Hypoxische Vorkonditionierung von Marrow-abgeleiteten Progenitor-Zellen als Quelle für die Erzeugung von reifen Schwann-Zellen

Zusammenfassung

Marrow Stromazellen (MSCs) mit neuronalen Potenzial gibt es im Knochenmark. Unser Protokoll bereichert diese Population von Zellen durch hypoxische Vorkonditionierung und leitet sie dann zu reifen Schwann-Zellen.

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt ein Mittel, um neuronale Progenitoren aus der Pop-Pop-Pop-Population (MSC) zu bereichern und danach auf das reife Schwann-Zellschicksal zu lenken. Wir unterwarfen Ratten- und menschliche MSCs vorübergehenden hypoxischen Zuständen (1% Sauerstoff für 16 h), gefolgt von einer Expansion als Neurosphären auf Niedrig-Attachment-Substrate mit epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) / basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) -Anpassung. Neurosphären wurden auf Poly-D-Lysin / Laminin-beschichtete Gewebekultur-Plastik ausgesät und in einem gliogenen Cocktail mit β-Heregulin, bFGF und Thrombozyten-Wachstumsfaktor (PDGF) kultiviert, um Schwann-Zell-ähnliche Zellen (SCLCs) zu erzeugen. Die SCLCs wurden für 2 Wochen mit gereinigten Dorsalwurzelganglien (DRG) -Neuronen, die von E14-15-schwangeren Sprague-Dawley-Ratten erhalten wurden, über die Kokultur gerichtet. Reife Schwann-Zellen zeigen die Persistenz bei der S100β / p75-Expression und können Myelinsegmente bilden. Auf diese Weise erzeugte Zellen haben das Potential aAnwendungen in autologen Zelltransplantationen nach Rückenmarksverletzungen sowie bei der Krankheitsmodellierung.

Einleitung

Die Transplantation von neuronalen Vorläufern und deren Derivaten zeigt Versprechen als Behandlungsstrategie nach traumatischer Nervenverletzung ^{1 , 2} und Neurodegeneration ^{3 , 4} . Vor der klinischen Anwendung ist es wichtig, i) eine Methode für den Zugang und die Erweiterung einer autologen Quelle von Stamm- / Vorläuferzellen und ii) ein Mittel, um sie auf relevante, reife Zelltypen zu lenken, zu gewährleisten. Unser Interesse an der Zelltherapie bei Rückenmarksverletzungen führte uns dazu, eine robuste, autologe Zellquelle neuraler Vorläufer aus adulten Geweben zu suchen.

Eine Subpopulation von MSCs stammt aus dem Neuralwappen und ist leicht aus der Markhöhle zugänglich. Diese Zellen sind neuronale Vorläufer, die Neuronen und Glia erzeugen können ⁵ . Tiermodelle der zerebralen Ischämie zeigen, dass Hypoxie die Prol Iferation und multipotenz der neuronalen progenitoren im gehirn ⁶ Dies war die Grundlage für die Verwendung der hypoxischen Vorkonditionierung als Mittel zur Ausweitung auf margen-abgeleitete neuronale Vorläufer.

Die Transplantation von Schwann-Zellen in das verletzte Rückenmark fördert die Regeneration ² . SCLCs können aus MSCs mittels Supplementierung mit gliogenen Faktoren ( dh β-Heregulin, bFGF und PDGF-AA) erzeugt werden, zeigen aber phänotypische Instabilität. Nach dem Abzug der Wachstumsfaktoren kehren sie zu einem fibroblastenähnlichen Phänotyp ^{7 zurück} . Phänotypische Instabilität ist bei der Zelltransplantation aufgrund des Risikos einer abweichenden Differenzierung und Karzinogenese unerwünscht. Da Schwann-Zellvorläufer mit Axonbündeln innerhalb des embryonalen peripheren Nervs ⁸ assoziiert sind, wurden wir zu kokulturen SCLCs mit gereinigten embryonalen DRG-Neuronen ^{7 ,}Ass = "xref"> 9 Die resultierenden reifen Schwann-Zellen sind schicksalhaft engagiert und zeigen die Funktion in vitro ^{7 , 9} und in vivo ¹⁰ .

