Ein integriertes System aus der Ferne intrazelluläre Signaltransduktion von Großbildschirmen Nanoparticle vermittelte Kinase Photoaktivierungen auslösen

Zusammenfassung

In diesem Protokoll eingesperrte Proteinkinase A (PKA), ein zelluläres Signal Transduction Bioeffector, war auf einem Nanoparticle Oberfläche immobilisiert, mikroinjiziert in das Zytosol und aktiviert, indem die hochkonvertiert UV-Licht von Nah-Infrarot (NIR) Bestrahlung, Induktion nachgeschalteten Stress Faser Zerfall in das Zytosol.

Zusammenfassung

Großbildschirmen-Nanopartikel (UCNP)-vermittelten Photoaktivierungen ist ein neuer Ansatz für Remote Control BIOeffektoren mit viel weniger Phototoxizität und tiefere Gewebe eindringen. Die bestehenden Instrumente auf dem Markt ist jedoch nicht ohne weiteres kompatibel mit Großbildschirmen Anwendung. Daher ist es wichtig für diese Forschung, das kommerziell erhältliche Instrument ändern. In diesem Beitrag zeigen wir zuerst die Änderungen eines konventionellen Fluorimeter und Fluoreszenzmikroskop, um sie kompatibel für Photon Großbildschirmen Experimente zu machen. Dann beschreiben wir die Synthese von einem nahen Infrarot (NIR)-Käfig Protein Kinase A katalytische Untereinheit (PKA) auf einem UCNP Komplex immobilisiert ausgelöst. Parameter für die Mikroinjektion und NIR Photoaktivierungen Verfahren werden auch gemeldet. Nachdem die eingesperrte PKA-UCNP in REF52 Fibroblastenzellen mikroinjiziert ist, löst die NIR-Bestrahlung, die herkömmlichen UV-Bestrahlung deutlich überlegen ist, effizient die PKA Transduktion Signalweg in lebenden Zellen. Positive und negative Kontrolle Experimente bestätigen darüber hinaus, dass die PKA-induzierten Weg zur Auflösung von Stress Fasern speziell von NIR Bestrahlung ausgelöst wird. So bietet der Einsatz von Protein-modifizierte UCNP einen innovativen Ansatz zur Fernsteuerung Licht moduliert zellulärer Experimenten, in denen direkte Einwirkung von UV-Licht vermieden werden muss.

Einleitung

Chemisch modifizierte Proteine, die photoaktiviert (z. B. PKA eingesperrt Proteine) ist entstanden als ein aufstrebendes Gebiet in der chemischen Biologie, nicht-invasiv interzelluläre biochemische Prozesse^{1,2 manipulieren ,3}. Mit Licht, wie ein Stimulus ausgezeichnete räumlich-zeitliche Auflösung bietet, wenn Sie diese aktivieren im Käfig Proteine. UV-Licht kann jedoch unerwünschte morphologische Veränderungen, Apoptose und DNA-Schäden an Zellen^4,5führen. Daher konzentrieren sich jüngste Entwicklungen in der Gestaltung von Photocaging Gruppen über die Aktivierung der Photocleavage auf längeren Wellenlänge oder zwei-Photon Erregung Phototoxizität, sowie Verringerung der tiefen Gewebe eindringen^6,7zu erhöhen. Festsetzende Gruppen, die auf längeren Wellenlänge ermöglicht es uns, geeignete uncaging Wellenlängen (z.B.Kanäle) wählen gezielt zu reagieren aktivieren BIOeffektoren, wenn zwei oder mehr festsetzende Gruppen sind vorhanden-⁷. Angesichts dieser nützlichen Funktionen, ist entwickeln neue Rotlicht-Photocaging Gruppen sehr wichtig vorgelagerten Werk in photochemischen Methoden für biologische Studien von sondieren die Mechanismen der Reaktionen auf die Kontrolle der zellulären Aktivitäten⁸. Nichtsdestotrotz eine zwei-Photonen-festsetzende-Gruppe ist in der Regel auch hydrophobe aufgrund der verschmolzenen aromatischen Ring-Struktur und eine sichtbaren Lichts festsetzende Gruppe ist normalerweise organometallischen, mit aromatischen Liganden. Diese hydrophoben/aromatisch-Eigenschaft ist nicht geeignet, wenn die Bioeffector ein Protein oder Enzym, ist, wie es Ortsbild Aktivierung des Enzyms/Protein denaturiert und führt zum Verlust der Funktion, auch wenn die Konjugation und Photolyse noch auf chemischer Ebene^{2 arbeiten ,9}.

