Verwendung von Kapseln zur Negativfärbung von Virusproben im Biocontainment

Zusammenfassung

Dieses Protokoll liefert eine Anleitung für Negativfärbevirusproben, die leicht in BSL-2-, -3- oder -4-Laboratorien verwendet werden können. Es beinhaltet die Verwendung einer innovativen Verarbeitungskapsel, die das Transmissionselektronenmikroskopie-Gitter schützt und dem Anwender eine leichtere Handhabung in den turbulenteren Umgebungen im Biokontainment ermöglicht.

Zusammenfassung

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) dient zur Beobachtung der Ultrastruktur von Viren und anderen mikrobiellen Pathogenen mit Nanometerauflösung. Die meisten biologischen Materialien enthalten keine dichten Elemente, die in der Lage sind, Elektronen zu streuen, um ein Bild zu erzeugen; Daher ist ein negativer Fleck, der dichte Schwermetallsalze um die Probe platziert, erforderlich. Um Viren in Suspension unter dem TEM zu visualisieren, müssen sie auf kleine Gitter aufgetragen werden, die mit einer transparenten Oberfläche beschichtet sind, die nur Nanometer dick ist. Aufgrund ihrer geringen Größe und ihrer Zerbrechlichkeit sind diese Gitter schwer zu handhaben und leicht durch Luftströme zu bewegen. Die dünne Oberfläche wird leicht beschädigt, so dass die Probe schwierig oder unmöglich abbilden kann. Infektionsviren müssen in einem Biosicherheitsschrank (BSC) behandelt werden, und einige erfordern eine Biocontainment-Laborumgebung. Die Färbung von Viren in Biosicherheitsstufen (BSL) -3 und -4 ist besonders anspruchsvoll, da diese Umgebungen turbulenter sind und Techniker erforderlich sindO trage persönliche Schutzausrüstung (PSA), die Geschicklichkeit verringert.

In dieser Studie haben wir ein neues Gerät zur Unterstützung von negativen Färbeviren im Biokontainment evaluiert. Das Gerät ist eine Kapsel, die als spezialisierte Pipettenspitze arbeitet. Sobald die Gitter in die Kapsel geladen sind, saugt der Benutzer Reagenzien einfach in die Kapsel, um das Virus und die Flecken an das verkapselte Gitter zu liefern, wodurch die Handhabung von Gittern eliminiert wird. Obwohl diese Technik speziell für die Verwendung in BSL-3 oder -4 Biocontainment entwickelt wurde, kann sie die Probenvorbereitung in jeder Laborumgebung erleichtern, indem sie eine leichte Negativfärbung des Virus ermöglicht. Dieselbe Methode kann auch angewendet werden, um negativ gefärbte TEM-Proben von Nanopartikeln, Makromolekülen und ähnlichen Proben herzustellen.

Einleitung

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist ein effektives Werkzeug für die Betrachtung der Morphologie und der Ultrastruktur von biologischen Proben, die zu klein sind, um mit einem herkömmlichen Lichtmikroskop ^{1 , 2 , 3 , 4 zu sehen} . TEMs schießen Elektronen durch eine sehr dünne Probe, die ein Bild mit höherer Auflösung erzeugt, da Elektronen eine viel kürzere Wellenlänge als Licht haben. Regionen der Probe, die Elektronen biegen oder blockieren, erscheinen dunkel, während Regionen, die elektronen licht sind, weiß erscheinen.

Mangel an Elektronen dichten Materie macht Viren schwer zu sehen unter einem TEM, weil sie nicht streuen können Elektronen. Negative Färbung ist die häufigste Methode, die verwendet wird, um Kontrast zu erzeugen und Viren mit einem TEM zu betrachten. Das erste Negativfärbeverfahren wurde von Brenner und Horne im Jahre 1959 vorgeschlagen, basierend auf einem Experiment, bei dem Hall (1955) und Huxley (1957) Beobachter warenVed das Auftreten von biologischen Strukturen im umgekehrten Kontrast beim Eintauchen in eine elektronendichte Substanz ⁵ . Der Prozess der negativen Färbung ist in der letzten Hälfte des Jahrhunderts nahezu unverändert gewesen. Negative Färbung beinhaltet das kurzzeitige Aufbringen einer Schwermetallsalzlösung auf eine Probe auf einem TEM-Gitter in einem Versuch, das Virus mit dichten Materialien zu umgeben, ohne das Virus ⁶ zu infiltrieren. Dies schafft eine dunkle Grenze und zeigt die Partikelform ⁵ . Diese Studie verwendet zwei Reagenzien für Negativfärbung, Uranylacetat (UA) und Kaliumphosphowolframsäure (PTA). Beide dieser Flecken werden gewöhnlich verwendet, um kleine biologische Proben, wie Viren, Proteinkomplexe und Nanopartikel ^{7 , 8 , 9} , negativ zu färben.