Unser Protokoll für die Anreicherung von neuronalen Progenitoren aus MSCs ist einfach und effizient und führt zu einer Erhöhung der Zellzahl für nachfolgende Assays. Die Ableitung von Schicksal-engagierten Schwann-Zellen über die Coculture-Plattform ermöglicht die Untersuchung der Glia-Differenzierung und die Erzeugung von stabilen und funktionellen Schwann-Zellen für eine mögliche klinische Anwendung.

Protokoll

Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden in strikter Übereinstimmung mit dem NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und von dem Ausschuss für die Verwendung von lebenden Tieren für Lehre und Forschung, Li Ka Shing Fakultät für Medizin, der Universität von Hongkong genehmigt. Menschliche Knochenmarkproben wurden aus dem Beckenkamm gesunder Spender erhalten, nachdem sie eine einverstandene Einwilligung erhalten hatten. Die Protokolle wurden vom Institutional Review Board, der University of Hong Kong, genehmigt.

1. Vorbereitung der Ratten-MSC-Kulturen

1. Ernte von MSCs aus dem Femur
   1. Autoklavieren Sie alle Sektionswerkzeuge ( dh feines Sezierschere , Stumpfschneidschere und Zahnpinzette) bei 180 ° C für mindestens 2 Stunden vor dem Gebrauch.
   2. Bereiten Sie das MSC - Wachstumsmedium vor, das aus einer minimalen essentiellen Medium - Alpha - Modifikation (αMEM), ergänzt mit 15% fötalem Rinderserum (FBS) und Penicillin / Streptomycin (P / S, 1% v / v).
   3. Opfere junge männliche Sprague Dawley Ratten (200-250 g Körpergewicht) durch Pentobarbiton Überdosierung (240 mg / kg Körpergewicht, intraperitoneal).
      HINWEIS: Marrow-Proben von verschiedenen Ratten sollten separat verarbeitet werden.
   4. Lege die geopferten Tiere in Rückenlage. Reinigen Sie den Bauch und die unteren Gliedmaßen gründlich mit 70% Ethanol.
   5. Entfernen Sie die Haut und das subkutane Gewebe über die medialen Oberschenkel mit feinen Sezierscheren und Pinzetten. Entfernen Sie die Oberschenkelmuskeln in Umfangsrichtung, bis der Femur ausgesetzt ist. Setzen Sie diese proximal und distal fort, bis die Knie- und Hüftgelenke gesehen werden. Den Femur durch das Hüft- und Kniegelenk mit stumpfen Schneidscheren abtarchen.
      HINWEIS: Trense den Femur nicht, um die Markhöhle in diesem Stadium freizulegen. Übertragen Sie intakte Oberschenkel zu einer laminaren Strömung Gewebekultur Haube für die weitere Verarbeitung.
   6. Verwenden Sie stumpf gekippte Schneidscheren, um die distalen und proximalen Enden des Femurs durch die Metaphyse zu transectieren.
   7. Legen Sie einen 70 μm Zellsieb über ein 50 mL konisches Rohr. Setzen Sie eine 21 G, 10 mL Spritze mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, 10 mM Na ₂ HPO ₄ , pH 7,4) in den exponierten Femurkanal ein und spülen Sie den Markinhalt durch wiederholtes Spülen in das konische Röhrchen.
      HINWEIS: Etwa 20 ml PBS werden verwendet, um jeden Femur zu spülen. Wenn die Farbe des gespülten Inhalts blutverschmiert und trüb ist, kann ein größeres Volumen verwendet werden.
   8. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 480 xg für 5 min. Den Überstand verwerfen. Das Zellpellet wird in 10 ml MSC-Wachstumsmedium resuspendiert. Die Zellen auf eine 10 cm lange Gewebekultur schichten. Die Gewebekulturschalen in einen Zellinkubator (37 ° C, 5% CO ₂ ) geben. Notieren Sie den ersten Tag der Beschichtung als Tag 0.
      HINWEIS: In allen Schritten mit Zentrifugation die Bremse für maximale Verzögerung einstellen.
2. Etablierung und Erweiterung der MSC-Kolonien
   HINWEIS: Dieses Protokoll rElies auf Gewebekultur plastische Adhärenz als Mittel, um für MSCs aus der Markhöhle ¹¹ zu wählen. Der Knochenmarkgehalt darf 2 Tage lang an der Gewebekulturkunst haften.
   1. Am Tag 2 spülen Sie die Kulturplatten dreimal mit 10 ml PBS aus, um nicht-adhärente Zellen zu entfernen. Ersetzen Sie das PBS mit 10 ml MSC-Wachstumsmedium nach dem Spülen. Waschen Sie die Zellen mit PBS und füllen Sie mit MSC Wachstumsmedium alle 3 Tage auf.
      ANMERKUNG: MSC-Kolonien sollten am Tag 6-7 sichtbar sein ( Abbildung 2A ).
   2. Passage der Zellen bis zum Tag 10 durch Entfernen des Wachstumsmediums und Spülen der Zellen mit PBS. Zugabe von 1,5 ml rekombinantem enzymatischen Zelldissoziationsreagenz und inkubieren bei 37 ° C für 5 min. Füge 3 ml MSC-Wachstumsmedium hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren. Sammeln Sie die abgetrennten Zellen durch Zentrifugation bei 250 xg für 5 min.
   3. Quantifizierung der Zellen innerhalb des Pellets unter Verwendung eines Hämocytometers nach einer geeigneten Verdünnung in PBS.
   4. Samen passagierte Zellen mit einer Dichte von 40.000 Zellen / cm ² in eine 10-cm-Kulturplatte in MSC-Wachstumsmedium.
      HINWEIS: Ratten-MSCs sollten innerhalb von 2 Tagen nach Passage 80-90% Konfluenz erreichen (Abbildung 2B ). Zellen können wie in Schritt 1.2.2 für bis zu 8 Passagen beschrieben passagiert werden. MSCs können durch Immunzytochemie und ihre Fähigkeit zur Trilineage-Differenzierung charakterisiert werden (Abbildung 3 ) ¹² . Nur MSC-Kulturen zwischen den Passagen 3 und 8 unterliegen einer nachfolgenden hypoxischen Vorkonditionierung und einer neuronalen Progenitoranreicherung. MSCs mit größerer Durchgangszahl nehmen eine abgeflachte Morphologie an (Abbildung 2C ) und produzieren nicht genügend neuronale Vorläufer. Diese Kulturen sollten verworfen werden.

