichen Tauopathien, deren wichtigste Risikofaktoren das Alter und eine Familiengeschichte der Demenz vorantreiben, bedeutet CTE, wie durch seinen Namen angedeutet, eine enge Verbindung mit einer Geschichte des Hirntraumas, die höchstwahrscheinlich bei Sportsportlern, Wie Boxer und Fußballspieler, sowie in Militärveteranen ^{2 , 3 , 4 , 5} . Es wird angenommen, dass sie durch wiederholte, konkurrierende und unerschütterliche Schläge zum Kopf initiiert wird. Patienten können Symptome und Anzeichen wie kognitive Defizite, Stimmungs- und Verhaltensänderungen und Bewegungsdysfunktion darstellen, die sich mit der Alzheimer-Krankheit signifikant überschneiden, frontotemporalDemenz, Lewy-Körper-Demenz und Parkinson-Krankheit ⁶ . Im Gegensatz dazu zeigen post-mortem-Untersuchungen des Hirngewebes ein deutliches Muster der hyperphosphorylierten Tau-Akkumulation, die kleine Blutgefäße in den Tiefen der kortikalen Sulci umgibt, ein pathognomonisches Merkmal, das bei den anderen degenerativen Zuständen nicht beobachtet wurde ⁷ . Allerdings ist bislang wenig über die Pathogenese bekannt, die zu einer Manifestation der Krankheit führt. Dies ist zum großen Teil auf das Fehlen eines treuen Tiermodells zurückzuführen - erst vor kurzem wurden Nagetiermodelle erzeugt ^{5 , 8} . Diese Modellorganismen haben die Nachteile einer kostenintensiven Versorgung und einer relativ langen Lebensdauer, die sich nicht für neurodegenerative Krankheitsstudien eignen.

Im Vergleich zu Säugetier-Pendants sind wirbellose Tiere wie Drosophila eine hervorragende Alternative mit ihrer kostengünstigen Instandhaltung,Umfangreiche Werkzeuge zum Sezieren von genetischen Determinanten und relativ kurzer Lebensdauer ⁹ . Bemerkenswert ist, dass fliege und menschliche Gehirne evolutionär konservierte molekulare und zelluläre Wege sowie anatomische Ähnlichkeiten ^{10 , 11 , 12} teilen. Zwei geniale Drosophila- Modelle zur Untersuchung traumatischen Hirnverletzungen wurden bisher ^{13 , 14} gemeldet. Das erste von Katzenberger und Kollegen entworfene "High Impact Trauma" (HIT) -Gerät enthielt frei bewegende Fliegen in einer Plastikfläschchen, die an das freie Ende einer Metallfeder ^{13 , 15} gebunden war. Als die Plastikfläschchen aufrecht und freigegeben wurde, schlug sie ein Polyurethan-Pad und verlieh den Fliegen ein Trauma, als sie auf die Fläschchenwand prallten und sich erholten. Im Gegensatz dazu haben Barekat und Kollegen eine andere Auslieferungsmethode entworfenDie Omni Perle Ruptor-24 Homogenisatorplattform ¹⁴ . Fliegen wurden mit CO ₂ unfähig und in ein 2 mL Schraubverschlussrohr gegeben, das an dem Homogenisator befestigt war und vorprogrammierten Schüttelbedingungen unterworfen wurde. Ein Vorteil der Verwendung des Gewebe-Homogenisatorsystems ist, dass der Experimentator die Intensität der Verletzung, die Dauer der Verletzung und die Anzahl der Verletzungskämpfe modulieren könnte. Allerdings leiden beide Regime den gleichen Nachteil: Primäre Verletzungen des Kopfes werden zufällig in Bezug auf die Auswirkungen Lage und Stärke zugefügt. Darüber hinaus führten beide Methoden zu einer beträchtlichen Mortalität, die durch unvermeidliche Kollateralschäden an anderen Körperteilen und inneren Organen verursacht wurde. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, um mTBI in Fruchtfliegen zu induzieren. Unser Gerät besteht aus einem gasbetriebenen ballistischen Impaktor. Im Vergleich zu den bestehenden Drosophila Modellen ^{14 , 15} hat unsere Methode den einzigartigen Vorteil, Messungen zu liefernDie nur auf den frei beweglichen Fliegenkopf gerichtet ist, so dass die genaue Steuerung verschiedener Faktoren, wie zB Einflussschwere, das Zeitintervall zwischen den Auswirkungen und die Gesamtzahl der anhaltenden Auswirkungen ermöglicht wird.

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Protokoll

1. Montage des Schlaggerätes ( Bild 1 )

1. Den Kolben aus einer 1 ml Tuberkulinspritze entfernen. Schneiden Sie das Fass auf die 1-ml-Marke.
2. Eine Aerosolbarriere (3 mm Höhe x 4 mm Durchmesser) von einer 200 μl Pipettenspitze entfernen und als Impaktor verwenden. Legen Sie den Impaktor in den Spritzenzylinder. Ziehen Sie vorsichtig den Fass, um den Schlagkörper zum Spitzenende zu bewegen, wobei die flache Seite die Düsenöffnung bedeckt.
3. Befestigen Sie das Fassspitzenende an Kunststoffschlauch, das mit dem Kohlendioxid (CO ₂ ) Durchflussregler einer Drosophila Anästhesiestation verbunden ist.
4. Halten Sie den Fass senkrecht und klemmen Sie ihn an einen Standard-Klemmhalterständer, so dass der Impaktor am Boden des Fasses bleibt.
5. Ändern Sie eine 200 μl Pipettenspitze, um den Fliegenhalter zu machen.
   1. Schneiden Sie 4 mm von der Spitze, um eine Öffnung von 0,8 mm Durchmesser zu machen, so dass nur der Fliegenkopf ausgesetzt werden kann.
      HINWEIS: Das thoRax und alle anderen Teile des Fliegenkörpers bleiben in der Pipettenspitze.
6. Ändern Sie eine 1.000 μl Pipettenspitze und eine 1 mL Spritzen-Nadelkappe, um den Stecker herzustellen.
   1. 44 mm von der Spitze der Spitze abschneiden. Nehmen Sie eine 6 mm Länge einer 1 mL Spritzen-Nadelkappe und schieben Sie sie fest in das verbleibende Segment der 1.000 μl Pipettenspitze.