Die herkömmliche Negativ-Färbetechnik ist die manuelle Tröpfchen-Negativ-FärbungstechnologieNique ⁷ Diese Methode erfordert eine präzise Handhabung von kleinen, zerbrechlichen TEM-Gittern mit einer Pinzette, um kleine Mengen an Virusproben, Flecken und Spülungen aufzutragen. Das typische Herstellungsprotokoll beinhaltet das Aufbringen eines Tröpfchens der Probensuspension auf die Oberfläche eines mit einem Film beschichteten TEM-Gitters ( 1A ). Nach dem Anbringen der Probe an die Filmoberfläche wird das Gitter gespült, um nicht-adhärente Viren zu entfernen und mit UA oder PTA für einige Sekunden bis zu einer Minute gefärbt zu werden, abhängig von der Art der Probe. Überschüssige Flüssigkeit wird vom Gitter weggerissen, indem man ein Stück Filterpapier an den Rand des Gitters berührt.

Die manuelle Tröpfchenmethode erfordert, dass jedes Raster individuell hergestellt wird. Wenn nicht sorgfältig behandelt, werden beschichtete TEM-Gitter leicht durchbohrt, gebogen oder verunreinigt. Die Verarbeitung mehrerer Proben kann zu Schwierigkeiten bei der Verfolgung der Gitter führen und eine gleichmäßige Färbung für jede Probe gewährleisten. Diese manuelle Färbung ist viel mehr dWenn es in den Biosicherheitsstufen (BSL) -3 und -4 Biocontainmentlaboratorien aufgrund der für diese Umgebungen erforderlichen persönlichen Schutzausrüstung (PSA) fällig ist. PPE ist umständlich und die Biocontainment-Umgebung ist viel turbulenter im Vergleich zu einem regelmäßigen Labor. Das Personal, das in BSL-3 Biokontainmentlaboratorien arbeitet, muss 2 Paar Handschuhe tragen und in einem Biosicherheitsschrank (BSC) arbeiten. Diese doppelte Handschuhschicht reduziert die taktile Empfindlichkeit und beschränkt die Feinmotorik. Der Luftstrom des BSC, der den Benutzer schützt und hilft, die Kontamination der Proben zu verhindern, kann dazu führen, dass die Proben und Flecken zu schnell trocknen und so die Fleckenqualität beeinträchtigen. Der starke turbulente Luftstrom im BSC kann auch schnell ein Gitter wegblasen, das nicht gut gesichert ist. In BSL-4 Biocontainment-Labors gibt es zusätzliche Sicherheitsanforderungen. Das Personal muss einen positiven Druckanzug tragen, der die physische Bewegung und die Fähigkeit, deutlich zu sehen und zu manipieren, weiter einschränktGitter wässern. Der Techniker, der in BSL-4 arbeitet, trägt auch mindestens 2 Paar Handschuhe, wobei das äußere Paar ein dicker Handschuh ist, der die Geschicklichkeit und die taktile Empfindung stark reduziert. Schließlich ist die Pinzette, die verwendet wird, um TEM-Gitter zu handhaben, scharf, wodurch ein Risiko für den Techniker aufgrund ihrer Fähigkeit, Pünktchen Handschuhe. Bei Kapseln, die Gitter enthalten, sind keine Pinzetten notwendig, so dass eine sichere, zangenfreie Alternative zur Manipulation von Gittern in Biokontainmenten geschaffen wird. Schließlich bieten die Kapseln auch einen wirksamen Weg, um Gitter während der Verarbeitung, Osmiumdampf-Dekontamination und während der Lagerung zu speichern; Wodurch die Gitter organisiert und vor Schäden geschützt sind.

