Generation von eine chronisch obstruktive Lungenerkrankung-Modell bei Mäusen durch wiederholte Ozonbelastung

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt die erfolgreiche Generierung von ein neues Tiermodell für die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), indem man immer wieder Mäuse, um hohe Konzentrationen von Ozon.

Zusammenfassung

Chronischer obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) zeichnet sich durch anhaltende Luftstrom Einschränkung und Lunge parenchymatösen Zerstörung. Es hat eine sehr hohe Inzidenz in alternden Bevölkerung. Die aktuellen konventionellen Therapien für COPD Fokus hauptsächlich auf Symptom-modifizierende Drogen; die Entwicklung neuer Therapien ist daher dringend erforderlich. Qualifizierte Tiermodellen der COPD könnte dazu beitragen, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu charakterisieren und eignet sich für neue Drogen-Screening. Aktuelle Modelle der COPD, wie Lipopolysaccharid (LPS) oder die Schweine Pankreas Elastase (PSA)-induzierte Emphysem Modell generieren COPD-ähnliche Läsionen in der Lunge und Atemwege aber nicht sonst ähneln die Pathogenese der menschlichen COPD. Eine Zigarette zu rauchen (CS)-induzierte Modell bleibt eines der beliebtesten, weil es nicht nur COPD-ähnliche Läsionen in den Atemwegen simuliert, aber es basiert auch auf einer der wichtigsten gefährlichen Stoffen, die COPD in den Menschen verursacht. Allerdings beschränken die zeitraubende und arbeitsintensive Aspekte des Modells CS-induzierte drastisch ihre Anwendung in der neuen Wirkstoff-Screening. In dieser Studie erzielten wir erfolgreich ein neues Modell der COPD, indem man Mäuse zu hohen Niveaus des Ozons. Dieses Modell zeigt die folgenden: 1) erzwungene exspiratorischen Volumen 25, 50 und 75/gezwungen Vitalkapazität verringert (FEV₂₅/FVC, FEV₅₀/FVC und FEV₇₅/FVC), unter Angabe der Verschlechterung der Lungenfunktion; (2) erweiterten Lungen-Alveolen mit Lungen-Parenchym Zerstörung; (3) reduziert Müdigkeit Zeit und Distanz; und 4) Entzündung erhöht. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass das Ozon Exposition (OE) Modell ein zuverlässiger Tiermodell das ähnlich wie beim Menschen ist ist, weil Ozon Überbelichtung ist eines der ätiologischen Faktoren der COPD. Darüber hinaus dauerte es nur ca. 6-8 Wochen, basierend auf unsere bisherige Arbeit, um eine OE-Modell zu erstellen, es erfordert 3-12 Monate induzieren das Zigarettenrauch Modell, darauf hinweist, dass die OE-Modell eine gute Wahl für COPD Forschung werden könnte.

Einleitung

Es wurde geschätzt, dass COPD, Emphysem und chronische Bronchitis, darunter möglicherweise die dritte Todesursache in der Welt im Jahr 2020^1,2. Das mögliche Auftreten von COPD in einer Bevölkerung über 40 Jahre alt wird voraussichtlich 12,7 % bei Männern und Frauen innerhalb der nächsten 40 Jahre³8,3 %. Keine Medikamente sind derzeit für die progressive Verschlechterung der COPD Patienten⁴rückgängig zu machen. Zuverlässige Tiermodellen der COPD nicht nur fordern die Nachahmung des pathologischen Prozesses Erkrankung aber auch benötigen eine kurze Generation. Aktuelle COPD-Modelle, einschließlich der LPS oder ein PSA-induzierte Modell induzieren können Emphysem-ähnliche Symptome^5,6. Eine einzige Verwaltung oder eine Woche lang Herausforderung von LPS oder PSA auf Mäuse oder Ratten führt zu deutlichen Neutrophilie im alvéolaire Lavage Fluid (BALF), Erhöhungen Pro-inflammatorischen Mediatoren (z. B. TNF-α und IL-1β) in BALF oder Serum, produziert die Lunge Parenchym Zerstörung erweiterten Lufträume und Grenzen Luftstrom^5,6,7,8,9,10. Jedoch LPS oder PSA sind keine Ursachen der menschlichen COPD und somit nicht zu imitieren den pathologischen Prozess¹¹. Ein CS-induzierte Modell produziert eine persistente Luftstrom Einschränkung, Lungen-Parenchym Zerstörung und funktionelle Übung Kapazität verringert. Eine traditionelle CS-Protokoll erfordert jedoch mindestens 3 Monate um eine COPD Modell^12,13,14,15zu generieren. Daher ist es wichtig, eine neue, effizientere Tiermodell zu generieren, die die zwei Anforderungen erfüllt.