UCNPs sind effektive Wandler, die das Anregungslicht NIR bis UV umwandeln. Diese einzigartige und faszinierende Eigenschaft der UCNPs bietet realistische Lösungen für die Herausforderungen im Zusammenhang mit Photoaktivierungen und kontrollierten Freisetzung von kleinen Molekülen, darunter Folsäure¹⁰, Cisplatin Derivate^{11 ausgelöst} , DNA/SiRNA¹², Copolymer Vesikel¹³und hohle Partikel¹⁴. Jedoch wurde nach bestem Wissen und Gewissen, die UCNP-gestützte Photoaktivierungen Enzyme oder Proteine nicht bisher getestet. Da gibt es keine erfolgreichen Fall mit Rotlicht oder NIR photoaktiven ein Enzym, wurden wir aufgefordert, die NIR-ausgelösten Aktivierung ein Protein/Enzym-Konstrukt bestehend aus chemisch modifizierte Käfighaltung Enzymkomplexe mit einer Silica-beschichtete durchführen, Lanthanid-dotierte UCNP¹⁵. In dieser Studie wurde die UCNP mit einem schnell reagierenden Signaltransduktion Kinase in Form der Käfighaltung PKA konjugiert. PKA steuert Glykogen-Synthese und Zytoskeletts Verordnung, die auf äußere Reize über zyklische Adenosin Phosphat (cAMP) Verordnung im Zytosol¹⁶reagiert. Wir untersuchten die Machbarkeit der Enzym-Aktivierung in zeitlicher und räumlicher Manieren in einem zellulären Experiment nach NIR Bestrahlung. Diese UCNP-gestützte Photoaktivierungen-Plattform ist eine neue Methode zur Photoactivate ein Enzym mit NIR und vermeidet unerwünschte Signal Transduction Resonanz Zellen verursacht durch konventionelle UV Bestrahlung^2,4.

Es ist sehr schwierig, große BIOeffektoren zu translozieren (z. B. Proteine) in der Zellmembran, Zellaktivität zu kontrollieren. Obwohl Partikel immobilisiert Protein leichter über Endozytose in das Zytosol translozieren sein kann, kann Endozytose beschädigt oder über Endosomal Einschluss und die daraus resultierenden lysosomalen Abbau^2,4abgebaut. Selbst wenn das eingesperrte Protein nach Membran Translokation noch funktionsfähig ist, möglicherweise translozierten Beträge nicht ausreichen, um die zelluläre Reaktion^2,17auslösen. In scharfem Kontrast ist Mikroinjektion eine direkte und quantitativen Ansatz, große Bioeffectors an das Zytoplasma der Zelle zu liefern. Darüber hinaus erfordert UCNP immobilisiert Bioeffector hochkonvertiert Licht aktiviert werden. Die optische Messtechnik erfordert daher weitere Modifikation zu messen, visualisieren und Großbildschirmen Licht zu nutzen. In dieser Arbeit wird die Lieferung von einem Käfig PKA-UCNP-Komplex zu einer Zelle mit Mikroinjektion und die folgenden wesentlichen Änderungen der Spektroskopie und Mikroskopie für NIR Photoaktivierungen ausführlich beschrieben.

Protokoll

Hinweis: das Protokoll beschreibt eine detaillierte Instrumentierung-Modifikation für Großbildschirmen-gestützte Photoaktivierungen, ein synthetisches Verfahren generieren eingesperrt PKA-UCNP, Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) von der Kieselsäure-beschichtete UCNP und PKA-UCNP Proben, UV- und NIR Photolyse Einrichtung, Handy Vorbereitung, Mikroinjektion PKA-UCNP, eine Photoaktivierungen Studie und Stress Faser Färbung von REF52 Zellen eingesperrt.

