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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Chromatin-endogene Spaltung, gekoppelt mit der Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChEC-seq), einer Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) -orthogonalen Methode zur Kartierung von Proteinbindungsstellen genomweit mit Mikrokokken-Nuklease (MNase) -Fusionsproteinen.

Zusammenfassung

Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen ist entscheidend für das Verständnis der Genregulation, des Chromatin-Remodelings und anderer Chromatin-residenten Prozesse. Die Formaldehydvernetzung, gefolgt von Chromatin-Immunpräzipitation und Hochdurchsatz-Sequenzierung (X-ChIP-Seq), wurde verwendet, um viele wertvolle Einblicke in die Genombiologie zu gewinnen. Allerdings hat X-ChIP-seq bemerkenswerte Einschränkungen im Zusammenhang mit Vernetzung und Beschallung. Native ChIP vermeidet diese Nachteile durch Weglassen der Vernetzung, führt aber oft zu einer schlechten Wiederherstellung von chromatingebundenen Proteinen. Darüber hinaus unterliegen alle ChIP-basierten Methoden Antikörperqualitätsüberlegungen. Enzymatische Methoden zur Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen, die die Fusion eines Proteins von Interesse für ein DNA-modifizierendes Enzym beinhalten, wurden ebenfalls verwendet, um Protein-DNA-Wechselwirkungen zuzuordnen. Wir haben vor kurzem eine solche Methode kombiniert, Chromatin endogene Spaltung (ChEC), mit High-Throughput-Sequenzierung als ChEC-seq. ChEC-seq beruht auf der Verschmelzung eines Chromatin-Assors(MNase), um eine zielgerichtete DNA-Spaltung in Gegenwart von Calcium in lebenden Zellen zu erzeugen. ChEC-seq basiert nicht auf Immunpräzipitation und umgibt damit potenzielle Bedenken bei der Vernetzung, Beschallung, Chromatin-Solubilisierung und Antikörperqualität bei gleichzeitiger hochauflösender Zuordnung mit minimalem Hintergrundsignal. Wir stellen uns vor, dass ChEC-seq ein mächtiges Gegenstück zu ChIP sein wird, das ein unabhängiges Mittel bietet, um sowohl ChIP-seq-Befunde zu validieren als auch neue Einblicke in die genomische Regulierung zu entdecken.

Einleitung

Die Abbildung der Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren (TFs), Chromatin-Remodelern und anderen chromatin-assoziierten regulatorischen Faktoren ist der Schlüssel zum Verständnis aller chromatinbasierten Prozesse. Während Chromatin-Immunpräzipitation und High-Throughput-Sequenzierung (ChIP-seq) Ansätze verwendet wurden, um viele wichtige Einblicke in die Genom-Biologie zu gewinnen, haben sie bemerkenswerte Einschränkungen. Wir haben vor kurzem eine alternative Methode eingeführt, die als Chromatin-endogene Spaltung und High-Throughput-Sequenzierung (ChEC-seq) 1 bezeichnet wird, um diese Nachteile zu umgehen.

ChIP-seq wird am häufigsten mit einem anfänglichen Formaldehyd-Vernetzungsschritt (X-ChIP-seq) durchgeführt, um Protein-DNA-Wechselwirkungen zu erhalten. Eine Reihe neuerer Studien haben jedoch gezeigt, dass X-ChIP-seq transiente oder unspezifische Protein-DNA-Wechselwirkungen 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , was zu falsch-positiven Bindungsstellen führt. Darüber hinaus schützt die Beschallung, die gewöhnlich verwendet wird, um Chromatin in X-ChIP-seq-Experimenten zu zersplittern, vorzugsweise Regionen von offenem Chromatin, was zu einer voreingenommenen Rückgewinnung von Fragmenten aus diesen Regionen 9 , 10 führt . Sonate liefert auch eine heterogene Mischung von Fragmentlängen, die letztlich die Bindungsstellenauflösung begrenzt, obwohl die Zugabe eines Exonuklease-Verdauungsschrittes die Auflösung 11 , 12 stark verbessern kann . Native ChIP-Verfahren wie besetzte Regionen von Genomen aus affinitätsgereinigtem natürlich isoliertem Chromatin (ORGANIC) 13 verwenden keine Vernetzung und Fragmentchromatin mit Mikrokokken-Nuklease (MNase), wodurch die mit der Formaldehydvernetzung und der Ultraschallbehandlung verbundenen potentiellen Biasen vermieden werden. Aber,Die Löslichkeit vieler chromatingebundener Proteine ​​unter den relativ milden Bedingungen, die für die native Chromatinextraktion erforderlich sind, ist schlecht, was möglicherweise zu einem verminderten Dynamikbereich und / oder falschen Negativen führt 14 .

