Sonographie in experimentellen reproduktiven Untersuchungen an Ratten

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt das Dienstprogramm des Ultraschalls an weiblichen Ratten experimentelle Modelle für reproduktive und gynäkologische Untersuchung durchgeführt. Eine Schritt für Schritt Erklärung wie Ultraschalluntersuchungen Bewertung durchzuführen wird angezeigt.

Zusammenfassung

Mit der Entwicklung der assistierten Fortpflanzung und die ethischen Grenzen der Forschung am Menschen haben Ratten Tiermodelle in der Reproduktionsmedizin verbreitet. In der Vergangenheit stützt sich die Untersuchung der Entwicklung der Geschlechtsorgane bei Nagetieren auf einmalige histologische Untersuchung der ausgeschnittenen Gewebe. Vor kurzem, kann mit der Entwicklung von hochauflösenden transabdominalen Ultraschall, qualitativ hochwertige Sonographie jetzt durchgeführt werden, um die reproduktiven Organe von Ratten, so dass eine neue Methode zur Untersuchung der Fortpflanzungsorgane zu bewerten. Bilder wurden mit einem hochauflösenden ultrasonographische System erhalten. Gynäkologische Sonographie wurde auf 28 acht-Woche-alten nicht trächtigen Ratten und 5 schwanger Sprague-Dawley Ratten durchgeführt. Wir beschreiben, wie Organe des reproduktiven Systems zu erkennen und damit verbundenen Strukturen in typischen Ansichten in verschiedenen Phasen des Östruszyklus radeln. Farbe fließen Doppler verwendet wurde, uterine Arterie Blutfluss messen und bewerten uterine Blut fließen Muster Änderungen in verschiedenen Phasen der Schwangerschaft. Wir haben gezeigt, dass Ultraschall-Untersuchung eine nützliche Methode ist für die Bewertung von Veränderungen der inneren Geschlechtsorgane. Seine Verwendung wirft die Möglichkeit, zusätzliche Experimente, einschließlich medizinische oder chirurgische Verfahren und bietet die Möglichkeit, sonographische Veränderungen an inneren Organen zu überwachen, ohne Tiere.

Einleitung

Ratte Tiermodellen haben in der Reproduktionsmedizin, unter anderem in Embryo und Eierstöcke Transplantation^1,2verbreitet. Jedoch in der Vergangenheit die Untersuchung der Entwicklung der Geschlechtsorgane bei Nagetieren stützt sich auf einmalige histologische Untersuchung der ausgeschnittenen Gewebe und die Langzeitstudie des täglichen Fortpflanzungsorgane Änderungen wurde nicht in Ratten³möglich. Ultraschall ist weit verbreitet in assistierten Fortpflanzung beim Menschen seit über 30 Jahren, aber diese wertvolle Technologie wurde nur auf Ratten vor kurzem angewendet.

Unser Ziel war es eine ultrasonographische Ansatz für die Bewertung der Fortpflanzungsorgane Sprague-Dawley Ratten, experimentelle Modelle für Reproduktion und Gynäkologie Untersuchung zu entwerfen und das Verfahren zu demonstrieren, weil wir wissen, Es gibt keine aktuellen visualisierten Publikationen bezüglich dieses Verfahrens. Wir beschreiben die Vorgehensweise der ultrasonographische Untersuchung der Geschlechtsorgane der weiblichen Ratte und vorliegenden ultrasonographische Befunde auf Anatomie und uterine Arterie Durchblutung mittels hoch auflösender Ultraschall. Wir überwacht die Merkmale des Endometriums, Eierstöcke und uterine Arterie Blutfluss bei nicht-schwangeren Tieren in den verschiedenen Phasen des Östrus Zyklus, die signifikanten Unterschiede in Endometrium Dicke, Eierstöcke Morphologie und uterine Durchblutung zu bewerten verschiedenen Phasen des Östrus Zyklus, ähnlich wie bei Frauen. Wir Gebrauchtgeräte qualitativ hochwertige Ultraschall mit einer 70 MHz Frequenz und einer Auflösung von 30 µm. Unsere anderen Ziel war es, Änderungen am Widerstand des uterinen Blutflusses bei trächtigen Ratten zu bewerten. Diese Technik ermöglicht das Studium der täglichen Änderungen in den reproduktiven Organen ohne Tiere.