2. Vorbereitung von menschlichen BMSC-Kulturen

1. 1 ml humanes Knochenmark aspirieren mit 9 ml MSC Wachstumsmedium verdünnen und die Platte auftragenZellen auf einer 10-cm-Gewebekulturschale. Pflegen Sie die Kulturen in einem Zellinkubator (37 ° C, 5% CO ₂ ).
2. Entfernen Sie das Medium nach 2 Tagen und spülen Sie die Kulturen dreimal mit 10 ml PBS ab, um nicht-adhärente Zellen zu entfernen. Nach dem abschließenden Spülen das PBS entfernen und es mit 10 ml MSC-Wachstumsmedium ersetzen. Füllen Sie das Wachstumsmedium nach jeder 3 Tage Kultur nach dem PBS-Spülen auf.
   ANMERKUNG: MSC-Kolonien sollten am Tag 6-7 sichtbar sein. Die Anzahl der Kolonien kann zwischen den Fächern variieren.
3. Passage der Zellen am Tag 10, wie in Schritt 1.2.2 beschrieben. Quantifizierung der Zellen innerhalb des Pellets unter Verwendung eines Hämocytometers nach einer geeigneten Verdünnung in PBS. Die passierten Zellen mit einer Dichte von 40.000 Zellen / cm ² auf eine 10 cm-Kulturplatte im MSC-Wachstumsmedium absaugen.
   ANMERKUNG: Menschliche MSCs (Abbildung 2D ) zeigen eine ähnliche Morphologie gegenüber Ratten-MSCs und sollten ebenfalls innerhalb von 2 Tagen nach Passage 80-90% Konfluenz erreichen. Sie sollten chara seinDurch Immunzytochemie und ihre Fähigkeit zur Trilineage-Differenzierung ¹² . Wie bei Ratten-MSCs sind menschliche MSCs, die zwischen Passage 3 und 8 liegen, einer nachfolgenden hypoxischen Vorkonditionierung und neuronaler Progenitoranreicherung unterworfen.