Während verschiedene Iterationen von ChIP-seq am häufigsten für die genomweite Kartierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen verwendet werden, wurden auch mehrere Mapping-Techniken, die auf der Fusion von Proteinen interessiert sind, die für verschiedene DNA-modifizierende Enzyme von Interesse sind, implementiert. Ein solcher Ansatz ist die DNA-Adenin-Methyltransferase-Identifizierung (DamID) 15 , wobei ein interessantes chromatinbindendes Protein genetisch an Dam verdünnt ist und diese Fusion in Zellen oder Tieren exprimiert wird, was zu einer Methylierung von GATC-Sequenzen proximal zu Bindungsstellen für das Protein führt. DamID ist insofern vorteilhaft, als sie sich nicht auf Immunpräzipitation beruft und so Vernetzungsmittel, Antikörper oder Chromatin-Solubilisierung vermeidet. Es wird auch in vivo durchgeführt. aberIst die Auflösung von DamID auf die Kilobase-Skala beschränkt und die Methylierungsaktivität des Dam-Fusionsproteins ist konstitutiv. Eine zweite Methode, die auf einer enzymatischen Fusion basiert, ist die Calling Card-Seq 16 , die eine Fusion von einem Faktor von Interesse für eine Transposase einsetzt und die ortsspezifische Integration von Transposonen leitet. Wie DamID, Calling Card-Seq ist nicht auf Immunpräzipitation basiert und hat somit ähnliche Vorteile, mit dem zusätzlichen Vorteil einer erhöhten Auflösung. Jedoch kann Calling Card-seq durch Sequenzvorspannungen von Transposasen begrenzt werden und ist auch auf das Vorhandensein von Restriktionsstellen in der Nähe von Transposon-Insertionsstellen angewiesen.

Eine dritte enzymatische Fusionsmethode, die im Laemmli-Labor entwickelt wurde, ist die Chromatin-endogene Spaltung (ChEC) 17 . In ChEC wird eine Fusion zwischen einem Chromatin-assoziierten Protein und MNase in Zellen exprimiert, und bei der Calciumzugabe zur Aktivierung von MNase wird die DNA proximal zu den Bindungsstellen für die markierten markiertFaktor ( Abbildung 1 ). In Verbindung mit dem Southern-Blotting wurde ChEC verwendet, um die Chromatinstruktur und die Proteinbindung an einer Anzahl von einzelnen Loci in Hefe 17 , 18 zu charakterisieren, und wurde mit einer niederauflösenden Mikroarrayanalyse kombiniert, um die Wechselwirkung von Kernporenkomponenten mit der Hefe zu untersuchen Genom 19 ChEC bietet Vorteile wie DamID und Calling Card-seq, und seine Auflösung ist fast ein-Basis-Paar, wenn durch die Primer-Erweiterung 19 analysiert. ChEC ist auch kontrollierbar: Die robuste DNA-Spaltung durch MNase hängt von der Zugabe von millimolarem Calcium ab, wobei sichergestellt wird, dass MNase bei den niedrigen freien Calciumkonzentrationen, die in lebenden Hefezellen beobachtet werden, inaktiv ist.