Es gibt mehrere technische Schwierigkeiten bei der Verwendung von Ultraschall auf Ratten. Diese Schwierigkeiten sind: die Ratte Endometrium ist viel dünner als ein menschliches weibliche⁴. Schwierigkeiten bei der Bildgebung die Eierstöcke von Ratten hat dickere Haut und Muskulatur der Bauchdecke bei Ratten, die nahezu vollständigen Dämpfung der Ultraschall⁵führte, zugeschrieben und die uterine Arterie ist viel schwieriger, in nicht-schwangeren finden Ratten. Wir haben viele technische Probleme mit dem Verfahren gelöst, und für die Probleme, die bleiben, zeigen wir, wie sie zu minimieren.

Erfolgreiche Überwachung der sonographischen Veränderungen in der reproduktiven Organe von Ratten ohne die Notwendigkeit, Tiere zu Opfern öffnet sich die Möglichkeit des Aufbaus zukünftigen Tiermodelle der Reproduktionsmedizin und andere chirurgische Eingriffe.

Protokoll

Diese Studie wurde durchgeführt in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health und in Übereinstimmung mit der Ankunft (Animal Research: Berichterstattung In Vivo Experimente) Richtlinien. Das Protokoll erhalten eine Lizenz für Tierversuche, die Einhaltung der Richtlinie 2010/63/EG mit der RMA-Nummer A13170404 (Anexo 1). Alle Versuche wurden in einem EU-zertifizierten Labor nach nationalen Richtlinien für die ethische Pflege der Tiere (RD 53/2013, EU-Richtlinie 63/2010) durchgeführt. Das Protokoll wurde vom Ausschuss für die Ethik von Tierversuchen der Universität Murcia genehmigt.

(1) tierische Vorbereitung

Hinweis: Alle Experimente wurden von dem Tier Experimente Abschnitt der Universität Murcia und der Geburtshilfe und Gynäkologie-Abteilung von Murcia Universität unterstützt.

1. Verwenden Sie 8 Wochen alten Sprague-Dawley Ratten (28 weiblichen Ratten) mit einem Gewicht von 200-250 g in allen Experimenten.
   Hinweis: Hier haben wir auch 5 trächtigen Ratten.
2. Trächtigen Ratten Käfig acht Wochen alten weiblichen und fruchtbaren männliche Ratten und Paaren von 17:00-23: 00 h. Identifikation eines vaginalen Steckers am nächsten Morgen wurde interpretiert als Paarung Erfolg. Betrachten Sie 1. Tag der Schwangerschaft, am nächsten Tag, nachdem sie gedeckt wurden.
3. Die Experimente am 9, 15 und 18 Tage der Schwangerschaft durchzuführen.
4. Haus Ratten in Zweiergruppen mit freien Zugang zu Futter und Wasser und erhalten regelmäßige 12 h hell/dunkel-Zyklen.
5. Nutzen Sie nach akklimatisieren an die Anlage Bedingungen für ein Minimum von zwei Wochen täglich morgens vaginale Zytologie Brunst Häufigkeit und Regelmäßigkeit zu beurteilen.
   Hinweis: Für die Aufnahme in die Studie wurden achtundzwanzig Ratten mit einer regelmäßigen 4-5 Tag Brunst Phase ausgewählt.

2. Vorbereitung von Ratten für die Bildgebung

Hinweis: Bilder wurden mittels hochauflösender transabdominalen Ultraschall erhalten. Estrous Zyklusphasen wurden durch vaginalen Abstrich Zytologie ermittelt.

1. Vor der bildgebenden Studie den Damm in der Induktion-Kammer mit 2-3 % Isofluran Gas zu betäuben.
2. Entfernen Sie das Tier zu und sofort die Schnauze innerhalb einer Nase Kegel an das Anästhesiesystem angeschlossen und auch bleiben Sie das Tier auf 1,5-2 % Isofluran während der ultrasonographische Untersuchung.
3. Entfernen Sie das Fell vom kostalen Seitenrand, der kaudalen Bauch mit Klipper und Enthaarungscreme.
4. Platzieren Sie die narkotisierten Ratte in Rückenlage auf einem beheizten Tisch zur Sicherung der Ratte und sorgen für optimalen Komfort und Aufrechterhaltung physiologischer Parameter für die Dauer der Sitzung, bildgebende. Alle physiologischen Parameter sollten integriert werden, mit den Bildern und Daten Echtzeit über die Ultraschall-Anwendung.
5. Sanft fügen Sie eine rektale Sonde (nach Schmierung) zur Überwachung der Körpertemperatur (37,5 ° C ± 0,5 ° C).
6. Setzen Sie den Schallkopf (30 Hz) in einer stationären Halterung und Verschieben entlang der vertikalen Achse und die horizontale Achse (vorne nach hinten und seitlich-) mit einem manuell bedienbaren Joystick oder von hand.
7. Gelten Sie Erdöl-basierten ophthalmologischen Balsam für die Augen der Ratte zu vermeiden, trocknen im Laufe des Verfahrens.

