Hochmultiplexed, Super-Auflösung Bildgebung von T-Zellen mit madSTORM

Zusammenfassung

Wir zeigen eine Methode, um mehrere Moleküle innerhalb heterogener Nanostrukturen bei Einzelmolekülgenauigkeit unter Verwendung sequentieller Bindung und Elution von fluoreszenzmarkierten Antikörpern abzubilden.

Zusammenfassung

Die Imaging heterogener zellulärer Strukturen unter Verwendung einer Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie wurde durch unzureichende Lokalisierungsgenauigkeit und Multiplexfähigkeit behindert. Unter Verwendung von fluoreszierenden Nano-Diamant-Markierungsmarkern beschreiben wir die Driftkorrektur- und Ausrichtungsverfahren, die erforderlich sind, um eine hohe Präzision in der Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie zu erhalten. Zusätzlich wird eine neue Multiplex-Strategie, madSTORM, beschrieben, bei der mehrere Moleküle in der gleichen Zelle mit sequentieller Bindung und Elution von fluoreszierenden Antikörpern gerichtet werden. MadSTORM wird auf einer aktivierten T-Zelle demonstriert, um die Orte verschiedener Komponenten innerhalb einer membrangebundenen, Multi-Protein-Struktur, die so genannte T-Zell-Rezeptor-Mikrocluster, zu visualisieren. Darüber hinaus wird die Anwendung von madSTORM als allgemeines Werkzeug zur Visualisierung von Multi-Protein-Strukturen diskutiert.

Einleitung

Es wurde eine Vielzahl von Super-Auflösungs-Mikroskopietechniken entwickelt, um die Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie (~ 200 nm) zu überwinden. Darunter befindet sich eine Kategorie von Techniken, die als Singlemolekül-Lokalisierungsmikroskopie (SMLM) bezeichnet werden, die eine Photoaktivierungslokalisierungsmikroskopie (PALM) und eine stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) umfasst. SMLM-Techniken teilen sich bei der Verwendung von Fluorophoren, die zwischen auf (fluoreszierenden) und aus (dunkel / foto geschalteten) Zuständen umgeschaltet werden können, was eine sequentielle Lokalisierung der Fluoreszenz von einzelnen Molekülen ^{1 , 2 , 3 ermöglicht} .

Aufgrund seiner Kompatibilität mit handelsüblichen Farbstoffen und Mikroskopen ist direkt STORM (dSTORM) zu einer weit verbreiteten SMLM-Technik geworden ⁴ . DSTORM kann routinemäßig ~ 10 nm Lokalisierungsgenauigkeit erreichen, definiert als die Unsicherheit bei der Berechnung des Zentrums eines BeugensIonen-begrenzte Punktspreizfunktion (PSF). Trotz der hohen Genauigkeit, die mit den Lokalisierungsalgorithmen ^{5 , 6 , 7} geschätzt wird ^, wurde eine genaue Bestimmung der tatsächlichen Lage einzelner Moleküle durch eine Reihe von Problemen behindert. Zunächst fügt eine mechanische Bewegung des Mikroskopstadiums während der Bildaufnahme eine erhebliche Unsicherheit zur Lokalisierungsgenauigkeit hinzu. Da SMLM-Bilder über Tausende von Zeitraffer-Frames erhalten werden, können nanoskalige Bewegungen des Mikroskopstadiums die Präzision des endgültigen Superauflösungsbildes erheblich beeinträchtigen ⁸ . Um die Bühnenbewegung während der Bilderfassung zu kompensieren, wird die Bühnendrift üblicherweise aus der regressionsbasierten Anpassung von Binned-Lokalisierungen aus dem Bild selbst (Kreuzkorrelation) oder sequentiellen Lokalisierungen von fiducial-Markern (Referenzkorrektur) ^{1 , 9} geschätzt. HowevDiese Methoden erfordern die Optimierung mehrerer Parameter für jeden Bildstapel und können keine Bühnenbewegungen bei kurzen Zeitskalen wie mechanische Vibration berücksichtigen. Gold-Nanopartikel und mehrfarbige fluoreszierende Perlen wurden als Fiducial-Marker in SMLM verwendet, sind aber nicht lichtstabil und führen zu einer deutlich geringeren Präzision nach Driftkorrektur als die eingesetzten Stickstoff-Vakanz-Zentrum-Fluoreszenz-Nanodiamanten (FNDs) In madSTORM ¹⁰