Bisher haben wir postuliert, dass die Kombination von ChEC mit High-Throughput-Sequenzierung (ChEC-seq) hochauflösende Karten von TF-Bindungsstellen bereitstellen würde. In der Tat, ChEC-seq erzeugte hochauflösende Karten der angehenden Hefe allgemeine regulatorische Faktoren (GRFs) Abf1, Rap1 und Reb1 über das Genom 1 . Wir haben auch ChEC-seq auf den modularen Mediator-Komplex angewendet, einen konservierten, essentiellen globalen Transkriptions-Coaktivator 21 , der die Anwendbarkeit von ChEC-seq auf Megadalton-Komplexe erweitert, die nicht direkt mit DNA in Berührung kommen und durch ChIP- Basierte Methoden. ChEC-seq ist eine leistungsstarke Methode sowohl für die unabhängige Validierung von ChIP-seq-Ergebnissen als auch für die Erstellung neuer Einblicke in die Regulierung von Chromatin-residenten Prozessen. Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Umsetzung dieser Methode in knospende Hefe vor.

Protokoll

1. Erzeugung von Hefe-Stämmen

  1. Generieren Sie einen Hefe-Stamm mit dem Faktor von Interesse mit MNase getaggt.
    1. PCR amplifizieren die MNase-Tagging-Kassette aus dem gewünschten Vektor ( Tabelle 1 ) unter Verwendung des spezifizierten Reaktionsgemisches ( Tabelle 2 ) und der Zyklusbedingungen ( Tabelle 3 ). Mischen Sie 5 μl der PCR-Reaktion und 1 μl 6X DNA-Beladungsfarbstoff. Führen Sie jedes PCR-Aliquot auf einem 0,8% Agarosegel bei 120 V für 40 min. Die erwartete Produktgröße beträgt ~ 2,3 kb.
    2. Verwandeln Sie die verstärkte Markierungskassette mit der Standard-Lithiumacetattransformation 22 in die Dehnung der Wahl und führen Sie die Auswahl durch.
    3. Überprüfen Sie die korrekte Integration der Tagging-Kassette mit der Kolonie-PCR.
      1. Bereiten Sie das angegebene Reaktionsgemisch ( Tabelle 4 ) für die Anzahl der zu untersuchenden Kolonien vor. Halten Sie auf Eis, bis nötig.
      2. Wählen Sie einen Teil jeder Kolonie, um tes zu seinIn den Boden eines PCR-Röhrchens mit einem sterilen Zahnstocher oder Pipettenspitze.
      3. Mikrowelle die gepflückten Kolonien bei hoher Leistung für 1 min.
      4. Füge 50 μl PCR-Mischung ( Tabelle 4 ) zu jeder mikrowellengewundenen Kolonie hinzu und pipet auf und ab, um zu mischen. Durchführen der PCR unter Verwendung der angegebenen Zyklusbedingungen ( Tabelle 5 ).
      5. Mischen Sie die 50 & mgr; l PCR-Reaktion und 10 & mgr; l 6X DNA-Beladungsfarbstoff direkt in jedem PCR-Röhrchen. Führen Sie 10 & mgr; l jeder Probe auf einem 1% Agarosegel bei 120 V für 40 min. Die erwartete Produktgröße beträgt ~ 700 bp.
        HINWEIS: Wenn gewünscht, vergewissern Sie sich die entsprechende Expression des MNase-Fusionsproteins über Western-Blotting. Eine ~ 20,6 Kilodalton-Verschiebung im Molekulargewicht des markierten Proteins wird erwartet.
  2. Generieren Sie einen freien MNase-Stamm durch Homologie-basierte Klonierung des Promotors des Gens von Interesse in pGZ136 (Tabelle 1) und Transformation und Selektion wie in Schritt 1.1.2.
    1. AlternatiUm den Promotor des Gens von Interesse und 3xFLAG-MNase-SV40 NLS in einen Plasmidvektor zu versetzen, zu transformieren und wie in Schritt 1.1.2 auszuwählen und den Stamm in der geeigneten selektiven Bedingung für die Aufrechterhaltung des Plasmids zu wachsen.

