Hochauflösende Bildgebung und Analyse einzelner Astral Dynamik der Mikrotubuli in Bäckerhefe

Zusammenfassung

Hefe Angehende ist ein vorteilhaftes Modell die Dynamik der Mikrotubuli in vivo aufgrund seiner leistungsstarken Genetik und die Einfachheit der Mikrotubuli - Zytoskelett für das Studium. Das folgende Protokoll beschreibt, wie zu transformieren und Kultur Hefezellen, konfokale Mikroskopie Bilder erfassen und quantitativ die Dynamik der Mikrotubuli in lebenden Hefezellen analysieren.

Zusammenfassung

Dynamische Mikrotubuli sind von grundlegender Bedeutung für viele zelluläre Prozesse, und genaue Messungen der Dynamik der Mikrotubuli können Einblick, wie Zellen regulieren diese Prozesse und wie genetische Mutationen Auswirkungen Regulierung. Die Quantifizierung der Dynamik der Mikrotubuli in metazoan Modelle hat eine Reihe von Herausforderungen im Zusammenhang, einschließlich einer hohen Dichte von Mikrotubuli und Einschränkungen auf genetische Manipulationen. Im Gegensatz dazu bietet das Bäckerhefe Modell Vorteile, die diese Herausforderungen zu meistern. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, die Dynamik des einzelnen Mikrotubuli zu messen in lebenden Hefezellen. Zellen fluoreszierend markierte Tubulin exprimieren, werden zu montierten Schieber Kammer eingehalten, so dass für eine stabile Zeitraffer-Bildaufnahme. Eine ausführliche Anleitung für die Hochgeschwindigkeits, vierdimensionale Bildaufnahme wird auch als auch als ein Protokoll vorgesehen ist, um die Eigenschaften des dynamischen Mikrotubuli in konfokaler Bildstapeln zu quantifizieren. Dieses Verfahren, mit herkömmlicher Hefegenetik kombiniert, proveinen Ansatz ides, die in einzigartiger Weise geeignet ist für die quantitativ die Effekte von Mikrotubulus-Regulator oder Mutationen der Beurteilung, die die Aktivität von Tubulin-Untereinheiten zu verändern.

Einleitung

Mikrotubuli sind Polymere aus Zytoskelett-αβ-Tubulin-Protein-Untereinheiten und werden in einer großen Vielzahl von zellulären Zusammenhängen, einschließlich intrazellulären Transport, die Zellteilung, die Morphogenese und Motilität verwendet. Um Mikrotubuli Netzwerke für diese unterschiedlichen Rollen zu erstellen, müssen Zellen sorgfältig regeln, wann und wo Mikrotubuli Form. Diese Regelung wird durch die Steuerung der Reaktionen erreicht, daß entweder αβ-Tubulin-Untereinheiten in Mikrotubuli-Polymere oder disassemble Mikrotubuli in freie Untereinheiten zusammenzubauen; dies wird als die Dynamik der Mikrotubuli bekannt.

Ein Hauptziel des Mikrotubuli-Feld ist, die molekularen Mechanismen aufzuklären, die Dynamik der Mikrotubuli, einschließlich Studien der αβ-Tubulin-Untereinheiten und extrinsische Regulatoren regulieren, die an Tubulin und / oder an Mikrotubuli binden. Ein etablierter experimenteller Ansatz ist dieses System in vitro unter Verwendung von gereinigtem αβ-Tubulin - Protein rekonstituieren, die oft in combination mit gereinigtem extrinsischen Regulatoren. Obwohl dies ein sinnvoller Ansatz ist, ist es klar, dass in rekonstituierten Systemen die Dynamik der Mikrotubuli stark von der in lebenden Zellen beobachtet unterscheidet. Zum Beispiel wächst Mikrotubuli schneller und schrumpft langsamer in vivo als in vitro. Diese Unterschiede können auf die Verfügbarkeit von bekannten extrinsischen Regler ¹ sowie auf noch-nicht definierte Faktoren in Zellen zurückgeführt werden. Daher ist es wichtig, die Aktivitäten von Mikrotubulus-Regulierungsbehörde und Mutanten zu bestimmen, die Dynamik in einem nativen zellulären Kontext zu stören.