Vor kurzem neben Rauchen, Luftverschmutzung und berufsbedingte Exposition häufiger Ursachen der COPD^16,17,18geworden. Ozon, als eines der wichtigsten Schadstoffe (obwohl nicht Hauptbestandteil der Luftverschmutzung), kann direkt mit der Atemwege reagieren und schädigen das Lungengewebe von Kindern und Jugendlichen Erwachsenen^{19,20,21 ,22,23,24,25}. Ozon, sowie andere Stimulatoren wie LPS, PSA und CS, engagieren sich in eine Reihe von biochemischen Wege der pulmonale oxidativen Stress und DNA-Schäden und Zusammenhängen für die Initiierung und Förderung von COPD^26,27. Ein weiterer Faktor ist, dass die Symptome der COPD-Patienten verschlechtert sich nach Ozon, darauf hinweist, dass Ozon Lunge Funktion^18,28,29stören kann ausgesetzt werden. Aus diesem Grund generiert wir ein neues Modell der COPD durch immer wieder Mäuse, um hohe Konzentrationen von Ozon für 7 Wochen aussetzen; Dies führte zu Luftstrom Mängel und parenchymatösen Lungenschäden ähnlich denen von früheren Untersuchungen^30,31,32. Wir erweitern das OE-Protokoll zu weiblichen Mäusen in dieser Studie und erfolgreich reproduziert das Emphysem beobachtet bei männlichen Mäusen in unserem vorherigen Studien^30,31,32. Da COPD-Mortalität bei Männern zurückgegangen aber erhöht bei Frauen in vielen Ländern³³, eine COPD-Modell bei den Weibchen notwendig ist, um die Mechanismen zu studieren und therapeutischen Methoden für weibliche COPD-Patienten zu entwickeln. Die Anwendbarkeit des OE-Modells für alle Geschlechter unterstützt weitere seine Verwendung als ein COPD-Modell.

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Protokoll

Hinweis: die OE-Modell generiert und in bereits berichtet Forschung ^{30 , 31 , 32} verwendet wurde. Alle Tierversuche wurden genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Shanghai Jiaotong University.

1. Mäuse

1. Haus Erreger frei, 7 bis 9 Woche alten weiblichen BALB/c Mäusen in einzelnen belüftete Käfige in ein Tier Anlage unter kontrollierten Temperatur (20 ° C) und Luftfeuchtigkeit (40-60 %). Bieten Sie eine leichte 12 h und 12 h-dunkel-Zyklus in der Anlage. Nahrung und Wasser Ad Libitum.

2. Ozon oder Luft Exposition

1. erzeugen Ozon mit einem elektrischen Generator in einer Abdichtung (z.B. Plexiglas) Acryl-Box. Schlag die Luft aus der Box mit einem kleinen Gebläse durch eine Entlüftungsleitung, der auf der innen- und Außenseite der Box verbunden ist. Überwachung der Konzentration des Ozons in der Box mit einem Ozon-Sonde. Warten, bis die Konzentration von Ozon im Feld 2,5 Teile pro erreicht million (ppm).
   Hinweis: Die Ozon-Sonde kann der Ozon-Generator automatisch wechseln, ein- oder ausschalten und pflegen das Ozon-Niveau im Feld bei 2,5 ppm.
2. Statt die Mäuse in das Feld, wenn die Ozon 2,5 ppm erreicht. Halten Sie sich die Mäuse in der Box für 3 h jedes Mal Ozon ausgesetzt.
   Hinweis: Feld kann Erhaltung ein Ozon 2,5 ppm in den 3 h durch die Ozon-Generator automatisch ein- und Auschalten und bläst die CO ₂, die entsteht durch die Mäuse out of the Box.
3. Geben zwei Ozon Belichtungen (jeder Belichtung dauert 3 h) pro Woche (einmal alle 3 Tage) für 7 Wochen; Kontrollmäusen Luft gleichzeitig und im gleichen Zeitraum aussetzen.