3. Hypoxische Vorkonditionierung

1. Demontieren Sie die Hypoxiekammerkomponenten ( dh Basis, Deckel, Schalen) nach dem Lösen der Ringklemme und wischen Sie die Einzelteile mit 70% Ethanol ab. Legen Sie die Kammerkomponenten innerhalb einer laminaren Strömungsgewebekulturhaube zur Sterilisation unter UV-Licht für 15 min.
2. Vor der hypoxischen Vorkonditionierung, entfernen Sie das Medium und spülen Sie die Ratte und die menschlichen MSC-Kulturen (Abschnitte 1 und 2) mit 10 ml PBS. Ersetzen Sie das PBS durch 10 ml MSC-Wachstumsmedium, ergänzt mit 25 mM HEPES.
   ANMERKUNG: Die MSCs, die auf 10 cm Schalen gezüchtet wurden, sollten 80-90% Konfluenz erreicht haben, bevor sie einer hypoxischen Vorkonditionierung unterzogen werden.
3. Legen Sie die CulIn der Hypoxiekammer. Die Kammerteile wieder zusammenbauen und die Ringklemme festziehen. Spülen Sie ein Gasgemisch aus 99% N ₂ /1% O ₂ in die Kammer mit einer Durchflussrate von 10 l / min für 5 min.
4. Die Anschlussenden der Hypoxiekammer abdichten, um sicherzustellen, dass kein Gasaustritt besteht. Legen Sie die Kammer 16 Stunden lang in den Zellinkubator (37 ° C, 5% CO ₂ ).
5. Nach Beendigung der hypoxischen Vorkonditionierung, entfernen Sie die Kulturen aus der Kammer in Vorbereitung für die nachfolgende neuronale Progenitor Anreicherung Kultur.

4. Neural Progenitor Anreicherung Kultur

1. Bereiten Sie das neuronale Progenitor-Medium vor, das aus Dulbecco's modifiziertem Adlermedium / Ham-Nährstoffmischung F12 (DMEM / F12), ergänzt mit B27 (2% v / v), basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF, 20 ng / ml), epidermalem Wachstumsfaktor (EGF, 20 ng / ml) und P / S (1% v / v).
2. Trennen Sie die hypoxisch vorkonditionierten Ratten / menschlichen MSCs, wie in Schritt 1.2.2 beschrieben.Sammeln Sie die abgetrennten Zellen durch Zentrifugation bei 250 xg für 5 min. Quantifizierung der Zellen innerhalb des Pellets unter Verwendung eines Hämocytometers nach entsprechender Verdünnung in PBS.
3. Resuspendieren der Zellen in neuronalen Progenitor-Medium und Samen auf Low-Attachment, 6-Well-Platten mit einer Dichte von 6.000 Zellen / cm ² . Legen Sie die Kultur in einen Zellinkubator (37 ° C, 5% CO ₂ ) für 12 Tage. Füllen Sie 75% des neuronalen Vorläufermediums alle 3 Tage auf.
   HINWEIS: Größere, nicht adhärente Zellcluster sollten am Tag 6-7 beobachtet werden. Am Tag 10-12 können Neurosphären mit einem Durchmesser ≥ 100 μm beobachtet werden (Abbildung 4 ). Hypoxisch vorkonditionierte MSCs sollten mehr Neurosphären im Vergleich zu MSCs ergeben, die unter normoxischen Bedingungen kultiviert wurden ⁹ .
4. Sammeln Sie Neurosphären am Tag 12, indem Sie sie in eine 10-ml-Pipette absaugen und auf ein 15-ml-Kegelrohr übertragen. Zentrifugieren Sie die Neurosphären bei 250 xg für 5 min.
   HINWEIS: Neurosphären können seinCharakterisiert am Tag 12 für neuronale Vorläufer Marker, wie Nestin und GFAP ⁷ .