Obwohl metazoan Modelle die vorherrschenden Systeme werden für die Untersuchung von Mikrotubuli-Funktion und höherer Ordnung Organisation, mehrere praktische Bedenken schränken den Nutzen dieser Modelle für die präzise Messung der Dynamik der Mikrotubuli bewährt haben. Erstens ist die hohe Anzahl von Mikrotubuli, die von Dutzenden bis Tausenden pro Zelle, macht es schwierig, sicherverfolgt einzelne Mikrotubuli im Laufe der Zeit. Viele Studien befassen sich diese Herausforderung durch Abbilden Proteine, die an Mikrotubuli-Enden, wie beispielsweise Proteine ​​in der End-Bindung (EB) Familie selektiv lokalisieren. Jedoch werden diese Proteine bekannt, nur an den Enden des Wachsens Mikrotubuli in Metazoen ² zu lokalisieren. Daher wird die Nützlichkeit dieser Proteine ​​beschränkt auf Wachstumsraten direkt zu messen, während nur indirekt andere Aspekte der Dynamik zu messen, wie Frequenz der Katastrophe. Zweitens, trotz der Fortschritte in der Genombearbeitungstechnologie, Zellen schaffen, die fluoreszierend markierte Tubulin oder Einführung von Mutationen stabil exprimieren, selektiv Tubulin oder Mikrotubulus-Regula zu manipulieren bleibt eine große Herausforderung. Außerdem confounds die Anwesenheit von vielen Tubulin-Isotypen in metazoans die Studie, wie Mutationen Gene einzelne Tubulin auswirken.

Die Bäckerhefe System bietet mehrere wichtige Vorteile für die in - vivo - Messung microtubule Dynamik. Hefe hat ein vereinfachtes Mikrotubuli-Netzwerk, das die Visualisierung der einzelnen Mikrotubuli erlaubt. In Hefe stammen Mikrotubuli von Zentren bekannt als Spindel Polkörper (SPBs) der Organisation, die ³ in der Kernhülle eingebettet ist. Die SPBs dienen als Gerüste für γ-Tubulin kleine Komplexe , die Mikrotubuli ^{4, 5} nukleieren. SPBs nucleate zwei Klassen von Mikrotubuli, Spindel Mikrotubuli und astralen Mikrotubuli. Spindel Mikrotubuli Projekt in Nukleoplasma und sind wichtig für die Befestigung an Chromosomen über kinetochore Mikrotubuli und zur Stabilisierung der Spindel über überlappende inter Mikrotubuli ^6. Im Gegensatz dazu, nach außen vorstehen Astral Mikrotubuli in das Cytosol und relativ selten ist mit dem dichten Netz von Mikrotubuli Spindel verglichen. Während der Mitose haben pre-Anaphase Zellen nur 1-2 Astral Mikrotubuli entweder von SPB ausgeht; diese existieren, wie ichNDIVIDUELLE Mikrotubuli anstatt als Bündel ^7. Die Rolle des astralen Mikrotubuli während der Mitose ist den Kern und Spindel in die Verbindung zwischen der Mutter und Knospe Abteilen, bekannt als Keim Hals zu bewegen. Diese Bewegung beinhaltet gut definierte Wege , die Kraft , die auf astralen Mikrotubuli erzeugen, ziehen den Kern und Spindel in Richtung und schließlich in die Knospe Hals ^8.

Ein weiterer Vorteil des Hefe-Systems ist das Nutzen ihrer Genetik, die verwendet werden kann Mikrotubuli Regler und Tubulin-Untereinheiten mit bisher unerreichter Genauigkeit zu untersuchen. Hefe besitzt auch ein vereinfachtes Repertoire von Tubulin - Isotypen: eine einzelne β-Tubulin - Gen (TUB2) und zwei α-Tubulin - Gene (TUB1 und TUB3). Mutationen können leicht in diese Gene eingeführt werden und damit in einer homogenen Population Tubulin ^{9 untersucht, 10.} Es gibt eine Reihe von weitverfügbar Konstrukte zur Markierung von Mikrotubuli, und diese können für die Integration in die chromosomale Loci für eine stabile Expression ausgerichtet werden (siehe Diskussion).

Das Gesamtziel dieses Verfahrens ist, die das Bild einzelnes Mikrotubuli in lebenden Hefezellen in vier Dimensionen (X, Y, Z und T) für hochauflösende Messungen der Dynamik des Mikrotubuli. Verfahren zum Konstrukten für die konstitutive, Low-Level-Expression von fluoreszenzmarkierten Tubulin in Hefezellen Integration beschrieben. Vor der Bebilderung werden lebenden Zellen in Gleitberührung Kammern montiert mit dem Lectin Concanavalin A beschichtet ist, die Zellen für die Langzeitbilderzeugung zu stabilisieren. Die optimalen Parameter für die Bildaufnahme, sowie ein Workflow für die Datenanalyse, werden ebenfalls beschrieben.