2. ChEC

  1. Am Nachmittag / Abend des Tages vor dem ChEC-Experiment inokulieren 3 ml Hefe-Pepton-Dextrose (YPD) oder ein geeignetes selektives Medium mit einer einzigen Kolonie des Stammes, der den MNase-markierten Faktor trägt. Inkubieren Sie diese Kultur über Nacht (180 RPM Schütteln, 30 ° C).
  2. Am Morgen des Tages des ChEC-Experiments verdünnen Sie die Übernachtkultur in 50 ml Medium auf eine optische Dichte bei 600 nm (OD 600 ) von 0,2 - 0,3. Inkubieren Sie diese Kultur (180 RPM Schütteln, 30 ° C), bis sie eine OD 600 von 0,5-0,7 erreicht. Wenn sich die Kultur der entsprechenden OD 600 nähert, setzen Sie den Wärmeblock oder das Wasserbad auf 30 ° C und beginnen mit dem Auftauen von Puffer A-Additiven ( Ta6).
  3. 5 ml Puffer A plus Additive ( Tabelle 6 ) pro Kultur vorbereiten. Halten Sie den Puffer A bei RT während des Vorgangs.
  4. Bereiten Sie Mikrofugenröhrchen vor, die 90 μl Stopplösung ( Tabelle 7 ) und 10 μl 10% SDS für jeden zu sammelnden Zeitpunkt enthalten. Für jeden neuen Faktor analysiert, nehmen Sie Proben bei 0 s, 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min und 10 min.
  5. Dekantische Kultur in ein 50 ml konisches Röhrchen geben und bei 1.500 xg und Raumtemperatur (RT) für 1 min zentrifugieren.
  6. Die Zellen in 1 ml Puffer A sorgfältig resuspendieren und die resuspendierten Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Pellet resuspendierte Zellen in einer Mikrofuge bei 1.500 xg und RT für 30 s.
  7. Absaugen des Überstandes und sorgfältige Resuspendierung der Zellen in 1 ml Puffer A durch Pipettieren auf und ab. Pellet resuspendierte Zellen in einer Mikrofuge bei 1.500 xg und RT für 30 s. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
  8. Die Zellen in 570 μl Puffer A sorgfältig resuspendieren. 30 μl 2% Digitonin geben(0,1% Endkonzentration), um die Permeabilisierung der Zellen zu erleichtern und zu mischen.
  9. Permeabilisieren von Zellen in Hitzeblock oder Wasserbad bei 30 ° C für 5 min.
  10. Pipet die Reaktion auf und ab, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Entfernen Sie ein 100 & mgr; l Aliquot von permeabilisierten Zellen als Negativkontrolle zu einem Mikrofugenröhrchen, der Stopplösung und SDS enthält (Schritt 2.4) und vortexen, um kurz zu mischen.
  11. Füge 1,1 μl 1 M CaCl 2 (2 mM Endkonzentration) zu permeabilisierten Zellen hinzu, um MNase zu aktivieren und mehrmals schnell umzukehren oder kurz zu mischen. Sofort die gemischte Reaktion bei 30 ° C zurückgeben und einen Timer starten.
  12. Zu jedem Zeitpunkt, der gesammelt werden soll, pipettieren Sie die Reaktion nach oben und unten, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten, und entfernen Sie dann ein 100 & mgr; l Aliquot von permeabilisierten Zellen zu einem Mikrofugenröhrchen, der Stopplösung und SDS enthält, und kurz vor dem Mischen vorwischen. Für jeden neuen Faktor analysiert, nehmen Sie 0 s (kein CaCl 2 hinzugefügt), 30 s, 1 min, 2,5 min, 5 min und 10 min zeitpunkte.
    HINWEIS: ChEC-Experimente mit Faktoren, die schnell DNA bei 30 ° C spalten, können bei niedrigeren Temperaturen durchgeführt werden, um die MNase-Spaltkinetik zu verlangsamen.
  13. Sobald alle Zeitpunkte gesammelt wurden, fügen Sie 4 μl 20 mg / ml Proteinase K zu jeder Probe hinzu, werden vor kurzem zu mischen und bei 55 ° C für 30 min inkubieren.
  14. 200 μl 25: 24: 1 Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol zu jeder Probe geben, kräftig mischen und mit maximaler Geschwindigkeit und RT in einer Mikrofuge 5 min zentrifugieren.
  15. Entfernen Sie jede wässrige Phase (~ 150 μL) in ein neues Röhrchen. Fügen Sie 30 μg Glykogen und 500 μl 100% Ethanol hinzu. Vortex kräftig zum Mischen und Ausfällen auf Trockeneis für 10 min oder bis die Lösung viskos ist.
  16. Pellet präzipitierte DNA mit maximaler Geschwindigkeit und 4 ° C in einer Mikrofuge für 10 min.
  17. Dekantierte Überstände und Waschpellets mit 1 ml RT 70% Ethanol.
  18. Dekantisches Ethanol, Entfernen des Restes durch Invertieren einesIch schlage die Röhren auf ein Papiertuch. Die Proben mit einer Tischzentrifuge kurzspülen und eine Pipette verwenden, um restliches Ethanol zu entfernen, wobei darauf geachtet wird, dass das Pellet nicht gestört wird. Lufttrockenpellets bei RT für 5 min.
  19. Während die Pellets trocknen, machen Sie eine Mastermischung, um die getrockneten Pellets in 29 & mgr; l Tris, pH 8,0 + 1 & mgr; l von 10 mg / ml RNase A, erneut zu resuspendieren. Digit RNA bei 37 ° C für 20 min.
  20. Mischen Sie 1 & mgr; l 6X DNA-Beladungsfarbstoff mit 5 & mgr; l jeder Probe und laufen auf einem 1,5% Agarosegel bei 120 V für 40 min.