5. Erzeugung von Schicksal-engagierten Schwann-Zellen über Coculture mit DRG-Neuronen

1. Vorbereitung von gereinigten Ratten-DRG-Neuronen
   1. Autoklavieren Sie alle Sektionswerkzeuge ( dh Dissektionsscheren , Pinzetten, zwei Mikrodissektionszangen und Mikrodissektionsscheren) bei 180 ° C für mindestens 2 Stunden vor dem Gebrauch.
   2. Mantel 6-Well-Gewebekulturplatten mit Poly-D-lysin (PDL, 10 μg / ml in PBS) bei 4 ° C über Nacht. Entfernen Sie die PDL und spülen Sie mit 1,5 ml PBS pro Well.
   3. Gehen Sie mit der Beschichtung der Platten mit Laminin (10 μg / ml in PBS) bei 37 ° C für 2 h vor. Spülen Sie die Platten mit 1,5 ml PBS pro Vertiefung ab.
   4. Vorbereiten des DRG-Neuronen-Wartungsmediums, bestehend aus neurobasalem Medium, ergänzt mit B27 (2% v / v), L-Glutamin (1% v / v), Nervenwachstumsfaktor (NGF, 20 ng / ml) und P / S (1 % V / v).
   5. Vorbereiten des DRG-Neuron-Reinigungsmediums, bestehend aus neurobasalem Medium, ergänzt mit B27 (2% v / v), L-Glutamin (1%), NGF (20 ng / ml), P / S (1%), Fluorodeoxyuridin (FDU, 10 Μg / ml) und Uridin (10 & mgr; g / ml).
   6. Opfer schwangere Ratten am Gestationstag 14-15 durch pentobarbital Überdosierung (240 mg / kg Körpergewicht, intraperitoneal).
   7. Lege die geopferten Tiere in Rückenlage. Reinigen Sie den Bauch gründlich mit 70% Ethanol.
   8. Schneide die untere Bauchwand des Tieres in Längsrichtung mit feiner Sezierschere und Pinzette. Identifizieren und entfernen Sie den Uterus mit Sektionsschere. Schneide die Uteruswand, um die Embryonen auszusetzen und zu extrahieren. Übertragen Sie die Embryos in eine sterile, 10 cm Kulturschale mit PBS gefüllt. Legen Sie die Kulturschale auf Eis.
   9. Übertragen Sie den Embryo, der für die Sektion vorgesehen ist, in eine sterile, 10 cm große Kulturschale, die mit PBS (Raumtemperatur) gefüllt ist, und positionieren Sie sie unter einem Sektionsmikroskop. Haben Sie den Embryo in anfälliger Position.
      NICHTE: Das weißliche Rückenmark und die angehängten DRGs können über den dorsalen Aspekt des Embryos durch seine lichtdurchlässige Haut gesehen werden.
   10. Setzen Sie die Mikrodissektionszange auf beiden Seiten des Rückenmarks ein und verwenden Sie die stumpfe Dissektion, um das Abtasten des abweichenden Weichgewebes zu trennen. Schneiden Sie das Rückenmark frei von dem Tier mit Mikrodissektion Pinzette entlang der Halsöffnung und Heck Stummel. Führen Sie weitere stumpfe Dissektion über den ventralen Aspekt der Schnur, um es von umgebenden Weichgewebe zu befreien.
   11. Verwenden Sie Mikrodissektionszangen, um restliches Weichgewebe über den dorsalen Aspekt des befreiten Rückenmarks zu entfernen.
       HINWEIS: In diesem Stadium sollten nur das Rückenmark, Nervenwurzeln und angeschlossene DRG bleiben.
   12. Trennen Sie einzelne DRGs von ihren verbindenden Nervenwurzeln mit Mikrodissektionszangen. Verwenden Sie einen Pipettenstift, der an einer 1-ml-Spitze befestigt ist, um die DRGs in ein 1,5 ml steriles Zentrifugenröhrchen zu bringen, das PBS enthält.
       HINWEIS: Für jede 1,5 mL Röhre, maximal100 DRGs können untergebracht werden.
   13. Die DRGs bei 250 xg für 5 min zentrifugieren und in rekombinantem enzymatischen Zelldissoziationsreagenz (200 & mgr; l pro Röhrchen) resuspendieren. Inkubieren (37 ° C, 5% CO ₂ ) für 10 min. Die DRGs bei 250 xg für 5 min zentrifugieren, den Überstand entfernen und in DRG-Neuron-Wartungsmedium resuspendieren. Das Pellet wird durch sanftes Triturieren mit einer 200 μl Pipettenspitze abgetrennt. Die Zellen innerhalb des Pellets mit einem Hämocytometer nach einer geeigneten Verdünnung quantifizieren.