Protokoll

1. Vorbereiten -LEU Dropout-Platten

1. Zugabe von 800 ml sterilem, entionisiertem Wasser (DiH ₂ O) in eine 2 - l - Kolben. In 26,71 g Dropout-Basis (DOB) Pulver, 0,69 g CSM-Leu und 20 g Agar. Mischung mit einem magnetischen Rührstab. Bringen auf 1 L mit DiH ₂ O.
2. Autoklaven bei 121 ° C und 19 psi für 30 min.
3. Entfernen Sie den Kolben aus dem Autoklaven und lassen Sie es auf ~ 65 ° C unter leichtem Rühren abkühlen.
4. Gießen Sie 30 ml / Platte mit 100 mm Durchmesser in Platten. Lassen Sie diese für 36-48 Stunden bei Raumtemperatur sitzen, bevor bei 4 ° C lagern.

2. Integration GFP-TUB1 für die konstitutive Expression von GFP-markierten Tubulin

1. Siedet eine Stammkonzentration von 10 mg / ml Einzelstrang-DNA (ssDNA) für 3 min.
2. Kombinieren von 2 & mgr; l von gekochtem ssDNA mit 400 ng gereinigtes GFP-Plasmid - DNA TUB1 ^11.
   HINWEIS: Es gibt eine Vielzahl von Plasmiden, die für die stabile, fluoreszierende Markierung verwendet werden könnenvon Mikrotubuli in Hefe, die alternativen Fluorophore und selektierbare Marker verwenden. Einige dieser Alternativen sind in der Diskussion Abschnitt beschrieben.
3. Fügen Sie die DNA-Mischung in ein 50 ul-Aliquot kompetenter Hefezellen.
   HINWEIS: Die Herstellung kompetente Hefezellen mit Sorbitlösung (SORB; 100 mM LiOAc, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA pH 8 und 1 M Sorbit, eingestellt mit verdünnten Essigsäure auf pH 8). Für eine detaillierte Beschreibung kompetente Hefezellen zu machen, siehe Referenz ^12.
4. Vortex gründlich.
5. Hinzufügen 6x das Gesamtvolumen von Polyethylenglykol (PEG) -Lösung (100 mM LiOAc, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA / NaOH pH 8, und 40% PEG3350) an die DNA-Zellmischung.
6. Vortex gründlich.
7. mindestens 1 h inkubieren bei 30 ° C unter leichtem Schütteln.
8. Hinzufügen Dimethylsulfoxid (DMSO) zu 10% des Gesamtvolumens und vortexen.
9. für 15 min bei 42 ° C inkubieren.
10. Zentrifuge bei 2500 × g für 5 min.
11. den Überstand entfernen und die Zellen in 100 & mgr; l DiH ₂ O suspendieren
12. Zellen auf einer Platte -LEU Dropout Platte.
    HINWEIS: Das GFP-TUB1 Konstrukt enthält einen Leucin-auxotrophen Marker, während andere Konstrukte eine alternative Marker verwenden könnten. Das Dropout-Medium sollte den auxotrophen Marker des Konstrukts spezifisch sein.
13. Lassen Sie die transformierten Zellen für 3-5 Tage bei 30 ° C wachsen.
14. Re-Streifen einzelne Transformation Kolonien auf eine frische -LEU Dropout-Platte von Kolonien mit einem Zahnstocher autoklaviert übertragen. Inkubieren der Platte über Nacht bei 30 ° C.
15. Visuell Bildschirm jeden Transformant für ein GFP - Signal von etwa 1 & mgr; l von Zellen aus einer einzelnen Kolonie von der Platte in Schritt 2.14 in 2 ul Wasser auf einem sauberen Objektträger suspendiert. Bedecken der suspendierten Zellen mit einem Deckglas und beobachten , Fluoreszenzmikroskopie.
    1. Regen, um die Transformanten mit 488 nm Licht und sucht Gegenwart eines GFP-Signal.
       Hinweis: Dieser Schritt kann eine sich drehende Scheibe konfokalen Mikroskop, sondern ein Weitfeld- Mikroskop, ausgestattet mit einem 100X-Objektiv und eine geeignete Optik zur Abbildung GFP genügt verwenden. Zellen ohne sichtbaren GFP-markierten Mikrotubuli, oder solche mit ungewöhnlich hohen Fluoreszenz, sollen abgelehnt werden. Danach werden die Hefestämme bereit für die Bildgebung kultiviert werden.