1. Fluorimeter Setup für Großbildschirmen Spektrum Messung

1. ein 4 X Objektiv neben der Küvettenhalter der Fluoreszenz-Spektrometer zu installieren, so dass der Laser mittig auf die Küvette fokussiert ist.
2. Legen Sie eine abstimmbaren 0,5 - 8 W 980 nm Laserdiode 90° gegen die Objektivlinse.
   Achtung: Der Betreiber muss Laser Sicherheit wissen und NIR-Laser-Schutzbrille zu tragen.
3. Installieren Sie einen vollständige Reflexion-Spiegel in den Lichtweg Schnittpunkt der Objektivlinse und Laser. Legen Sie eine schwarz eloxierte Metallplatte, die Erregung Fenster der Spektroskopie zu blockieren und zum Schutz der inneren Teile.
4. Die Küvette Kieselsäure-beschichtete UCNP Lösung (0,2 - 0,6 mg/mL) in den Küvettenhalter legen, so dass ein helle Großbildschirmen Balken visualisiert werden und verwendet werden, kann um die besten leichte Ausrichtung für Spiegelinstallation anpassen.
5. Wechseln die Spektroskopie Lumineszenz-Modus mit niedrigsten PMT Spannungseinstellung (anpassen, um eine höhere Einstellung, wenn das Signal zu schwach ist). Passen Sie den Spiegel, um die beste Ausrichtung, wo der Strahl in der Mitte der Küvette und PMT nimmt das stärkste Signal.
6. Messen das Großbildschirmen Spektrum nach Angleichung an die Einstellung der gewünschten Leistung. Verwenden Sie thermische Haufen Leistungsmesser zur Erstellung einer Kalibrationskurve Laserleistung gegen den elektrischen aktuellen Messwert auf dem Laser-Netzteil. Die Laserleistung um sicherzustellen, dass die Leistung innerhalb des kalibrierten Bereichs ist ständig zu überprüfen.

2. Mikroskop-Setup

Hinweis: das folgende Setup funktioniert für Mikroskope mit einem zweistufigen Strahlengang ausgestattet. Will der Benutzer einen Anregung Lichtquelle Schalter in den hinteren Port der NIR-Laser und die Halide Lampe denselben Port nutzen zu installieren, wird der Kollimator in den rückseitigen Anschluss deutlich NIR blockieren, weil es Probe Heizung reduzieren soll. Der Benutzer muss eine schwierige Wahl machen: halten den Kollimator und leiden unter sehr niedrigen Großbildschirmen Effizienz, oder entfernen Sie den Kollimator und Opfern, die Intensität der Anregungslicht für die Epifluoreszenz.

Hinweis: eine Cutaway-Diagramm zeigt das Lichtweg Schema für eine modifizierte Spectrofluorometer, die Mikroskopie für Großbildschirmen Lumineszenz und NIR Photolyse Modus und Epifluoreszenz und UV-Photolyse-Modus und der experimentelle Aufbau verwendet für dieses Experiment sind in Abbildung 2 dargestellt.

1. Equip Fluoreszenzmikroskop mit einem hellen Metalldampflampen Führer, in der Rückseite geleitet Port
   Hinweis: In diesem oberen Ebenen Lichtweg wo gibt es ein Cube-Turm, eine Position des Würfels leer NIR aus der unteren Klasse leichte Weg zu sein
2. Installieren einer abstimmbaren 0,5 bis 8,0 W 980 nm Laserdiode im rechts Hafen, mit Seitenanschluss Kollimator offen.
   Hinweis: Dies vergrößert die Laser Licht vor Ort, um etwa 500 µm im Durchmesser, wenn ein 10 X-Objektiv verwendet wird. Entfernen dieser Kollimator ergibt sich eine Mikrometer-Bereich Lichtfleck und NIR Zelle Bestrahlung unpraktisch macht. Diese Kollimator ist NIR-transparente.
3. Installieren Sie eine dichroitische Spiegel (850-nm-kurz-Pass) und eine Erregung Filter (950 nm lang-Pass) in der unteren Klasse Licht Weg
4. Verwenden eine UCNP-Lösung, um die NIR Lichtfleck zu visualisieren. Passen Sie die Position des Lasers zur Mitte des NIR-Lichtstrahls in das Sichtfeld um die Ausrichtung zu beenden.