3. Mikro-Computertomographie

1. am Ende der 7. Woche, betäuben die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Pelltobarbitalum Natricum (1 %, 0,6 - 0,8 ml/100 g) passen Sie die Dosis entsprechend dem individuellen Situationen zu sehen, dass die Maus nicht reagieren auf eine Zehe Prise. Monitor und halten Sie die Maustaste auf einem stetigen Atemfrequenz; und darauf achten, dass keine freiwillige Bewegungen existieren im Verlauf der Verfahren.
2. Legen den narkotisierten Mäuse in der Kammer ein Mikro-Computertomographie (µCT).
3. Kalibrieren der µCT unter Verwendung der standard-Protokoll und der Hersteller ' Anweisungen. Festlegen der Röntgenröhre um 50 kV und der Strom am 450 µA.
   Hinweis: Sowohl der Röntgen- und der Detektor drehen sich um die Mäuse.
4. Führen Sie die µCT-Analyse durch den Erwerb von 515 Projektionen mit einer effektiven Pixelgröße von 0,092 mm eine Belichtungszeit von 300 ms für eine Scheibe und eine Scheibendicke von 0,093 mm.
5. Rekonstruieren die Lunge mit der aufgenommenen Bilder mit Hilfe einer Software. Passen Sie die Helligkeit des Graustufen-Bildes durch Festlegen von Minimum und Maximum der Graustufen-750 und-550 Hounsfield-Einheiten bzw..
   Hinweis: Die Software berechnet automatisch die Bände des Lungenparenchyms und der niedrige Dämpfung Bereich (LAA) ^{34 , 35}.
6. Berechnung des Prozentsatzes von LAA (LAA %) dividiert das LAA-Volumen durch das gesamte Lungenvolumen.

4. Laufband testen

1. geben die Mäuse eine Anpassung mit einer Geschwindigkeit von 10 m/min für 10 min auf einem laufenden Laufband Maschine Hinweis testen: der Strom ist immer deaktiviert, wenn das Verfahren durchgeführt wird.
2. verwalten ein Dauertest für die Mäuse.
   1. Wärmen die Mäuse mit einer Geschwindigkeit von 10 m/min für 5 min.
   2. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit auf 15 m/min für 10 min.
   3. Die Trainingsintensität zu erhöhen: erhöht die Geschwindigkeit von 5 m/min, ab 20 m/min., alle 30 min. bis Mäuse kann nicht weiter ³⁶ ausgeführt.
3. Erfassen die gesamte Laufstrecke und Laufzeit als Müdigkeit Distanz und Müdigkeit Zeit bzw..

5. pulmonale Funktion Messungen

1. betäuben die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Pelltobarbitalum Natricum (1 %, 0,6 - 0,8 ml/100 g) passen Sie die Dosis entsprechend dem individuellen Situationen zu sehen, dass die Maus reagiert nicht auf eine Zehe Prise und warten, bis die Mäuse spontane Atmung. Monitor unterhalten und halten Sie die Maustaste auf einem stetigen Atemfrequenz; und darauf achten, dass keine freiwillige Bewegungen existieren im Verlauf der Verfahren.
2. Tracheostomize die Mäuse sorgfältig und legen Sie sie in einen Körper Plethysmogramm, die an eine Computer-gesteuerte Lüfter angeschlossen ist.
   Hinweis: Belüftung erfolgt über ein Ventil befindet sich proximal zu den Endotrachealtubus. Das Setup bietet verschiedene halbautomatische Manöver, einschließlich die quasi-statische Druck-Volumen-Manöver und das Manöver schnell Spülmenge.
3. Durchschnittlich Atemfrequenz von 150 Atemzüge/min um den narkotisierten Maus über druckgesteuerte Beatmung bis eine regelmäßige Atmung zu verhängen und komplette Ablauf bei jedem Atemzyklus erzielt wird.
4. Führen das quasi-statische Druck-Volumen-Manöver mit dem Gerät mithilfe der Unterdruck erzeugt in der Plethysmogramm.
5. Führen Sie durch die schnelle Strömung Volumen Manöver in die quasi-statische Druck-Volumen-Loops zum Aufzeichnen der FVC und der FEV. Aufblasen die Lunge + 30 cm H ₂ O und sofort danach verbinden Sie es mit einem äußerst negativen Druck zur Durchsetzung Ablauf bis das Restvolumen der FEV in den ersten 25, 50 und 75 ms Ausatmung (FEV ₂₅-30 cm H ₂ O. Record ist FEV ₅₀ und FEV ₇₅, beziehungsweise). Lehnen Sie die suboptimale Manöver. Für jeden Test mit jedem Mausklick führen mindestens drei akzeptable Manöver, einen zuverlässigen Mittelwert für alle numerischen Parametern zu erhalten.