Neben der Beugungsgrenze wird die Lichtmikroskopie durch spektrale Grenzwerte weiter eingeschränkt. Die gleichzeitige Visualisierung mehrerer Targets erfordert fluoreszierende Sonden mit nicht überlappenden Spektralprofilen, die in der Regel die Fluoreszenz-basierte Lichtmikroskopie auf 6 Farben und SMLM auf 2-3 Farben ^{4 , 11 , 12 beschränken} . Darüber hinaus verursacht eine nichtlineare chromatische Aberration eine Fehlausrichtung von mehrfarbigen Bildern, wDie umfangreiche Ausrichtungsverfahren mit mehrfarbigen Markierungen ^{8 , 13} erfordern. Um diese Grenzen zu überwinden, haben frühere Studien mehrere Targets unter Verwendung eines wiederholten Photobleichens oder chemischen Quenchens von sequentiell gebundenen Fluorophoren ^{14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19} abgebildet. Während diese Verfahren die spektralen Grenzen der Mikroskopie überwinden können, ist das Fluoreszenzbleichen bekannt als ein toxisches Verfahren ²⁰ , und ein verlängertes Bleichen oder Abschrecken kann unerwünschte Nebenwirkungen wie den Verlust der Vernetzung verursachen. Darüber hinaus könnte die Anhäufung von fluoreszierenden Sonden zu einer sterischen Blockierung von Bindungsstellen in der Probe führen, was ein großflächiges Multiplexen und ein robustes Targeting von Epitopen verhindert. Um eine solche sterische Störung zu vermeiden,Tudy erreichte Multiplexing mit stochastischem Austausch von frei diffundierenden Proteinfragmenten ²¹ . Während dieses Verfahren eine dichte Markierung von zellulären Strukturen ermöglicht, erfordert es eine umfangreiche biochemische Präparation, um Peptidfragmente zu isolieren, kann keine Einzelmolekülpositionen lokalisieren und erleichtert nicht leicht das Multiplexen mit großem Maßstab unter Verwendung von handelsüblichen Sonden. Wir präsentieren ein detailliertes Video-Protokoll, das die sequentielle Bindung und Elution von fluoreszierenden Antikörpern für gemultiplexte, antikörpergrßenbeschränkte dSTORM (madSTORM) -Bildgebung und die Verwendung von fluoreszierenden Nanondiamanten beschreibt, um eine präzise Driftkorrektur und Ausrichtung zu erreichen.

Protokoll

Achtung: Bitte konsultieren Sie vor dem Gebrauch alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS). Mehrere der in diesem Protokoll verwendeten Chemikalien sind toxisch und krebserregend. Bitte wenden Sie bei der Durchführung des Protokolls alle geeigneten Sicherheitshinweise an, einschließlich des Einsatzes von Ingenieurkontrollen (Dunstabzugshaube, Handschuhfach) und persönlicher Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Laborkittel, Volllängenhose, Zeltschuhe).