In diesem Bericht stellen wir eine neue Methode zur Negativfärbung von TEM-Gittern in Biokontainmentlaboratorien vor, die mPrep / g-Kapseln, eine kapselbasierte Vorrichtung zur Netzhandhabung und Färbung ^{10 , 11 , 12, einsetzt} . Die KapselModifiziert zwei TEM-Gitter, minimiert die direkte Handhabung und reduziert das Potenzial für Netzschäden. Die Kapsel haftet direkt an einer Einzel- oder Mehrkanalpipette in der gleichen Weise wie eine Pipettenspitze, so dass die Anwendung von verschiedenen Flüssigkeiten auf Gitter, die darin enthalten sind. Dies ermöglicht die gleichzeitige Vorbereitung mehrerer Proben mit doppelten Gittern ( Abbildung 1B ). Zu negativen Flecken mit Kapseln wird die Virusprobe in die Kapsel angesaugt und für 10 min gehalten, um die Viren auf die Gitteroberflächen adsorbieren zu lassen. Die Gitter mit adsorbiertem Virus werden anschließend mit deionisiertem (dI) Wasser gewaschen und mit UA oder PTA für einige Sekunden bis 1 min gefärbt. Dieses Verfahren verwendet dieselben Protokollschritte und Reagenzien wie die manuelle Tröpfchenmethode; Der Unterschied ist, dass alle Arbeiten innerhalb der Kapsel ohne physische Handhabung der Gitter auftreten. ( Fig. 1C , 1D ).

Der Zweck dieser Studie war es, Kapseln als zu bewertenEine neue Methode zur Negativfärbung von Virusproben in Biokontainmentumgebungen. Diese Studie untersuchte auch die Qualität von TEM-Bildern, die aus zwei verschiedenen Virusinaktivierungsverfahren hergestellt wurden: 1) schnelle Inaktivierung mit 1% Osmiumtetroxiddampf und 2) einer 24 h Inaktivierung mit 2% Glutaraldehyd. Beide wurden unter Verwendung der Kapseln durchgeführt. Schließlich haben wir zwei häufig verwendete Negativflecken, UA und PTA, zur Verwendung in der Kapsel ausgewertet. ¹³

Protokoll

1. Versuchsvorbereitung in einer BSL-2-Umgebung vor dem Arbeiten mit den Virusproben

1. Vorbereiten oder kaufen Formvar und Kohlenstoff beschichtet TEM Kupfer Gitter, in der Regel 200-400 Mesh.
2. Setzen Sie die beschichteten TEM-Gitter in Kapseln ein.
   1. Verwenden Sie ein vergrößertes Objektiv, um diesen Vorgang einfach durchzuführen. Ein oder zwei Gitter können in jede Kapsel eingeführt werden. Vorgeladene Kapseln können gekauft werden, um diesen Schritt zu beseitigen, falls gewünscht.
3. Übertragen Sie die Kapseln mit eingefügten TEM-beschichteten Gittern, zusammen mit anderen Vorräten und Reagenzien, zur Biokontainmentierung, wo die Viren negativ gefärbt werden.

2. Das Kapselverfahren für die Negativfärbung im Biocontainment unter Verwendung von wässrigem Glutaraldehyd und 1% Osmiumtetroxiddampfinaktivierung