3. Wachsende Flüssigkeit Hefekultur

1. Beimpfen von ~ 1 & mgr; l Hefe-Zellen aus einer einzelnen Kolonie auf einer Platte in 3 ml synthetischem komplettem Medium. Lassen Sie die Zellen unter Schütteln bei 250 UpM über Nacht bei 30 ° C wachsen.
2. Verdünne die gesättigte Kultur am folgenden Tag auf einen OD ₆₀₀ von <0,1 im Medium. Liefert die verdünnte Kultur auf den 30 ° C - Schüttler für 3-4 h oder bis die OD ₆₀₀ zwischen 0,4 und 0,8, wenn die Zellen bereit , in Kammern für die Bildgebung wird geladen.

4. Vorbereitung Flusskammer Slides

1. Schneidenein Blatt aus Paraffinfilm in ein Stück 4 in breiten und 7 in lang.
2. Platzieren einen Standard-Mikroskop-Objektträger in Längsrichtung auf der 4 Zoll Breite von Paraffinfilm und wickelt den Film um den Schieber 3-4mal so dass der Schieber in Folie bedeckt ist, die 3-4 Schichten dick ist. Drücken Sie die Schichten zusammen um sicherzustellen, dass eine angemessene Dichtung ist; dies wird es leichter schneiden machen. Vermeiden Sie zu starkem Pressen oder Verursachung des Films Falten.
3. Schneiden Sie den Paraffinfilm entlang der Außenkanten des Schlittens eines sauberen Rasierapparat Teppichmesser verwenden. Verwendet eine andere Folie eine gerade Kante zu schaffen, für das Schneiden.
4. Ziehen Sie die überschüssige Folie von dem Arbeitsschieber und entsorgen. Die restlichen Stapel von Film wird eine Fläche der Gleitabdeckung und verwendet werden, um die Wände zwischen Abbildungskammern zu bilden.
5. Verwendung der zweiten Folie als straight edge, schneiden die gestapelten Folienlagen entlang der langen Achse des Schiebers in etwa zehn Streifen, die jeweils 2-4 mm in der Breite.
6. Schneiden Sie die gestapelten Paraffinfilmschichten senkrecht zudie vorgenommenen Schnitte in Schritt 4.5, entlang der kurzen Achse des Schiebers, Streifen 2-4 mm in der Breite zu schaffen, 23-24 mm in der Länge und 3-4 Schichten dick.
7. Abschälen der geschnittenen Streifen einen Rasierapparat in einem Winkel von 45 ° verwendet wird. Mit einer Pinzette, gleichmäßig verteilen, die geschnittenen Filmstreifen auf einem sauberen Mikroskop-Objektträger die gewünschte Anzahl von Kammern zu schaffen. Bis zu 3 Kammern (mit 4 Paraffin Folienbändchen aus) können auf einer Folie erzeugt werden.
8. Platzieren ein einzelnes Deckglas auf der Oberseite der Folienstreifen und bewegt ihn in Position mit einer Pinzette.
9. Die vorbehandelte Objektträger, Deckglas nach oben, auf einer Heizplatte gesetzt bei ~ 95 ° C (das ist etwa die Niedrig mittlere Einstellung auf den meisten Kochplatten). Erwärmen die Folie, bis die Filmstreifen durchscheinend sind (ca. 3 min) und dann die Gleitdichtung und Deckglas zusammen vorsichtig mit der Pinzette auf das Deckglas gedrückt wird.
   HINWEIS: Es ist wichtig, nur Druck auf die Regionen des Deckglases, die direkt über den Paraffin-Filmstreifen, wie Kratzen die Bereiche oberhalb der chambers kann die Bildqualität vermindern. Achten Sie darauf, dass die Rutsche nicht zu überhitzen; verdampfte Film Beschichtung der Innenseite der Kammer mit einem hydrophoben Film, der die Zellen ein Anhaften verhindert.
10. Verwenden einer Pinzette, die Folie von der Heizplatte zu entfernen (der Objektträger wird heiß) und zur Seite legen mit der Deckseite nach oben zu kühlen; wie der Schieber abkühlt, kehrt der Film auf eine weiße, opake Färbung.
    HINWEIS: An diesem Punkt sind die Folien bereit, mit kultivierten Hefezellen geladen werden. Zusätzliche Folien können in einem sauberen und trockenen Ort für eine unbestimmte Zeit bis zu diesem Punkt und gespeichert gemacht werden.