3. Größenauswahl

ANMERKUNG: Das Ziel der Größenauswahl besteht darin, Multi-Kilobase-Fragmente von genomischer DNA aus der zu sequenzierenden Probe zu entfernen und Fragmente von ~ 150 bp (etwa die Größe der nukleosomalen DNA) oder kleiner zu bereichern. Bei Sequenzierungsdaten werden Fragmente <400 bp angereichert, mit einem bemerkenswerten Peak um die Größe der nukleosomalen DNA (~ 150 bp) und einer Peak- oder breiten Verteilung von subnukleosomalen Fragmenten.

  1. Zu jeder Probe werden 75 μl Festphasen-Reversible Immobilisierungs- (SPRI) Perlen in einer Polyethylenglykol (PEG) -Lösung 23 gegeben und 10-fach pipettiert. Inkubieren der Perle: DNA-Mischung bei RT für 5 min.
  2. Während der SPRI-Perleninkubation werden Mikrofugenröhrchen, die 96 μl 10 mM Tris, pH 8,0 und 4 & mgr; l 5 M NaCl für jede Probe enthalten, hergestellt.
  3. Legen Sie die Röhrchen in eine magnetische Zahnstange, um Perlen auf der Seite des Rohres zu sammeln. Lassen Sie die Perlen auf der Seite des Tubus für 2 min zu sammeln.
  4. Übertragen Sie jeden Überstand in ein neues Röhrchen, das Tris und NaCl enthält (Schritt 3.2).
  5. Zugabe von 200 & mgr; l 25: 24: 1 Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol zu jeder Probe, Vortex zum Mischen und Zentrifugieren mit maximaler Geschwindigkeit und RT in einer Mikrofuge für 5 min.
  6. Entfernen Sie jede wässrige Phase zu einem neuen Röhrchen. Fügen Sie 30 μg Glykogen und 500 μl 100% Ethanol hinzu. 2 Minuten auf Trockeneis abfließen lassen oder bis die Lösung viskos ist.
  7. Pellet präzPitierte DNA mit maximaler Geschwindigkeit und 4 ° C in einer Mikrofuge für 10 min.
  8. Dekantüberstand und Waschpellets mit 1 mL 70% igem Ethanol.
  9. Dekantes Ethanol, Entfernen des Restes durch Umkehren und sanftes Klopfen der Rohre auf ein Papiertuch. Die Proben mit einer Tischzentrifuge kurzspülen und eine Pipette verwenden, um restliches Ethanol zu entfernen, wobei darauf geachtet wird, dass das Pellet nicht gestört wird. Lufttrockenpellets bei RT für 5 min.
  10. Restenzen der getrockneten Pellets in 25 μl Tris, pH 8,0. Bestimmen Sie die Probenkonzentration mit einem hochempfindlichen Assay. Für TF-ChEC-Experimente werden 10-100 ng DNA nach der Größenauswahl routinemäßig gewonnen.
  11. Bereiten Sie Sequenzierungsbibliotheken vor. Bibliotheksvorbereitungsprotokolle, die nicht auf die Größenauswahl angewiesen sind, wie zuvor beschrieben, sind wünschenswert, um eine Sequenzierung eines großen Bereichs von Fragmentgrößen (25-500 bp) zu ermöglichen.
  12. Sequenzbibliotheken im gepaarten Endmodus. Mindestens 25 Basen der Sequenz auf jedem Ende wird für eine hohe Qualität gelesenKartierung. Zwischen 1 und 2 Millionen Lesungen bietet eine ausreichende Deckung für eine ChEC-Probe.
    HINWEIS: Die Analyse von ChEC-seq Daten ist ein komplexes Verfahren und über den Rahmen dieses Artikels hinaus. Detaillierte Informationen zur Datenanalyse finden Sie in den vorherigen Publikationen 1 , 21 und die für die Analyse verwendeten benutzerdefinierten Skripte sind auf GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq) verfügbar. HOMER 25 (http://homer.salk.edu) kann auch für die Befehlszeilenanalyse von ChEC-seq-Daten verwendet werden.