2. Bedienung des Schlaggerätes

1. Anästhesieren Sie eine einzelne 2-tägige erwachsene weibliche Fliege mit CO ₂ auf einem Fliegenkissen.
2. Vorsichtig mit einem feinen Pinsel auf den Fliegenhalter übertragen. Tippen Sie sanft auf den Halter, damit der Fliegenkopf außerhalb des Spitzenendes gesehen wird. Wenn der Fliegen-Rüssel außerhalb der Spitze ausgesetzt ist, stecken Sie ihn vorsichtig mit einer abgestumpelten 1-ml-Spritzenadel in die Spitze.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, den Fliegen-Rüssel in der Halterung zu halten. Andernfalls kann die Fliege an einer saugenden Rüsselverletzung sterben.
3. Ziehen Sie die Fliege hochMit dem Stecker auf den Spritzenzylinder auftragen, damit der Fliegenkopf nach unten zeigt.
4. Den Gasdruck auf 100 kPa einstellen. Stellen Sie den Durchfluss entsprechend dem Experimentdesign ein.
5. Schalten Sie den Durchflussregler schnell ein und aus, so dass der Impaktor einmal auf den Fliegenkopf schlägt.
6. Heben Sie den Fliegenhalter an und bewegen Sie ihn über ein Fliegenkissen. Den Fliegenhalter umkehren und vorsichtig an die Seite klopfen Lassen Sie die Fliege in einer leeren Ampulle, um sich zu erholen.

3. Video-unterstützte Bewegungsverfolgung

1. Füllen Sie eine Petrischale mit 6 cm Durchmesser mit transparentem Silikon-Elastomer, um die Tracking-Arena zu machen. Lassen Sie einen Abstand von 3 mm zwischen dem Silizium und dem Tellerdeckel, damit die Fliegen frei laufen können, aber nicht fliegen.
2. Anästhesieren Sie vier Fliegen aus dem Schein oder der behandelten Gruppe jedes Mal und legen Sie sie in die Arena. Lassen Sie die Fliegen bei 22 ° C für 1 h.
3. Positionieren Sie eine Charge-Coupled Device (CCD) Kamera über den Arenen und notieren Sie für 5 min.
4. Analysieren Sie die aufgezeichneten Bewegungsbahnen mit Ctrax-Software (frei verfügbar bei Caltech) ¹⁶ . Exportieren Sie die verfolgten Daten in einer Programmiersprache (zB Matlab) -kompatibles Format und analysieren Sie die Daten auf der Grundlage der zurückgelegten Strecke pro Rahmen ¹⁷ . Berechnen Sie die mittlere Wanderung für jede Fliege und kombinieren Sie sie mit allen anderen aufgezeichneten Fliegen / Gruppe, um eine mittlere kumulative Distanz zu erhalten, die von der Population von Dateien in derselben Gruppe zurückgelegt wird.

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Ergebnisse

Um ein CTE-Modell mit erwachsenen Drosophila zu etablieren , haben wir die Wirksamkeit unseres Gerätes bei der Vermeidung einer einzigen geschlossenen Verletzung festgestellt. Um die Variationen in Bezug auf Genotyp, Geschlecht oder Alter zu beseitigen, haben wir im Experiment 2-tägige Canton-S WT weibliche Fliegen verwendet. Wir konnten die Festigkeit des Impaktors leicht kontrollieren, indem wir die Strömungsgeschwindigkeit von CO ₂ bei einem konstanten Gasdruck ...

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Diskussion

Tiermodelle, die CTE-Merkmale, wie neurophysiologische Veränderungen, neuropathologische Kennzeichen und neurobehaviorale Defizite, treu modellieren, sind für die Aufdeckung von Krankheitsmechanismen und für die Entwicklung diagnostischer und therapeutischer Ziele unerlässlich. Es ist verständlich, dass kein Tiermodell einer menschlichen Erkrankung perfekt ist, um alle klinisch relevanten Endpunkte nachzuahmen. Allerdings glauben wir, dass ein robustes CTE-Modell die folgenden drei Anforderungen erfüllen sollte: (...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aerosol Barrier	USA Scientific	1120-8810	Used as an impactor
200 μL Pipette Tip	USA Scientific	1111-0706	Used as a fly head holder
1000 μL Pipette Tip	USA Scientific	1122-1830	Used as a connector
1 mL Tuberculin Syringe	Becton Dickinson	309625
60 mm Petri Dishes	Fisher Scientific	FB0875713A	Used as a tracking arenas
Flow Regulator	Genesee Scientific	59-122WC
Standard Clamp Holder/stand	EISCO Scientific	CH0688
Fine Brush	Genesee Scientific	59-204
Flypad	Genesee Scientific	59-114
Sylgard Silicone Elastomer	Dow Corning	4019862
CCD Camera	Microsoft	HD-5000
Ctrax Walking Fly Tracker	Caltech	Ctrax 0.2.11
MATLAB Image Processing Toolbox	MATLAB	R2015b