3. Vorbereitung und Charakterisierung von Caged PKA-UCNP bauen

1. inkubieren rekombinante PKA (9 µM) mit 0,5 mM 2-Nitrobenzylbromide (BNB) in Käfighaltung Puffer (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl und 10 mM MgCl ₂; pH 8,5) für 1-2 h bei 25 ° C. Quench die überschüssige BNB mit 10 mM Dthiothreitol (DTT) und dann gegen 4-(2-Hydroxyethyl) Dialyse Piperazin-1-Ethanesulfonic Säure (HEPES) Puffer (10 mM, pH 7,5), um überschüssige Reagenzien und Salze zu entfernen.
   Hinweis: Der pH-Wert der festsetzende Lösung wird abgesenkt, von 8,5 bis 7,5 während der Dialyse mit HEPES pH 7,5 für die anschließende Ruhigstellung Reaktion.
2. Mix Lanthanid Salze-Y(CH₃CO₂) ₃ Hydrat (99,9 %, 0,4527 g, 1,38 Mmol), Yb (CH ₃ CO ₂) ₃-Hydrat (99,9 %, 0,2533 g, 0,60 Mmol) und Tm (CH ₃ CO ₂) ₃ Hydrat (99,9 %, 0,0168 g, 0,02 Mmol)-Octadecene (30 mL) und Ölsäure (12 mL), erhitzen Sie die Mischung auf 115 ° C für 30 min, und auf 50 ° c abkühlen Als nächstes lösen das Reaktionsgemisch in einer methanolischen Lösung (20 mL) mit 0,2 g (5.0 Mmol) von NaOH Pellet und 0,2964 g (8 Mmol) von Ammonium Fluorid durch Ultraschallbehandlung für 15 min. Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 300 ° C zu den UCNP Kern (β-NaYF ₄ : 1,0 % Tm ^{3 +} / 30 % Yb ^{3 +}) Nanopartikeln.
3. Lösen sich die Kern-Nanopartikel (25 mg) mit CO-520 (0,5 mL) in Cyclohexan (10 mL). Ammoniak (wt 30 % V/V, 0,08 mL) und Tetraethylorthosilicate (TEOS, 0,04 mL) und ständigem Rühren für 12 h bei Raumtemperatur zu Silikon-beschichtete β-NaYF ₄ gelten: 1.0%Tm ^{3 +} /30%Yb ^{3 +} Kern Nanopartikel.
4. Inkubieren der PKA-Wert (6 Nmol) oder PKA im Käfig (6 Nmol) mit UCNP (1 mg) ¹⁵ in HEPES-Puffer (10 mM, pH 7,5) bei 4 ° C für 3 h, der PKA-Wert auf Kieselsäure-beschichtete UCNP über elektrostatische Wechselwirkungen zu immobilisieren.
5. Filtern Sie das Gemisch mit PVDF-Filter (0,45 µm), Zentrifuge bei 17.000 x g für 10 min bei 4 ° C, und redisperse das Pellet in HEPES (50 µL, 10 mM, pH 7,5) mit 0,1 % Protein Stabilisator den gereinigten PKA-UCNP-Komplex zu erhalten. Bei 17.000 x g für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand für Bradford-Test in der 1,5-mL-Tube sammeln.
6. Analysieren die ungebundene PKA im Überstand rettete vor Schritt 3.5 mit Bradford-Test um Rücken-die PKA Substitution auf die UCNP Partikel, berechnen die haben normalerweise eine Substitution von ~ 4,5 Nmol der PKA pro mg Partikel.
   Hinweis: Der Bradford-Test offenbart eine starke blaue Farbe auf die Pellets, die eine Ebene und stabile proteinreichen Immobilisierung ohne Desorption schlägt, während die überstehende Teil eingesperrt PKA-UCNP Lösung zeigt eine Farbe ähnlich HEPES-Puffer ( Abbildung 4 c-4e).

4. Charakterisierung

Hinweis: die Kinase Assay wird verwendet, um die spezifische Aktivität von Pyruvat-Kinase zu quantifizieren. Kurz gesagt, führt die Phosphorylierung des Peptids, die Pyruvat-Kinase und Laktat-Dehydrogenase gekoppelt ist, bei der Oxidation von NADH. Bildung des letzteren wird überwacht durch die Messung des Rückgangs der Extinktion von NADH bei 340 nm.