(3) Prüfungsverfahren

Hinweis: Anatomie der Rats´ Geschlechtsorgane: Scheide liegt dorsal, der Harnblase und teilt sich in zwei uterine Hörner, die in Richtung der Nieren zu erweitern. Die Eierstöcke sind die uterine Hörner über die Eileiter (Abbildung 1) verbunden. Die Gebärmutter befindet sich in der Region posterior zu den Nieren.

1. Identifikation des Uterus
   1. Durch die Verwendung der Blase als Wahrzeichen, um den Gebärmutterhals zu finden, Folgen des Gebärmutterhalses um die Niederlassung der linken und rechten uterine Hörner zu finden.
   2. Wechseln Sie zur zweidimensionalen Ansicht/Video durch die Auswahl "B-Modus". Messen Sie den Antero-posterioren Durchmesser jedes uterine Horn in der Mitte Isthmische Region auf einer sagittalen Mittellinie Bild. Messungen mit der Ultraschalluntersuchungen Systemsoftware zu erkennen.
   3. Messen der Endometrium Dicke von echogenen Grenze bis echogenen Grenze über den Endometrium Hohlraum auf einem sagittalen Mittellinie Bild im "B-Modus".
   4. Ändern Sie in Color Doppler-Modus durch Auswahl von "Color Doppler". Verwenden Sie Farbdoppler, um das Blut-Versorgungsmaterial des Endometriums zu identifizieren und die Durchblutung der Gebärmutterschleimhaut zu messen. Wählen Sie die folgenden Parameter im Farbmodus Doppler: Hochpass-Filter auf 4 Hz, gepulste Wiederholung Frequenz Satz zwischen 4 und 48 kHz und gepulsten Doppler Tor zwischen 0,2 bis 0,5 mm festgelegt.
2. Identifikation des Blutflusses Uterine Arterie
   1. Erlangen Sie Doppler Wellenformen in der uterinen Arterie in der Nähe der seitlichen unterlegen Rand der Utero-zervikale Kreuzung in der Nähe der Beckenkamm Arterie auf jeder Seite.
   2. Verwenden Sie die folgenden Parameter im Doppler-Modus: Hochpass-Filter setzen bei 6 Hz gepulste Wiederholung Frequenz Satz zwischen 4 und 48 kHz und gepulsten Doppler Tor zwischen 0,2 bis 0,5 mm.
   3. Achten Sie darauf, die Durchblutung und Doppler Beam Minimierung den Doppler Winkel ausrichten. Den Winkel zwischen der Doppler Beam und das Schiff aufnehmen. Werte über einen Winkel von 60° sollte sind ungenau und vermieden werden⁶.
   4. Messen Sie die Spitze systolischen Geschwindigkeit (PSV) und End-diastolischen Geschwindigkeit (EDV) aus drei aufeinander folgenden Zyklen. Berechnen Sie dann den systolischen, diastolischen (S/D)-Verhältnis (PSV/EDV) und Widerstand Index (RI) ([PSV-EDV] / PSV) Werte für jede uterine Horn.
   5. Messen Sie die uterine Arterie Durchblutung des 5 trächtigen Ratten während der 9^th, 15^th, 18^th -Tag der Trächtigkeit.
3. Identifizierung der Eierstock und die Durchblutung der Eierstöcke Arterie
   Hinweis: Weibliche Ratte Eierstöcke befinden sich seitlich zu den Nieren auf beiden Seiten des Tieres und wohnen in Fettpolster am Ende des uterinen Horns (Abbildung 1).
   1. Bild des Eierstocks, starten mit der Sonde in einer Querebene und legen Sie es auf der lateralen Seite des Tieres leicht unterhalb der Rippen. Die Niere und die Fettpolster haben ein Hyperechoic Aussehen im Vergleich zu den Eierstöcken.
   2. Messen Sie die Außenbegrenzung des Eierstocks und der Follikel. Zahlen auf der Skala zu jedem Bild sind in Millimeter, mit 0,1 mm-Schritten.
      Hinweis: Doppler Farbmodus und Power-Doppler-Modus Bildgebung hilft bei der Identifizierung von Eierstockkrebs Intensität und Durchflußrichtung.