Ergebnisse

Im Falle eines erfolgreichen ChEC-Experiments zeigt die Analyse von DNA durch Agarose-Gelelektrophorese eine Calcium-abhängige Zunahme der DNA-Fragmentierung über die Zeit, wie durch Verschmieren und eventuelle vollständige Verdauung der genomischen DNA angezeigt wird. In einigen Fällen wird eine Leiter von Bändern ähnlich wie bei einer traditionellen MNase-Verdauung nach längerer Verdauung beobachtet. Dies ist der Fall für die ChEC-Analyse von Reb1, einem allgemeinen regulatoris...

Diskussion

Wir haben gezeigt, dass ChEC verschiedene Klassen von Hefeproteinen auf Chromatin abbilden kann und antizipieren, dass es breit auf verschiedene Familien von TFs und anderen chromatinbindenden Faktoren in Hefe anwendbar sein wird. ChEC-seq ist insofern vorteilhaft, als es keine Vernetzung, Chromatin-Solubilisierung oder Antikörper erfordert. So vermeidet ChEC Artefakte, die potentiell in X-ChIP-seq vorhanden sind, wie das hyper-ChIPable Artefakt 3 , 4 und nativ...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Wir danken Moustafa Saleh und Jay Tourigny für die kritische Lektüre des Manuskripts und Steven Hahn und Steven Henikoff für Mentoring und Unterstützung bei der Entwicklung von ChEC-seq und deren Anwendung beim Mediator-Komplex. SG wird unterstützt von NIH Zuschüsse R01GM053451 und R01GM075114 und GEZ wird von Indiana University Startup Fonds unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
dNTPsNEBN0447
Q5 high-fidelity DNA polymeraseNEBM0491LOther high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.
TrackIt 1 Kb Plus DNA ladderThermoFisher Scientific10488085
Taq DNA polymeraseNEBM0273L
cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktailSigma-Aldrich11836170001It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit MNase cleavage by chelation of Ca2+.
PMSFACROS OrganicsAC215740010
Digitonin, High PurityEMD Millipore300410-250MGMake a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.
Proteinase K, 20 mg/mLInvitrogen25530049
RNase A, 10 mg/mLThermoFisher ScientificEN0531
Ampure XP beadsBeckman CoulterA63880Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).
MagneSphere magnetic rackPromegaZ5342

Referenzen

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