1. Multiplexed Imaging von aktivierten T-Zellen

1. Direkt konjugierte Antikörper mit Alexa-647 (A647) -Farbstoff unter Verwendung des Alexa 647 Antikörper-Markierungskits. Befolgen Sie das Etikettierungsprotokoll des Herstellers.
   HINWEIS: Die Dialyse der Antikörperlösung in 1x PBS wird vor diesem Schritt empfohlen, um die Antikörper-Markierungseffizienz zu erhöhen.
2. Spin markierte Antikörper für 5 min bei 20.800 rcf und sammeln Überstand, um aggregierte Antikörper zu entfernen.
3. Vorbereitung von fluoreszierenden nanondiamantbeschichteten Deckgläschen 4-Well-Deckglaskammern (siehe Reagenz / Materialliste) mit 250 μl 0,01% Poly-L-Lysin (PLL) für 15 min, aspirieren und bei 65 ° C für 30 min trocknen. (Kein Spülen vor dem Trocknen).
4. Vorbereitung einer Verdünnung von 100 nm FNDs in 1x PBS. Testen Sie verschiedene Verdünnungen, um sicherzustellen, dass genügend FNDs sichtbar sind, jedes Sichtfeld in Schritt 1.2.7 (wir verwenden eine 1: 200 Verdünnung von FNDs, die vom Hersteller bereitgestellt werden).
5. Vortex die verdünnten FNDs für 1 min.
6. Sonde den FND-Überstand für 30 s bei einer Hochleistungseinstellung.
7. Inkubieren Sie den beschallten FND-Überstand in einer PLL-beschichteten 8-Well-Deckglaskammer für 30 min bei Raumtemp.
8. 5x mit 1x PBS waschen und die FND-beschichtete Kammer mit 647 nm Laseranregung am TIRF-Mikroskop visualisieren. Idealerweise sollten 4-10 einzelne FNDs in einem Sichtfeld sichtbar sein, da die entsprechende Verdünnung der FNDs in Schritt 1.2.2 (wir verwenden ein 100X-Objektiv mit 256 x 256 Kamera-Pixel-Einstellung, um ein 61 x 61 μm-Sichtfeld zu ergeben) mitMindestens eine FND, die in jedem Quadranten des Bildgebungsfeldes vorhanden ist. Wenn die FNDs gruppiert sind ( dh FNDs mit deutlich höherem Signal als umgebende FNDs und eine Punktspreizfunktion größer als 200 nm), zentrifugieren FNDs bei 6.800 rcf für 1 min und wiederholen das Beschichtungsverfahren unter Verwendung des FND-Überstandes.
9. Füge 250 μl anti-CD3-Antikörper (10 μg / mL) in jede Vertiefung zu und inkubiere für 1 Stunde bei 37 ° C oder über Nacht bei 4 ° C.
10. Lösung entfernen und 1x PBS für 30 Sek. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 5 mal (waschen Sie 5x).

Aktivierung von Jurkat-T-Zellen

1. 1 ml Jurkat-T-Zellen bei 800 rcf für 6 min spinnen und in 300 μl 1x HBS-Lösung resuspendieren. Jurkat-T-Zellen sollten idealerweise in einer Konzentration von 0,5-1,0 x 10 & sup6; Zellen / ml vor dem Spinnen liegen. 1x HBS-Lösung besteht aus HEPES-Puffersalzlösung mit 1% Rinderserumalbumin, wie zuvor beschrieben ²² .
2. Füge 150 μl hinzuVon 1x HBS-Lösung in jeder Vertiefung und inkubieren bei 37 ° C für 15 min.
3. Füge 50 μl resuspendierte Jurkat T-Zellen zu jeder Vertiefung hinzu und inkubiere für 3 min bei 37 ° C.
4. Füge 300 μl 4% Paraformaldehyd zu jeder Vertiefung hinzu und inkubiere für 30 min bei 37 ° C.
5. Waschen 3x mit 1x PBS.
6. Permeabilisieren von Zellen durch Zugabe von 250 μl 0,1% Triton-X-Lösung für 5 min bei Raumtemp.
7. Waschen 3x mit 1x PBS.
8. Füge 250 μl 1% Fisch-Gelatinelösung in 1x PBS zu jeder Vertiefung für 30 min bei Raumtemp.
9. Waschen 3x mit 1x PBS.