5. Laden Hefezellen in vorbereitete Flusskammer Slides

1. Auftauen eines gefrorenen, 200 & mgr; l Aliquot von Concanavalin A (2 mg / ml in sterilem DiH ₂ O).
2. Mit ca. 100 & mgr; l der aufgetauten Concanavalin A zu jeder Kammer des vorbereiteten Objektträger pipettiert, in eines der offenen Enden. Fügen Sie genug ConcanavalinA die Kammer zu füllen. Dazu sTEP, wird die Concanavalin A durch die Kammer durch Kapillarwirkung gezogen werden kann.
3. Hängt die Folie, Deckglas nach unten, zwischen zwei Mikrozentrifugenröhrchen - Gestelle oder Stiften für 5 min der Concanavalin A , damit das Deckglas (dh der Kammer) haften.
4. Bringen Sie die Folie in eine Deck-up - Position. Waschen Sie die Kammer mit 2x das Kammervolumen (bestimmt in Schritt 5.2, oben, etwa 200 & mgr; l) aus synthetischem Komplettmedium das Concanavalin A. zu entfernen
   1. Fließt das Medium durch die Kammer, indem entweder die Ecke eines Papiertuches oder ein Filterpapier in der Mitte gefaltet aus einem Ende der Kammer Fluid zu ziehen, während gleichzeitig frische Flüssigkeit Pipettieren in die andere. Alternativ dazu verwenden, um ein Vakuum-Saugvorrichtung sorgfältig Fluid aus einem Ende zu ziehen beim Pipettieren frisches Fluid in das andere.
5. Wägezellen von 2x der Kammervolumen fließen (etwa 200 & mgr; l) der Zellsuspension (aus Schritt 3.4) unter Verwendung der gerichteten Strömung method in Schritt 5.4.1 beschrieben.
   HINWEIS: Das Ziel ist, eine einzelne Schicht von Zellen auf dem Deckglas zu Bild. Daher ist es wichtig, eine Konzentration der Zellen klein genug, um zu laden, dass sie anhäufen nicht übereinander, aber groß genug, dass genügend Zellen in dem Gebiet vorhanden sind, um die maximale Menge an Daten pro Bildaufnahme zu sammeln. Die optimale Konzentration der Zellen innerhalb der Kammer kann variieren und sollte empirisch bestimmt werden. Um die Konzentration der Zellen in der Fließkammer zu erhöhen, leicht die Zellkultur bei 1000 × g für 2 min pelletieren und einen Teil des Überstandes entfernen. Um die Konzentration der Zellen zu verringern, fügen Sie frisches synthetisches Komplettmedium zu der Zellsuspension. Die Konzentration der Zellen kann nach dem Schritt 5.7 (unten) ausgewertet werden, indem die Kammer Mikroskop auf einem Phasenkontrast inspizieren. Zu diesem Zeitpunkt können zusätzliche Zellen zu der Kammer hinzugefügt werden, indem in mehrere Zellsuspension fließt. Doch an diesem Punkt Zelldichte zu reduzieren, ist nicht möglich und wird am besten erreichtdurch eine neue Kammer mit einer verdünnten Zellsuspension geladen werden.
6. Hängt die Folie Deckglas nach unten, wie es für 10 min in Schritt 5.3 beschrieben, damit die Zellen an das Deckglas haften.
7. Auszuspülen irgendwelche nicht anhaftende Zellen durch Durchströmen 4x das Kammervolumen (ca. 400 & mgr; l) aus synthetischem Komplettmedium. Dies wird frei schwebenden Zellen in der Kammer beseitigen, die die Bildaufnahme kontaminieren können.
8. Trocknen sorgfältig jedes Ende der Kammer mit einem sauberen Ecke eines Papiertuch, um den Meniskus an den Rand des Deckglases gebracht wird.
9. Abdichten jedes Ende der Kammer mit warmem (75 ° C) Dichtmittel (zB VALAP; gleiche Teile Vaseline, Wollwachs und Paraffinwachs).
   HINWEIS: An dieser Stelle wird der Schlitten ist bereit zu Bild. Die Kammern können für bis zu 9 h bebildert werden, abhängig von der Dichte der Zellen in jeder Kammer. Die Zellen werden von Kohlendioxid (CO ₂₎ im Laufe der Zeit produzieren, die Blasen allmählich schaffen, die die Zellen verdrängen.