   14. Die Zellen mit einer Dichte von 5.000 Zellen / cm ² in PDL / Laminin-beschichtete 6-Well-Platten in 1,5 ml DRG-Neuron-Wartungsmedium pro Vertiefung absaugen. Nach zwei Tagen Kultur entfernen Sie das DRG-Neuron-Wartungsmedium, spülen mit PBS und ersetzen durch DRG-Neuron-Reinigungsmedium.
       HINWEIS: Für jeden Reinigungszyklus die DRG-Kulturen mit dem Reinigungsmedium für 2 Tage behandeln, gefolgt von einem Tag der Inkubation im Wartungsmedium. Nach 3-4 Reinigungszyklen, die remOval aller endogenen glia wird erwartet ⁷ Das dauert ca. 14 Tage. Gereinigte Kulturen testen positiv auf den neuronalen Marker TUJ1 und fehlen für die S100β-Expression (Abbildung 5 ).
2. Erzeugung von Schwann-Zell-Zellen
   1. Bereiten Sie das Gliainduktionsmedium, bestehend aus αMEM, ergänzt mit β-Heregulin (100 ng / ml), bFGF (10 ng / ml), Plättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF-AA, 5 ng / ml), FBS (10%) und P / S (1% v / v).
   2. Die in Abschnitt 4 hergestellten Neurosphären in PDL / Laminin-beschichteten 6-Well-Platten mit einer Dichte von 5-10 Kugeln pro cm ² in 1,5 ml Gliainduktionsmedium pro Well auftragen. Ersetzen Sie das Gliainduktionsmedium alle 2 Tage nach dem Spülen der Zellen mit PBS.
      ANMERKUNG: Zellen aus seedierten Neurosphären werden nach Tag 2 nach außen ausgewandert. Am Tag 7 haben die Migrationszellen ein verjüngtes Aussehen und sollten die Immunopositivität für die Schwann-Zelle nachweisenMarker p75 Neurotrophin Rezeptor (p75) und S100β ⁷ . Diese Zellen werden als SCLCs bezeichnet.
3. Kokultur von SCLCs mit DRG-Neuronen
   1. Bereiten Sie das Kokulturmedium vor, das aus dem DRG-Neuron-Wartungsmedium (Schritt 5.1.4) und dem Gliainduktionsmedium (Schritt 5.2.1) im Verhältnis 1: 1 Volumen-zu-Volumen besteht.
   2. Vorbereitung des Schwann-Zell-Wartungsmediums aus DMEM / F12, ergänzt mit FBS (5%), β-Heregulin (10 ng / ml) und P / S (1% v / v).
   3. Entfernen Sie das Kulturmedium von Tag 7 SCLCs, spülen Sie sie mit PBS und inkubieren Sie sie mit 0,5 ml / Vertiefung des rekombinanten enzymatischen Zelldissoziationsreagens bei 37 ° C für 5 min. Die SCLCs im Kokulturmedium resuspendieren.
   4. Die Zellen mit einem Hämocytometer nach einer entsprechenden Verdünnung quantifizieren.
   5. Die SCLCs auf gereinigte DRG-Neuron-Kulturen mit einer Dichte von 1.000 Zellen / cm ² säen. Halten Sie die Cocultures für 14 Tage, mit Medium Ersatz alle 2 Tage.
      HINWEIS: Während der Kokultur haben SCLCs die spindelartige Morphologie erworben, die typisch für reife Schwann-Zellen ist (Abbildung 6 ). Diese Zellen bestehen nach dem Entzug von Wachstumsfaktoren in ihrem Phänotyp und sind in der Lage, Axone in vitro und in vivo ^{7 , 10} zu myelinieren. Die Positivität der Schwann-Zellmarker ( dh p75 und S100β) sollte durch Immunfluoreszenz überwacht werden.
   6. Nach Beendigung der Kokultur, Passage-engagierte Schwann-Zellen, wie in Schritt 1.2.2 beschrieben. Verwenden Sie 0,5 ml Dissoziationsreagenz pro Vertiefung. Die Zellen mit einem Hämocytometer nach einer entsprechenden Verdünnung quantifizieren.
   7. Resuspendieren Sie Schicksal-engagierte Schwann-Zellen in Schwann-Zell-Wartungsmedium mit einer Dichte von 10.000 Zellen / cm ² . Samenzellen in PDL / Laminin-beschichtete 6-Well-Platten für Immunfluoreszenz.
      ANMERKUNG: Cocultures enthalten zwangsläufig MSCs, die einen Fibroblasten angenommen habenZelle Schicksal ⁷ . Diese Zellen werden zusammen mit Schicksal-engagierten Schwann-Zellen nach der Fertigstellung der Kokultur passagiert. Schwann-Zellen, die oben auf diesem Fibroblasten-Substrat liegen, können nach dem Spülen mit "kalten Strahlen" von PBS (4 ° C), wie es an anderer Stelle beschrieben wurde, leicht abgelöst und weiter ausgebaut werden. Schicksal-engagierte Schwann-Zellen können im Wartungsmedium für 1 Monat erweitert werden.