6. BALF Sammlung

1. nach terminal Anästhesie mit Pelltobarbitalum Natricum ((1 %, 1,8-2,4 ml/100 g) passen Sie die Dosis entsprechend dem individuellen Situationen zu sehen, dass die Maus nicht auf eine Zehe Prise reagieren und Atem zu verlieren), Lavage der Mäuse mit 2 mL PBS über eine 1 mm Durchmesser endotracheal Schlauch und dann abrufen BALF ¹⁰.
2. Die abgerufenen Lavage Aliquote bündeln und Zentrifugieren sie bei 4 ° C und 250 X g für 10 min.
3. Den Überstand für den sofortigen Einsatz sammeln und speichern den Rest bei-80 ° C oder flüssiger Stickstoff.
4. Zählen die Gesamtzahl der Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer.
5. Der Zelle Pellet in PBS und dann Spin (1.400 x g, 6 min) 250 µL resuspendierte Zellen auf Folien mit einer Folie Spinner Zentrifuge Aufschwemmen.
6. Gelten Wright zu beflecken Zellen auf den Folien nach Angaben des Herstellers ' s Protokoll.
7. 200 Zellen pro Maus; identifizieren die Zellen wie Makrophagen und Neutrophilen, nach standard Morphologie unter 400 X Vergrößerung; zählen und ihre Nummern.

7. Kardiale Blutabnahme

1. Blut über Herzpunktion zu sammeln, laden Sie es in 1,5 mL Röhrchen, und halten Sie es für 30 min auf Eis
2. Zentrifugieren der Blutproben für 5 min bei 2.000 x g und 4 ° c
3. Übertragung den überstand (Serum) zu einem neuen Schlauch und bei-80 ° C oder flüssiger Stickstoff aufbewahren.
4. Bereiten das Serum für IL-1β, IL-10 und Tests zum Nachweis von TNF-α mit der jeweiligen ELISA-Kits.

8. Lunge morphometrische Analyse

1. zu sezieren, die Lunge und Tracheas von den Mäusen.
   1. Stellung jedes euthanasierten Maus auf eine chirurgische Board sofort nach Opfer.
   2. Sezieren entfernt das Platysma und vorderen trachealen Muskeln zu visualisieren und Zugriff auf die trachealen Ringe.
   3. Open up der thorakalen Hohlraum. Sezieren von Lunge und Luftröhre, aber nicht das Herz aus der Lunge zu trennen.
2. Den endotrachealen Katheter an eine Spritze mit 4 % Paraformaldehyd durch ein PE90 Polyethylen-Rohr anschließen.
   Achtung: Paraformaldehyd ist giftig. Handschuhe und Schutzbrille zu tragen und verwenden Sie die Lösung in einer Dampfhaube.
3. Aufblasen die Lunge komplett mit 4 % Paraformaldehyd (10 Tropfen, ~ 200 µL) durch den Endotrachealtubus Katheter. Entfernen Sie das Herz nach dem Abschluss der Inflation.
4. Pflegen der Lunge in der 15 mL Tube mit 10 mL 4 % Paraformaldehyd für mindestens 4 Std.
5. Die Lunge in Paraffin einbetten. Erhalten Sie 5 µm Abschnitte durch Paraffinblock mit einem rotierenden Mikrotom. Während dem Schneiden, setzen Sie die maximale Fläche von Lungengewebe im Bereich Bronchialbaum.
6. Für morphometrische Analyse durchführen, Hämatoxylin und Eosin (H & E) Flecken auf den Abschnitten.
7. Bild in den Abschnitten mit aufrechten Hellfeld Mikroskop (Objektiv, 20 X, Belichtungszeit, 1,667 ms).
8. Haben zwei Ermittler geblendet, das Behandlungsprotokoll die histologischen Abschnitte unabhängig voneinander zählen. Verwenden Sie die mittlere lineare abfangen (L _m) als Parameter zum Messen des Abstands zwischen alveoläre septal Wand. L-_m mit den folgenden Schritten zu bestimmen:
   1. die Bilder der Abschnitte in Photoshop öffnen und ein Fadenkreuz-Gitter auf das Bild mit fünf 550 µm langen Leitungen zeichnen.
   2. Die Anzahl der Alveolen über die Rasterlinie.
   3. L _m berechnen indem man die Länge der Rasterlinie durch die Anzahl der Alveolen. Für die Quantifizierung Bild fünf Abschnitte per Mausklick. Zehn Bilder der einzelnen Abschnitte (ein Bild pro Feld) zu erwerben und nach dem Zufallsprinzip zu beurteilen. Während der Feldauswahl, vermeiden Felder der Atemwege und Schiffe durch ein Feld verschieben, vor oder in eine andere Richtung.
      Hinweis: Die Daten sind als Mittelwert ± S.E.M vorgestellt Ein UN-gepaarter t-Test wurde für den Vergleich zwischen Luft-exponierten Mäusen und Ozon ausgesetzt Mäusen durchgeführt. Drei Tiere jeder Gruppe wurden verwendet, um die erhebliche Differenz berechnen. Ein p-Wert von < 0,05 galt als bedeutende.