Imaging aktiviert Jurkat T-Zellen mit madSTORM

1. Zugabe von 200 μl markiertem Antikörper bei 0,1-0,5 μg / ml zu fixierten Zellen für 1 Stunde bei Raumtemp.
2. Waschen 5x mit 1x PBS.
3. Füge 1 ml STORM-Puffer hinzu und decke die Kammer mit einem Glasdeckel ab, um die Einwirkung von Luft zu begrenzen. Der STORM-Puffer wurde zuvor beschrieben ¹⁰ . Wir empfehlen maKönig neue STORM Puffer für jede Runde der Bildgebung und Spinnen der STORM Puffer bei 20.800 rcf für 2 min, um Präzipitate zu entfernen.
4. Mit einer niedrigen 647-nm-Laserleistung im TIRF-Modus finden Sie eine gefärbte Zelle mit mindestens 3 FNDs im Sichtfeld. Um bei der Lokalisierung von FNDs zu helfen, kann eine gleichzeitige Erregung mit 568 nm Laser verwendet werden, um die Helligkeit des FND-Signals zu erhöhen.
   HINWEIS: Die in Abschnitt 2.1 beschriebene Leistung der gemittelten Referenzkorrektur verbessert sich durch die Aufnahme von mehr FNDs.
5. Erhöhen Sie 647 nm Laserleistung und erwerben Sie Bilder. Normalerweise erwerben wir 10.000 Frames bei 200 ms Belichtung, 125 mW 647 nm Laser, 100X TIRF Objektiv (1,49 NA), 100X EM Verstärkung (5 MHz bei 16 Bit, Umwandlungsverstärkung 1). Details zu unserem Bildaufbau wurden bereits beschrieben ¹⁰ .
6. Waschen 5x mit 1x TBS.
7. Füge 1 ml o hinzu(3,5 M MgCl ₂ , 20 mM PIPES, 0,1% Tween-20, pH 6,5) und inkubieren bei Raumtemperatur für 1 min.
8. Wiederholung der Elution 3 mal. (Genaue Elutionsbedingungen und die Anzahl der Elutionsspülungen, die benötigt werden, um das Signal zu entfernen, müssen für jeden verwendeten Antikörper überprüft werden).
9. 3x mit 1x TBS waschen und 1 ml 1x PBS zugeben.
10. Photobleach unter Verwendung von 647 nm Laser bei hoher Leistung (125 mW) mit 405 nm Laser bei 2-5 mW, um A647 Farbstoffe im Dunkelzustand zu aktivieren. Warten Sie, bis alle verbleibenden Signale von nicht-eluiertem Antikörper photobleichen. Typischerweise dauert dies 2-5 s Laserbelichtung. Erfassung von Beispielbildern (~ 100 Frames) mit den STORM-Einstellungen in 1.3.5 nach der Elution und Photobleaching wird empfohlen, um das Entfernen des Signals zu bestätigen.
    Normalerweise entfernen wir 99,8% des Signals mit dieser Methode. Wir empfehlen die Prüfung der Elutionseffizienz jedes Antikörpers vor der Verwendung in madSTORM wie zuvor gezeigt ¹⁰ .
11. Füge 250 μl 4% Paraformaldehyd für 15 min hinzu. Diese prEreignisse reverse Vernetzung von festen Molekülen in der Zelle.
12. Waschen 3x mit 1x PBS.
13. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.1-1.3.12 für die sequentielle Etikettierung mehrerer Ziele. Fig. 1 zeigt ein zusammengesetztes Bild von mehreren Molekülen in einer aktivierten Jurkat-T-Zelle, die unter Verwendung von madSTORM erhalten wurde.