6. image Acquisition

1. Bringen Sie die Folie, um ein inverses Mikroskop, ausgestattet mit einem 1,45 NA 100X CFI Plan Apo Ziel, eine piezoelektrische Phase, eine sich drehende Scheibe konfokalen Scanner-Einheit, einem Beleuchtungslaser und einer EMCCD Kamera. Aufrechterhaltung der Temperatur der Stufe bei Raumtemperatur (25 ° C) während der Erfassung.
   HINWEIS: Die hohe numerische Apertur ermöglicht eine größere Bildauflösung, und die piezoelektrische Phase ermöglicht z-Stapelerfassung mit hohen Geschwindigkeit. Die minimalen Anforderungen sind das Mikroskopobjektiv 100X, der Beleuchtungslaser und die EMCCD Kamera.
2. Bringen Sie die Zellen in den Fokus. Stellen Sie sicher, dass das Erfassungsfeld durch Durchsuchen der Objektträger für Zellen zusammengruppiert mindestens 5-6 Zellen zusammen gruppiert hat.
   Hinweis: Obwohl es nicht erforderlich, die das Bildes ist mehr als eine Zelle zu einem Zeitpunkt, Imaging mehr Zellen in dem gleichen Feld verbessert die Effizienz der Datenerfassung, ohne die Qualität der Daten zu beeinträchtigen. Allerdings ist es wichtig, dass dieZellen werden auf der gleichen Brennebene und nicht auf die aufeinander gestapelt.
3. Programm eine mehrdimensionale Erfassung mehr z-Serie im Laufe der Zeit zu sammeln.
   1. Anpassen der Einstellungen innerhalb der aktiven Akquisitions Einstellungen auf die folgenden: Gesamt Z-Tiefe = 6 & mgr; m, umfassen, das die gesamte Hefezelle; Z-Schrittweite = 300 nm, Lichtsammlung ohne Überabtasten zu maximieren; Gesamtzeitdauer = 10 min; Zeitintervalle = Z-Serie alle 4 s; und die Belichtungszeit = 90 ms für jede z-Ebene.
      HINWEIS: Die optimale Belichtungszeit variiert in Abhängigkeit von der Kamera, die Anregungslichtquelle und anderen Faktoren ab. Im Allgemeinen wird die optimale Belichtungszeit die minimale Zeit, notwendig sein, ein 3: 1 zu erzielen Verhältnis von Signal von GFP-markierten Astral Mikrotubuli aus dem Zytoplasma auf Pixelwert, gemessen durch den EMCCD basierend zu signalisieren.
4. Beginnen Sie mit dem Erwerb von ‚Ausführen‘ klicken. Lassen Sie es für die volle 10 Minuten Dauer laufen. Speichern Sie die Daten als BildSerie (Tiff oder .nd2).
5. Wählen Sie ein neues Feld zu Bild innerhalb der Kammer und wiederholen Sie die Schritte 6,2-6,4.
   HINWEIS: Eine einzelne Kammer sollte zwischen 15 und 20 Feldern von Zellen ergeben, abhängig von der Zelldichte in der Kammer. Höhere Zelldichten werden niedrigere Gesamt Felder ergeben, da das CO ₂ in der Kammer schneller aufzubauen.