Ergebnisse

Eine Übersicht über die wichtigsten Stufen in unserem Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Zusammenfassend werden Ratten- und menschliche MSCs durch die Einhaltung von Gewebekulturplastik ausgewählt. Expandierte MSCs sind mit Hypoxie vorkonditioniert und unterliegen dann Neurosphären-bildenden Bedingungen. Neurosphären sind plattiert und können in SCLCs differenzieren. SCLCs werden mit gereinigten DRG-Neuronen cocultured, um Schicksal-engagierte S...

Diskussion

Es ist wichtig, die "Stämme" von MSCs vor der Anreicherung von neuronalen Vorläufern durch hypoxische Vorkonditionierung und Neurosphären-Kultur zu bewahren. Aus unserer Erfahrung können multipotenten MSCs zuverlässig durch ihre langgestreckte fibroblastenartige Morphologie identifiziert werden. Im Gegensatz dazu nehmen MSCs, die eine abgeflachte, viereckige Morphologie mit prominenten zytoskeletalen Stressfasern angenommen haben, nicht leicht neurales Zellschicksal an und sollte verworfen werden. Im Allg...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
αMEM	Sigmaaldrich	M4526
DMEM/F12	Thermofisher scientific	12400-024
Neurobasal medium	Thermofisher scientific	21103-049
FBS	Biosera	FB-1280/500
B27	Thermofisher scientific	17504-001
Epidermal growth factor (EGF)	Thermofisher scientific	PHG0313
Basic fibroblast growth factor (bFGF)	Peprotech	100-18B/100UG
Nerve growth factor (NGF)	Millipore	NC011
Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA)	Peprotech	100-13A
Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her)	Millipore	01-201
Uridine	Sigmaaldrich	U3003
5-Fluro-2' - deoxyuridine (FDU)	Sigmaaldrich	F0503
Poly-D-lysine (PDL)	Sigmaaldrich	P7886-1G
Laminin	Thermofisher scientific	23017015
GlutaMAX	Thermofisher scientific	35050061
Penicillin / streptomycin (P/S)	Thermofisher Scientific	15140-122
TrypLE Express	Thermofisher Scientific	12604-013
10 cm plate for adherent culture	TPP	93100	Used for selection of MSCs by tissue culture adherence
6-well plate for adherent culture	TPP	92006	Used for expansion of MSCs following passaging
UltraLow 6-well plate for non-adherent culture	Corning	3471	Used for neural progenitor enrichment
anti-human CD90(Thy-1)	BD Biosciences	555593
anti-human CD73	BD Biosciences	550256
anti-human/rat STRO-1	R&D Systems	MAB1038
anti-human nestin	R&D Systems	MAB1259
anti-human CD45	BD Biosciences	555480
anti-rat CD90(Thy-1)	BD Biosciences	554895
anti-rat CD73	BD Biosciences	551123
anti-rat nestin	BD Biosciences	MAB1259
anti-rat CD45	BD Biosciences	554875
Anti-S100β	Dako	Z031101
Anti-p75	Millipore	MAB5386
Anti-GFAP	Sigmaaldrich	G3893
Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1)	Covance	MMS-435P
Anti-Human nuclei	Millipore	MAB1281
Hypoxia chamber	Billups-Rothenberg	MIC-101
HEPES buffer	Sigmaaldrich	H4034-100G