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Ergebnisse

Beispiele für 3D µCT-Bilder der einzelnen Gruppen werden in Abbildung 1eineangezeigt. Die Ozon-exponierten Mäuse hatten einen deutlich größeren totale Lungenvolumen (Abbildung 1ein und b) und LAA % (Abbildung 1c) als die Luft-exponierten Kontroll-Mäusen hat. Das Lungenvolumen und LAA % weiterhin auf erhöhtem Niveau nach sechs Wochen von Ozon E...

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Diskussion

In dieser Studie stellen wir eine zuverlässige Methode zur Erzeugung eines neuen COPD-Modells. Im Vergleich zu anderen Modellen (z.B. LPS oder PSA-Modelle), rekapituliert dieser OE-Modell des pathologischen Prozesses von COPD-Patienten. Da Zigarettenrauch das Hauptmaterial gefährlicher, das menschlichen Patienten⁴⁰COPD verursacht ist, bleibt das CS-Modell der beliebtesten COPD Modell^41,42. Das CS-Modell erfordert jedoch eine 3 -...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mice	Slac Laboratory Animal,Shanghai, China	N/A	7-to-9-week-old female BALB/c mice were used in this study.
Individual ventilated cages	Suhang, Shanghai, China	Model Number: MU64S7	The cages were used for housing mice in the animal facility.
Sealing perspex-box	Suhang, Shanghai, China	N/A	The box was used  to contain the ozone generator. Mice were exposed to ozone within the box.
Electric generator	Sander Ozoniser, Uetze-Eltze, Germany	Model 500	The device was used for generating ozone.
Ozone probe	ATi Technologies, Ashton-U-Lyne, Greater Manchester, UK	Ozone 300	The device was used for monitoring and controlling the generation of ozone.
Pelltobarbitalum natricum	Sigma, St. Louis, MO, USA	P3761	Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pelltobarbitalum natricum.
Micro-Computed Tomography	GE Healthcare, London, ON, Canada	RS0800639-0075	This device was used for acquiring images of the lung.
Micro-view 2.01 ABA software	GE Healthcare, London, ON, Canada	Micro-view 2.01	This device was used for reconstruct the lung and analyze volume, LAA of the lung.
Treadmill machine	Duanshi, Hangzhou, Zhejiang, China	DSPT-208	This machine was usd for fatigue test.
Body plethysmograph	eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK	Forced Manoeuvres System	This device was used to test spirometry pulmonary function.
Ventilator	eSpira™ Forced Manoeuvres System, EMMS, Edinburgh, UK	Forced Manoeuvres System	This device was used to test spirometry pulmonary function.
Slide spinner centrifuge	Denville Scientific, Holliston, MA, USA	C1183	It was used to spin BALF cells onto slides.
Wright Staining	Hanhong, Shanghai, China	RE04000054	It was used to staining macrophages, neutrophils in the suspended BALF.
Hemocytometer	Hausser Scientific, Horsham, PA, USA	4000	It was used to count cells.
IL-1β	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100704	They were used to test the respective factors in serum.
IL-10	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab46103	They were used to test the respective factors in serum.
TNF-α	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab100747	They were used to test the respective factors in serum.
Paraformaldehyde	Sigma, St. Louis, MO, USA	P6148	The lung was inflated by 4% paraformaldehyde.
Paraffin	Hualing, Shanghai, China	56#	It was used to embed the lung.
Rotary Microtome	Leica, Wetzlar,  Hesse, Germany	RM2255	It was used for sectioning the lung.
Hgaematoxylin and Eosin (H&E) staining solution	Solarbio, Beijing, China	G1120	H&E staining was done for morphometric analysis.
Upright bright field microscope	Olympus, Center Valley, PA, USA	CX41	It was used to image the H&E staining slides.
Adobe Photoshop 12	Adobe, San Jose, CA, USA	Adobe Photoshop 12	It was used to count the number of alveoli on the H&E stained images.
GraphPad prism 5	Graphpad Software Inc., San Diego, CA	GraphPad prism 5	It was used for data analysis and production of figures.