7. Bildanalyse

1. Öffnen Sie die Bilddatei in ImageJ ( https://imagej.nih.gov ) als Hyperstack durch den Bio-Formate Importeur Plugin.
   1. Öffnen ImageJ und ziehen Sie den erfassten Bildstapel aus dem Abschnitt 6 direkt auf dem Bedienfeld. Der Bio-Formate Importeur wird automatisch gestartet. Wählen Sie „OK“, um die Bildstapel als Hyperstack zu laden.
      HINWEIS: Die „Bio-Formate Import-Optionen“ Eingabeaufforderung öffnen und sicherstellen, dass unter dem „Stack Anzeigen“ Abschnitt „View-Stack mit:“ auf „Hyperstack“; und "Stack Order:" auf "XYCZT."
2. Kollabiert jede Z-Serie in eine maximale Intensität, 2-dimensionale Projektion unter Verwendung der Z-Projekt - Funktion.
   1. Wählen Sie das Menü „Bild“, das „Stack“ Untermenü, und das „Z-Projekt“ -Funktion. Wählen Sie „Maximale Projektion“ aus der Dropdown-Liste und klicken Sie auf „OK“.
3. Anwenden eines Medianfilters an das Bild, um Stapel Sprenkeln Rauschen zu reduzieren, indem die „Process“ Menü auswählen, die „Filter“ Untermenü, und der „Median“ -Funktion. Geben Sie 2,0 Pixel in den Radius und klicken Sie auf „OK“.
4. Identifizieren Sie Pre-anaphase Zellen im Feld.
   ANMERKUNG: Diese werden durch mittlere Knospen gekennzeichnet sind und eine kurze mitotischen Spindel, 1-1,5 & mgr; m in der Länge (1; Die Pfeilspitze zeigt auf eine kurze mitotischen Spindel). Die Zellen in diesem Stadium sind ideal für die Analyse der Dynamik des Mikrotubuli, weil sie in der Regel nur ein fe aufweisenw Astral Mikrotubuli der Spindelpole ⁷ ausgeht. Astral Mikrotubuli können als linearen Filamente identifiziert werden, die eine einheitliche GFP Signalintensität von dem Minus-Ende aufweist, an der SPB, an das Plus-Ende, in dem Zytoplasma.
5. Ausgehend von dem ersten Zeitpunkt der Bildfolge, verwenden, um das segmentierte Linie Werkzeug eine Linie entlang einem einzigen Astral Mikrotubuli, von dem Minus-Ende zu ziehen, an der Verbindung zwischen dem Astral Mikrotubuli befindet und desto intensiver markiert Spindel Mikrotubuli, an das Plus-Ende , die im Zytoplasma (siehe die roten Linien in Figur 1) ist. Doppelklicken Sie auf das Ende des Filaments, die segmentierte Linie abzuschließen.
6. Notieren Sie die Messung in der Ergebnistabelle der „Maßnahme“-Funktion, indem Sie die Taste „M“ auf der Tastatur drücken.
   HINWEIS: Weitere Merkmale, wie Grau Intensität, kann durch Einstellen der Messungen in der „Analyse“ -Menü und „Set Measurements“ Untermenü aufgezeichnet werden.
7. Rücken zum nächsten Zeitpunkt entweder durch den Pfeil nach rechts in der Z-Schiebeleiste klicken oder die Taste „./>“ Taste auf der Tastatur. Wiederholen Sie die Schritte 7.5 und 7.6 für alle Zeitpunkte in der Bildsequenz.
8. Kopieren Sie die Daten aus der Ergebnistabelle und fügen Sie sie in eine Tabelle. Speichern Sie die Daten, indem Sie „Speichern unter“.
   HINWEIS: Diese Messungen werden mehrere Werte enthalten, aber die wichtigsten Werte sind die Scheibe, die den Zeitpunkt in der Serie gibt, und die Länge, die die Länge der Linie angibt (dh die astralen Mikrotubuli). Columns andere Messungen enthalten (zB der Bereich, mittleren Pixelwert, Winkel, etc.) kann entweder aufbewahrt oder entsorgt werden.
9. Erstellen Sie eine neue Spalte in der Tabelle mit einem Rechtsklick und mit Hilfe der Funktion „Einfügen“. Geben Sie die Zeit (s) von jedem Zeitpunkt.
10. Erstellen Sie ein XY - Streudiagramm von Mikrotubuli Länge (um) als Funktion der Zeit (s) mit dem „Zeile einfügenChart“Funktion, wählt die Längenmessungen als‚Y‘und die Zeit-Spalte als‚X‘
    1. Identifizieren Regionen der Polymerisation, Depolymerisation und Pause durch positive und negative Längenänderungen im Laufe der Zeit auf dem Streudiagramm von Schritt 7.10 suchen.
       HINWEIS: Die Polymerisation Ereignisse Mikrotubuli Länge von mindestens 0,5 & mgr; m über mindestens 3 Zeitpunkt erhöht , und eine lineare Regression mit einem R ² ≥ 0,9 und einen R-Wert> 0 (1B und D, grüne Punkte) passen. Depolymerisation von Mikrotubuli Ereignissen Länge von mindestens 0,5 & mgr; m über mindestens 3 Zeitpunkt verringern , und eine lineare Regression mit einem R ² ≥ 0,9 und einem R-Wert von <0 (1B und D, rosa Punkte) passen. Pause Ereignisse sind getrennt von Polymerisation und Depolymerisation. Unterbricht werden als Nettoänderungen der Mikrotubuli Länge definiert weniger als 0,5 um über mindestens 3 Zeitpunkte;fit eine lineare Regression mit einem R-Wert zwischen -0.4 und 0.4; und hat eine Steigung, die statistisch nicht von Null verschieden ist, wie es durch einen F-Test bestimmt.
    2. Unter Verwendung des Streudiagramm als Leitfaden, identifizieren die Abschnitte der Zeit, wenn die Längenänderung positiv ist und markieren Sie sie in einer grünen Farbe. Highlight Regionen der Zeit, wenn die Längenänderung in einer rosa Farbe negativ ist.
    3. Berechnen die lineare Regression jeden Abschnitt hervorgehoben und notieren Sie das R- und R ² -Wertes für jeden Abschnitt in den Spalten proximal zu den Regionen. Klassifizieren jeden gefärbten Bereich entweder als ein Polymerisations-Ereignis oder ein Ereignis Depolymerisation.
11. Berechnen Sie die Polymerisationsgeschwindigkeiten durch die Nettoveränderung für jedes Wachstum Ereignis durch die Änderung in der Zeit in der Länge geteilt wird. Nimm diese Ergebnisse in der Spalte benachbart zu den linearen Regressionswerten aus Schritt 7.10.3.
12. Berechnen der Depolymerisation Raten durch die Nettoveränderung für jede shrinkin durch die Änderung in der Zeit in der Länge Dividiereng Ereignis. Nimm diese Ergebnisse in der Kolonne benachbart zu den Polymerisationsgeschwindigkeit Werten von Schritt 7.11.
13. Berechnen Sie die Katastrophe Frequenz durch die Anzahl von Polymerisations-zu-Depolymerisation Übergänge dividiert durch die Gesamtzeit aller Wachstums Ereignisse ^13. Nimm diese Ergebnisse in der Spalte neben dem Depolymerisation Ratenwert aus dem Schritt 7.12.
14. Berechnen Sie die rescue Frequenz durch die Anzahl der Depolymerisation zu Polymerisation Transitionen Dividieren durch die Gesamtzeit aller Schrumpfungs Ereignisse ^13. Nehmen diese Ergebnisse in der Spalte neben den Katastrophenfrequenzwerte aus Schritt 7.13.
15. Berechnen Sie die dynamicity durch die Summe aus dem Absolutwert aller Längenänderungen durch die Gesamtdauer der Bildaufnahme Dividieren berechnet in Schritt 7.10.1, und Multiplizieren mit 27,0833 an Tubulin - Untereinheiten ¹⁴ pro Sekunde zu erhalten. Notieren Sie diese Ergebnisse in der Spalte neben der Rettungsfrequenz values aus Schritt 7.14 und die Ergebnistabelle speichern.
    HINWEIS: Es ist möglich , den Analyseprozess in Schritten von 7,10 bis 7,15 mit einem maßgeschneiderten Programm beschrieben zu automatisieren (. Estrem, et al, eingereicht Manuskript). Das Programm ist entworfen, um über die detaillierten Parameter folgenden Perioden der Polymerisation und Depolymerisation in den Längenmessungen zu identifizieren.