2. Driftkorrektur und Ausrichtung von Multiplex-Bildstapeln

1. Driftkorrektur von madSTORM Bildstapeln
   1. Öffnen Sie Bilder mit ImageJ. Wir empfehlen, die Bilddateien vor dem Öffnen in ImageJ in ein TIFF-Format umzuwandeln. Verwenden Sie den Rechteck ROI, um eine einzelne FND auszuwählen. Spielen Sie die Zeitspanne, um sicherzustellen, dass die FND in jedem Rahmen des Bildstapels sichtbar ist. Verwenden Sie Run-Analyse im ThunderSTORM-Plugin, um die FND zu lokalisieren. Für die gemittelte Referenzkorrekturmethode, die in 2.1.5 beschrieben ist, ist es wichtig, dass in jedem Bildrahmen eine einzelne FND lokalisiert ist ( dh die Anzahl der identifizierten Peaks sollte e seinQual auf die Anzahl der Frames).
   2. Wenn die FND nicht in jedem Frame identifiziert wird, wählen Sie eine andere FND. Wenn sich mehrere Peaks in einem einzigen Frame befinden, entfernen Sie den Peak, der am meisten von früheren Peaks abweicht.
   3. Wiederholen Sie 2.1.2 für jede FND im Bildstapel. Denken Sie daran, dass einige FNDs nicht in den Drift-Korrekturprozess einbezogen werden sollten, damit sie als unabhängiges Messgerät für Driftkorrekturgenauigkeit dienen können, wie in Schritt 2.1.7 beschrieben.
   4. Für eine schnellere, weniger präzise Driftkorrektur verwenden Sie entweder die in ThunderSTORM enthaltenen Kreuzkorrelations- oder Fiducial-Korrekturalgorithmen, um die FND-Bilder zu korrigieren. Typischerweise verwenden wir 100 Bins, 5-Vergrößerungen und 0,1 Trajektorien-Glättungsfaktor für die Kreuzkorrelation und 10 max Distanz, 0,1 min Marker Sichtbarkeit und 0,01 Trajektorien Glättungsfaktor für die Referenzkorrektur. Kreuzkorrelation und Referenzkorrektur ergibt eine Korrekturdatei, die auf andere FNDs angewendet werden kann, um die Driftkorrekturgenauigkeit zu testen.
   5. Für eine strengere, präzisere Driftkorrektur, verwenden Sie den gemittelten Fiducial Korrektur (AFC) Algorithmus wie zuvor beschrieben ¹⁰ . Dieser Prozess erfordert keine Optimierung von Parametern und liefert eine höhere Lokalisierungsgenauigkeit als durch SMLM-Lokalisierungsalgorithmen vorhergesagt. Die gemittelte Driftkorrektur erfordert jedoch mindestens 4 FNDs und die FNDs in jedem Frame des Bildstapels lokalisiert werden. Die AFC-Driftkorrektur führt mit der Aufnahme von mehr FNDs besser aus, da eine große Anzahl lokalisierter FNDs die verzerrende Wirkung eines Ausreißerpeaks in einem gegebenen Rahmen verringern wird.
   6. Lokalisieren Sie alle Punktspreizfunktionen innerhalb des Bildstapels mit ThunderSTORM wie zuvor beschrieben ¹⁰ . Wir verwenden typischerweise eine Pixelgröße von 100 nm, Photoelektronen pro A / D-Zählwert von 4,28, Basispegel A / D-Zählwert von 100, EM-Verstärkung von 100, PSF: Integrierte Gaußsche Lokalisierung, 5-Pixel-Anpassungsradius, Maximum-Likelihood-Anpassungsmethode und 1,3 Pixel initial sigma
   7. Wenden Sie den von FNDs erfassten Driftkorrekturfaktor auf Lokalisierungen aus dem gesamten Bildstapel an. Überprüfen Sie das endgültige Bild, um eine korrekte Driftkorrektur zu gewährleisten ( Abbildung 2 ). Der resultierende Driftkorrekturfaktor sollte unabhängig auf FNDs getestet werden, die nicht in der AFC-Prozedur enthalten sind, um den Grad der Driftkorrekturgenauigkeit zu messen. Die Genauigkeit von driftkorrigierten, unabhängigen FNDs sollte nahe dem durchschnittlichen Präzisions- / Unsicherheitswert liegen, der aus dem in Schritt 2.1.6 verwendeten Lokalisierungsalgorithmus berechnet wurde.
   8. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.1-2.1.7 für die madSTORM-Bildstapel von sequentiell markierten Antikörpern. Denken Sie daran, dass die Lokalisierung des gleichen Satzes von FNDs in jedem madSTORM-Bildstapel für das folgende Ausrichtungsverfahren entscheidend ist.
2. Ausrichtung von madSTORM Bildern
   1. Berechnen Sie die Schwerpunktposition der Drift-korrigierten FNDs in jedem madSTORM-Bild. Um dies zu tun, finden Sie die mittlere x und y-Achse poFür jede lokalisierte FND und durchschnittlich die mittleren x- und y-Positionen aller FNDs in jedem madSTORM-Bild. Der detaillierte Algorithmus für diesen Schritt wurde zuvor beschrieben ¹⁰ . Ausrichten von sequentiellen madSTORM-Bildern unter Verwendung der Schwerpunktpositionen von FND-Markierungen. Um die Ausrichtung durchzuführen, berechnen Sie den Versatz zwischen zwei lokalisierten madSTORM-Bildern, indem Sie die Schwerpunktposition von FNDs im zweiten madSTORM-Bild von der ersten subtrahieren. Dann subtrahiere den Offsetbetrag von allen Lokalisierungen im zweiten madSTORM-Bild.
   2. Wir empfehlen, das erste madSTORM-Bild als Referenzbild zu verwenden und diesen Ausrichtungsschritt zwischen dem ersten und dem dritten, dem ersten und dem vierten usw. zu wiederholen . Testen Sie die Ausrichtungsgenauigkeit, indem Sie den Versatz zwischen FNDs messen, die nicht im Ausrichtungsprozess enthalten sind. Große Offsets können darauf hindeuten, dass verschiedene Sätze von FNDs verwendet wurden, wenn die Schwerpunktpositionen von sequentiellen madSTORM-Bildern berechnet wurden.
   3. Wenn ja, Schritte 2.2.1-2.2.2 shouLd wird mit demselben Satz von FNDs wiederholt, um die Ausrichtung durchzuführen.
      HINWEIS: Es werden benutzerdefinierte Codes für die AFC-Driftkorrektur- und Ausrichtungsverfahren bereitgestellt.