4. Design der Studie

1. Überprüfen Sie den Östrus Zyklus von vaginalen Abstrich Zytologie.
2. Unterteilen Sie alle Ratten in zwei Gruppen. Gehören Sie für Gruppe 1 oder Pre-fruchtbaren (oder Periovulatory) die Ratten, die in den Proestrus und Brunst Zyklusphasen waren. Gehören Sie für Gruppe 2 oder nach dem fruchtbaren die Ratten, die in frühen Diestrus und späten Diestrus Zyklusphasen waren.
3. Beobachten und vergleichen des Antero-posterioren Durchmessers jedes uterine Horn in der Mitte Isthmische Region in Gruppen 1 und 2.
4. Überwachen Sie und vergleichen Sie das Endometrium Dicke und Merkmale des Endometriums in den Gruppen 1 und 2.
5. Überwachen Sie und vergleichen Sie die Größe (maximaler Durchmesser) und die Merkmale der Eierstöcke und lokalisieren Sie jede Periovulatory Follikel beider Eierstöcke in Gruppen 1 und 2.
6. Überwachen Sie und vergleichen Sie die uterine Arterie Durchblutung der Gruppen 1 und 2.
7. Überwachen und vergleichen die uterine Arterie Durchblutung der trächtigen Ratten in verschiedenen Stadien der Schwangerschaft (Tage 9, 15 und 18 Schwangerschaftswoche).
8. Führen Sie statistische Analysen mit SPSS. Darstellung von Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) oder Median mit interquartile reicht. Analysieren Sie die Ergebnisse mit der Student t-Test zwischen den verschiedenen Gruppen. Ein P-Wert von weniger als 0,05 galt einen statistisch signifikanten Unterschied.

Ergebnisse

Es gab keine signifikanten Unterschiede im Antero-posterioren uterine Horn Durchmesser oder in die Dicke des Endometriums zwischen den beiden Seiten der Gebärmutter Horn (Tabelle 1). Verglichen mit der Gruppe 2, die mittlere Endometrium Dicke in der Gruppe 1 war dicker, aber keine signifikanten Unterschiede (P > 0.05) fanden sich zwischen den beiden Gruppen (Abbildung 3). Dennoch fanden wir Flüssigkeit in der Gebärmutter (in 8 von 28 Ratten) in der Nähe des Östrus Zyklu...

Diskussion

Aufgrund der Verfahrensänderungen und Fehlerbehebung, die erforderlich war, in dieser Studie, obwohl unser Ziel alles, was die Phasen des Östruszyklus in Ratten mittels Ultraschall, Zyklus zu identifizieren konnten wir keine signifikanten Unterschiede finden. Wir vermuten, dass diese Schwierigkeiten sein können, weil die Brunst-Zyklus nur ein paar Tage bei Ratten, im Gegensatz zu den Zyklus bei Frauen dauert. Wir sind sicher, dass alle Messungen durchgeführt wurden, genau zum richtigen Zeitpunkt Unterschiede feststel...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vevo3100 high-resolution in vivo micro-imaging system*	Visual Sonics, inc.		www.visualsonics.com/products
Vevo integrated rail system including physiological monitoring unit.	Visual Sonics, inc.		www.visualsonics.com/products
MX400 Transducter	Visual Sonics, inc.		www.visualsonics.com/products
Vevo Lab Software	Visual Sonics, inc.		www.visualsonics.com/products
HSD: Sprague Dawley SD	Envigo, inc.		Rat strain
Lubricating Gel	General Supply
CIBERTEC CA-EAC20 Anesthesia Trolley System	Cibertec S.A		Anesthesia Machine
Ecogel 100 ultrasound gel	Eco-Med Pharmaceuticals Inc.
Hair removal lotion (Nair)	General Supply
Isoflurane	Esteve Veterinaria		Inhalatory anesthesia
* Required software is Vevo software including B-Mode application, pulse wave Doppler application, and vascular strain analysis tools package.