1. Bestimmen Sie die Aktivität der PKA und PKA-UCNP in einem 60 µL Gesamtvolumen der Assay-Gemisch mit 4-Morpholinepropanesulfonic Säure (MOPS, 100 mM, pH 7,5), KCl (100 mM), Phosphoenolpyruvat (PEP, 1 mM), Adenosintriphosphat (ATP, 1 mM), β - Nicotinamid-Adenin-Dinucleotide, reduzierte Form (NADH, 0,8 mM), Magnesiumchlorid (MgCl ₂, 1 mM), Kemptide (0,4 mM) und eine Pyruvat-Kinase/Laktat-Dehydrogenase-Mischung (30/40 Einheiten der PK/LDH).
2. Messen die Abnahme der NADH-Absorption im Laufe der Zeit nach der Zugabe der PKA-Lösung (2 µL) an der Assay-Mischung. Berechnen Sie die Steigung der Linie direkt reflektieren die Aktivität der Kinase gemessen wird.
3. Messen die Aktivität der PKA-UCNP ¹⁵ und die gesamte Tätigkeit, die gut mit dem Produkt der Multiplikation native PKA-spezifische Aktivität und die berechnete PKA oberflächenbeschichteten Höhe abgeglichen werden sollen.

5. Photolyse Setup

1. MeasUre alle Kraft des Lichts Quellen mit einem thermischen Haufen Sensor und Leistungsdichten zu berechnen (PD = Leistung (W) / Bereich (cm ²)) ¹⁸ basierend auf den spot Hellraum.
2. In-vitro- UV-Photolyse Experimente durchführen, auf ein kommerzielles System mit 365 nm LED (200 mW/cm ²) ¹⁵.
3. Für UV-Photoaktivierungen auf den Mikroskoptisch, beleuchten die PKA-UCNP-Lösung mit das Anregungslicht gefiltert durch eine kommerzielle Cube ¹⁵.
   Hinweis: Die Leistungsdichte ist ~ 15 mW/cm ², ohne Objektiv Fokussierung.
4. Für in-vitro- NIR Photoaktivierungen auf den Mikroskoptisch, beleuchten die PKA-UCNP-Lösung mit einem 980 nm Laser mit maßgeschneiderten Großbildschirmen Filter/Spiegel-Einstellungen auf der unteren Klasse Lichtweg, dichroitische Spiegel (850 nm kurz-Pass), installiert und eine Erregung Filter (950 nm lang-Pass).
   Hinweis: Die Ausgabe Leistungsdichte ist 5 W/cm ² vor 4 X Objektiv konzentriert. Die Leistungsdichte wird auf geschätzt ~ 68 W/cm ² nach 4 X Objektiv Fokussierung.

6. Handy-Probenvorbereitung und Mikroinjektion der PKA-UCNP komplexe

1. Vorfilter die Proben durch einen 0,45 µm-Filter nach PKA Immobilisierung (Schritt 3,5).
2. Die Zellen im 10 % fetalen bovine Serum (FBS) mit L-15 Medium während des Zeitraums der Mikroinjektion für stabilen pH-Kontrolle außerhalb der Inkubator inkubieren.
   Hinweis: um die Mikroinjektion Abschluss bestätigen, Co injizieren die native PKA-UCNP, eingesperrte PKA-UCNP oder PEGylated UCNP (7,5 mg/mL) ¹⁵ mit 5 6-Carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) (10 µM) in Zellen.
3. Anpassen der Konzentration der PKA-UCNP Partikel, sodass nach Mikroinjektion, die cytosolische Konzentration 1-3 μM PKA - einen physiologischen Konzentrationsbereich für PKA in einer Zelle, mit der Annahme ist, dass das Injektionsvolumen 1/10 der zellulären Volumen .
4. Führen die Mikroinjektion in die Zellen (Schritt 6.2) mit einem Microinjector Gerät gekoppelt mit eine einachsige hydraulische Mikromanipulator ( Abbildung 3).
5. Verwenden eine digitale Manometer zur Überwachung des Drucks durch die Microinjector im operativen Bereich ist (~ 50-200 hPa) und verschließen Sie die Spender-Ventil in einer angepassten Druck auf Entschädigung Druck für die Mikroinjektion zu bieten. Ziehen Sie die Nadel mit einem Abzieher.
6. Halten den Einspritzdruck zwischen 50 und 75 hPa mit Injektion von 200-300 ms und der Entschädigung Druck bei 15 hPa Kulturmedium Rückfluss in Nadel durch Kapillarwirkung zu verhindern.
7. Die Spitze Öffnungen der Nadeln um sicherzustellen, dass sie einen Außendurchmesser zwischen 1,3 und 1,5 µm, die bestätigt werden kann, indem man Bilder mit einem 40 X Objektiv zu untersuchen.
8. Waschen der Zellen mit 2 mL L-15 Medium mit 10 % FBS nach der Mikroinjektion. Beobachten der zellulären Fluoreszenz-Bildgebung von 5 (6) - Carboxytetramethyl - Rhodamin (TAMRA) Mikroinjektion Abschluss bestätigen.