Ergebnisse

Das sequentielle Elutions- und Färbeverfahren wurde verwendet, um das gemultiplexte madSTORM-Bild von Mikroclustern und anderen Strukturen in einer aktivierten Jurkat-T-Zelle zu erzeugen ( Fig. 1 , Kontrollfigur-Ausrichtungen). Jedes pseudofarbige Bild repräsentiert eine Runde der madSTORM-Bildgebung, die in den Schritten 1.1.1 bis 1.3.13 erworben wurde. Wie zuvor beschrieben, sollte das Sichtfeld auf Restsignal von vorherigem, nicht-eluiertem Antikörper ...

Diskussion

Die sequentielle Multiplex-, Driftkorrektur- und Ausrichtungsprozeduren in madSTORM ermöglichen eine präzise, ​​hochmultiplexierte Visualisierung heterogener Strukturen in Zellen. ¹⁰ Darüber hinaus vermeidet madSTORM die Einschränkungen von mehrfarbigem STORM wie chromatische Aberration und suboptimale Photoscharter / Emissionseigenschaften von nicht-fernen roten Farbstoffen ^{9 , 12} . Da der Elutionsschritt die sterische Interferen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
8 well coverslip chamber	Lab-tek	155409
0.1% Poly-L-Lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920
NV-100 nm Fluorescent Nano-diamond	Adamas	Red FND
anti-CD3ε antibody	BD Biosciences	555329
Bovine serum albumin, Fraction V	KSE Scientific	98-100P
Triton-X	Sigma-Aldrich	T9284
10% Paraformaldehyde	EMS	15712	Carcinogen
Gelatin from fresh water fish skin	Sigma-Aldrich	G7041
Alexa 647 antibody labeling kit	Thermo Fisher	A20186
Magnesium Chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	138924
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7154	Highly toxic, air sensitive
Cysteamine	Sigma-Aldrich	30070	Highly toxic
Cyclooctatetraene 98%	Sigma-Aldrich	138924	Highly toxic, air sensitive
10x PBS	KD Medical	RGF-3210
10x TBS	KD Medical	RGF-3385