Ergebnisse

Messung der Dynamik der Mikrotubuli in lebenden Hefezellen liefert ein überzeugendes Werkzeug zu beurteilen, wie Mutationen in Genen, die für Mikrotubulus-Regulatoren oder Tubulin-Untereinheiten Auswirkungen Polymerisation und Depolymerisation Raten sowie die Häufigkeit des Übergangs zwischen diesen Zuständen. Abbildung 1 zeigt eine Zeitreihe von Astral Dynamik der Mikrotubuli in einer Wildtyp - Zelle und eine mutante Zelle mit einer Mutation in β-Tubulin (tub2...

Diskussion

Die Bäckerhefe Modell bietet große Vorteile für die in einem in - vivo - Einstellung hochauflösende Messungen der Dynamik der Mikrotubuli sammeln, einschließlich der Fähigkeit, einzelne Bild Mikrotubuli über die Zeit und die Fähigkeit , Tubulinen und Mikrotubuli Regulatoren mit den Werkzeugen der Hefegenetik zu manipulieren.

Die Concanavalin A-beschichtete Kammern bieten eine Reihe von Vorteilen gegenüber den zuvor beschriebenen Vorrichtungen, einschließlich der g...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOB (dropout bases)	Sunrise science	1650
CSM-Leu	Sunrise science	1005
Agar	Ameresco	N833
100 mm polystyrene plates	Fisher Scientific	FB0875713
ssDNA (Samon Sperm)  in sterile DiH2O	Sigma-Aldrich	D7656	resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Synthetic Complete Media	Sunrise science	1459-100
Concanavalin A	Sigma-Aldrich	L7647	resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-1
Microscope Coverslips	Fisher Scientific	12-541-B
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12	paraffin film
VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin)			melt at 75 ºC before use
forceps	Fisher Scientific	16-100-106
Poyethylene glycol (PEG) 3350	Sigma-Aldrich	202444
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope
Ti E inverted Perfect Focus microscope	Nikon Instruments	MEA53100
1.45 NA 100X CFI Plan Apo objective	Nikon Instruments	MRD01905
Piezo electric stage	Physik Instrumente	P-736
Spinning disk scanner	Yokogawa	CSU10
Laser combiner module	Agilent Technologies	MCL400B
EMCCD camera	Andor Technology	iXon Ultra 897
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
NIS Elements software	Nikon Instruments	MQS31100
Microsoft Excel software	Microsoft
MATLAB software	MathWorks, Inc
ImageJ64	NIH		Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Bio-Formats Importer plug-in	Open Microscopy Environment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids
pUC19-LEU2::GFP-TUB1		pSK1050	reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001)