7. Photoaktivierungen von Caged PKA-UCNP mittels UV oder NIR Licht in lebenden Zellen

1. für UV-Photoaktivierungen nach der PKA-UCNP Mikroinjektion, wachsen die REF52 Zellen auf einem 3,5 µm-Teller und legen Sie sie auf den Mikroskoptisch bestrahlen sie mit UV-Licht gefiltert nach der Cube für 3 min ohne Fokussierung Objektiv.
   Hinweis: REF52 Zellen wurden in DMEM mit 10 % beibehalten FBS bei 37 ° C in einer 5 % CO ₂ Inkubator und Zellen waren subcultured als die Konfluenz bis zu 90 % alle 2-3 Tage erreicht.
2. Für NIR Photoaktivierungen nach PKA-UCNP Mikroinjektion, beleuchten die Zellen auf einem 980 nm Laser aus unteren Klasse Filter/Spiegel-Einstellungen, wie unter Punkt 5.4 beschrieben.
   Hinweis: Die Leistung Dichte ist 5 W/cm ² vor 10 X Objektiv mit Schwerpunkt und wird voraussichtlich 300 W/cm ² nach 10 x Objektiv mit Schwerpunkt. Großbildschirmen ist ein Prozess, der eine hohe Photonendichte erfordert vor allem, wenn eine größere Verschiebung der Anti-Stoke benötigt wird. Daher konzentriert ist erforderlich bei Photoaktivierungen.
3. Im Bedarfsfall ein größeren Lichtfleck (650 µm X 520 µm) bestrahlen diese Zellen mit NIR konzentriert durch ein 10 X-Objektiv mit einem Kollimator für 15 min. zulassen für eine dunkle Intervall von 5 min nach jeder 5-min-Bestrahlung, um Erwärmung zu vermeiden.
   Hinweis: Wenn eine hohe räumliche Auflösung (subzelluläre Lichtfleck) benötigt wird, verwenden Sie 40 X Objektiv mit einer Lochkamera in der Ausfahrt Ende des Lichtleiters installiert um einen Lichtfleck subzellulären Dimension (5 µm X 4 µm) zu generieren. In diesem Fall, 1 s der Bestrahlung reicht NIR Photoaktivierungen aufgrund der hohen Fluss der Photonen.
4. Nach UV oder NIR Photolyse, können die Zellen wieder in eine 5 % CO ₂ Inkubator bei 37 ° C für 1 h in kompletten Medium zelluläre Reaktionen erzeugen. Befestigen Sie sie anschließend in 1 mL 4 % Paraformaldehyd/Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) für 20 min vor weitere Färbung.
   Achtung: Paraformaldehyd ist hochgiftig; vermeiden Sie Kontakt mit Haut, Augen oder Schleimhäuten. Das Pulver bei Mess- und Vorbereitung Einatmen vermeiden.

8. Visualisierung von Stress Faser Zerfall verursacht durch NIR Photoaktivierungen

1. nach der Fixierung, Alexa 594-Phalloidin verwenden (5 µL 6,6 µM-Stammlösung 200 µL PBS für Färbung hinzufügen; 25 min bei Raumtemperatur inkubieren) zu färben und visualisieren Sie die Stress-Fasern. Visualisieren Sie die Bilder von Alexa 594-Phalloidin (Ex-581 nm/Em 609 nm) mit einer Filter-Set.
2. Brüten die Zellen für 5 min in 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) bei Raumtemperatur. Nach dem Färben, die Proben mit PBS waschen und fluoreszierende Bilder von Stress Fasern und Kerne einzeln nehmen.

Ergebnisse

Das Design des Konstrukts eingesperrte Enzym-UCNP ist in Abbildung 1dargestellt. Die PKA-Enzym wurde zunächst reagierte mit 2-Nitrobenzyl-Bromid, eine inaktive eingesperrte PKA zu generieren, und es war dann elektrostatisch auf der Oberfläche des UCNP immobilisiert. UCNPs hochkonvertiert Licht aussenden und somit photolytically Spalten die o-Nitrobenzyl Gruppen auf Cys 199 und Cys 343, generieren die aktivierte PKA. TEM Bilder und Bradford-Test bestätigt, ...

Diskussion

Zuvor, Hofmann und Kollegen zufolge dramatische morphologische Veränderungen nach der Mikroinjektion des freien PKA¹⁹REF52 Zellen beobachtet wurden. In einer anderen Studie die Lawrence-Gruppe gezeigt, dass eingesperrte PKA aktiviert in Vivo, kann führt zu morphologischen Veränderungen und den Zerfall der Stress Fasern bei UV-Photolyse²⁰. Früher berichtet über Ausbeutung hochkonvertiert UV-Licht zur Photoaktivierungen zeigten die Aktivierung der verschiedenen ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma	154563
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272
MOPS	Sigma	M1254
HEPES	Sigma	H4034
Sodium chloride	Sigma	31434
Potassium chloride	Sigma	12636
Yttrium acetate hydrate	Sigma	326046	Y(C2H3CO2)3 · xH2O
Thulium(III) acetate hydrate	Alfa Aesar	14582	Tm(CH3CO2)3 · xH2O
Ytterbium(III) acetate tetrahydrate	Sigma	326011	Yb(C2H3O2)3 · 4H2O
1-Octadecene	Sigma	O806
Oleic acid	Sigma	364525
Methanol	macron	304168
Sodium hydroxide	Sigma	30620
Ammonium fluoride	J.T.Baker	69804
IGEPAL CO-520	Sigma	238643
Cyclohexane	J.T.Baker	920601
Ammonium hydroxide (28% - 30%)	J.T.Baker	972101	Ammonia
Tetraethyl orthosilicate (TEOS)	Sigma	8658
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D0632
N-hydroxymaleimide (NHM)	Sigma	226351	PKA activity blocking reagent
Prionex protein stabilizer solution from hog collagen	Sigma	81662	Protein stabilizer solution
2-nitrobenzyl bromide (NBB)	Sigma	107794	PKA caging reagent
8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt	Sigma	C3912	8-CPT-cAMP
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle	Sigma	P0294	PK/LDH
Adenosine 5'-triphosphate disodium	Sigma	A2387	ATP
β-NADH reduced from dipotassium	Sigma	N4505
Phosphoenolpyruvate	Sigma	P7127	PEP
Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL	Thermo Scientific	23200	Bradford assay reagent
cAMP-dependent protein kinase	Promega	V5161	PKA activity control
pET15b-PKACAT plasmid	Addgene	#14921
pKaede-MC1 plasmid	CoralHue	AM-V0012
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo Scientific	10010023
DMEM, high glucose, pyruvate	Gibco	12800-017	Cell culture medium
Leibovitz L-15 Medium	Biological Industries	01-115-1A	Cell culture medium
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1A
Paraformaldehyde	ACROS	416785000
DAPI	Invitrogen	D1306	Nucleus staining dye
Alexa 594-phalloidin	Invitrogen	A12381	F-actin staining dye
5(6)-Carboxytetramethylrhodamine	Novabiochem	8.51030.9999
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23200
CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12,000 - 14,000 Da	Membrane Filtration Products, Inc.	1430-33	Dialysis membrane
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized	EMD Milipore	SLHVX13NL
Equipment
Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS	Malvern	M104
Transmission Electron Microscope	JEOL	JEM-1400
Fluorescence Spectrophotometer	Agilent Technologies	10075200	Cary Eclipse
UV-Vis Spectrophotometer	Agilent Technologies	10068900	Cary 50
Fluorescence Microscope	Olympus	IX-71
950 nm longpass filter	Thorlabs	FEL0950
850 nm dichroic mirror shortpass	Chroma	NC265609
RT3 color CCD system	SPOT	RT2520
Fluorescence Illumination	PRIOR	Lumen 200
980 nm Infra-red diode laser	CNI	MDL-N-980-8W
UV LED Spot Light Source	UVATA	UVATA-UPS412	With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2
Thermal pile sensor	OPHIR	12A-V1-ROHS
Picospritzer III	Parker Hannifin	052-0500-900	Intracellular Microinjection Dispense Systems
PC-10 Needle puller	Narishige	PC-10
MANOMETER Digital pressure gauge	Lutron	PM-9100
One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator	Narishige	MMO-220A
Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated	Thermo Scientific	75002421