1. Innerhalb des Biocontainment BSC saugt man 40 μl Virussuspension in die an eine Pipette gebundene Kapsel.
   HINWEIS: Die Pipette bleibt an thE Kapsel, bis der Prozess abgeschlossen ist. Virusvorbereitung erfolgt nach unserer vorherigen Publikation ¹⁴ .
2. Legen Sie die Pipette 10 Minuten lang mit Gittern auf die Seite. Dies soll eine gleichmäßige Verteilung von Viruspartikeln auf die beschichteten Gitter fördern.
3. Inaktivieren Sie das Virus innerhalb der Kapsel innerhalb des Biocontainment BSC.
   1. Nehmen Sie die Pipette auf und drücken Sie den Kolben, um die Viruslösung in einen Abfallbehälter zu geben.
   2. 40 μl 2% Glutaraldehyd-Fixiermittel in die Kapseln geben.
      Achtung: Glutaraldehyd ist eine gefährliche Chemikalie und erfordert einen geeigneten Schutz. Glutaraldehyd kann für kurze Zeiträume in einem normalen BSC verwendet werden, aber verlängertes offenes Reagenz erfordert das Arbeiten in einer geführten BSC oder chemischen Dunstabzugshaube.
   3. Legen Sie die Pipette 20 Minuten lang auf die Seite. Damit ist sichergestellt, dass die Proben gut fixiert sind.
   4. Das Fixiermittel ausschütten und 40 μl dI Wasser in die Kapseln zu w absaugenAsche weg das Fixiermittel. Wiederholen Sie diesen Waschschritt für insgesamt 3 Spülzyklen.
4. 40 μl entweder 1% Uranylacetat (UA) oder 1% Kaliumphosphowolframsäure (PTA) in die Kapseln geben und 30 s sitzen lassen.
   HINWEIS: Die Färbezeit kann von 10 s bis 1 min variieren, basierend auf Virusprobe.
   Achtung: UA ist ein Alpha-Emitter und ein kumulatives Toxin. Handhabung mit entsprechendem Schutz.
5. Entfernen Sie die Kapsel aus der Pipette und trocknen Sie die Gitter, indem Sie ein Stück Filterpapier an den Rand des Gitters berühren, während die Gitter in der Kapsel verbleiben.
6. Osmium-Tetroxid-Dampf-Inaktivierungsverfahren.
   1. Legen Sie die Kapsel mit offenem Deckel in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen, das Filterpapier enthält, das in einer 1% igen Osmiumtetroxidlösung eingetaucht ist.
      Achtung: Osmium-Tetroxid ist bei niedrigem Dampfdruck extrem giftig. Es muss in einer geführten BSC oder chemischen Dunstabzugshaube verwendet werden. Handhabung mit entsprechendem Schutz. PostwarnungInformationen im Arbeitsbereich.
   2. Das 50-ml-Zentrifugenröhrchen für 1 h abdichten, um eine vollständige Permeation des Osmiumtetroxiddampfs zu ermöglichen. Anschließend anschließend das Röhrchen aus dem Biocontainment in die BSL-2 EM-Anlage dekontaminieren und übertragen.
7. EM-Gitter aus der Kapsel entfernen.
   1. In der BSL-2 EM-Anlage die Kapsel aus dem Zentrifugenröhrchen entfernen und auf eine Pipette legen.
   2. 40 μl dI Wasser in die Kapsel geben und das Wasser dreimal in einen Abfallbehälter geben.
   3. Entfernen Sie die Kapsel aus der Pipette und trocknen Sie die Gitter mit Filterpapier, um den Rand der Gitter zu berühren.
   4. Nach der Lufttrocknung die Gitter für die anschließende TEM-Bildgebung aufbewahren.

3. Die Kapselmethode zur Inaktivierung im Biokontainment mit 2% Glutaraldehyd, gefolgt von einer Negativfärbung in einem BSL-2-Labor

1. Virusinaktivierungsverfahren.
   1. Innerhalb des Biocontainment BSC mischen Sie die Virus Suspension gut mit dem gleichen Volumen von 4% Glutaraldehyd, um eine Endkonzentration von 2% Glutaraldehyd zu erreichen.
      Achtung: Glutaraldehyd ist eine gefährliche Chemikalie und erfordert einen geeigneten Schutz. Glutaraldehyd kann für kurze Zeiträume in einem normalen BSC verwendet werden, aber verlängertes offenes Reagenz erfordert das Arbeiten in einer geführten BSC oder chemischen Dunstabzugshaube.
   2. Inaktivierung von Viren mit Fixiermittel für mindestens 24 Stunden vor der Verpackung, Dekontamination und Überführung an die BSL-2 EM-Anlage.
2. In der BSL-2 EM-Anlage die Virus- und Fixiermischung in die Kapsel einspülen, die zwei TEM-Gitter enthält, die an einer Pipette befestigt sind.
3. Die Pipette für 10 min mit den horizontal ausgerichteten Gittern horizontal platzieren.
   HINWEIS: Dies soll eine gleichmäßige Verteilung von Viruspartikeln auf die TEM-Gitter fördern.
4. Nehmen Sie die Pipette auf und drücken Sie den Kolben, um das Virus in einen Abfallbehälter zu vertreiben. Ansaugen von 40 & mgr; l dIWasser in die Kapseln geben und in den Abfallbehälter für 3 Spülzyklen ausstoßen.
5. 40 μl entweder 1% UA oder 1% PTA in die Kapseln für 30 s einatmen.
   HINWEIS: Die Färbezeit variierte von 10 s bis 1 min auf der Grundlage von Virusproben.
   Achtung: UA ist ein Alpha-Emitter und ein kumulatives Toxin. Handhabung mit entsprechendem Schutz.
6. Entfernen Sie die Kapsel aus der Pipette und trocknen Sie die Gitter durch Berühren der Kante der Gitter zu einem Stück Filterpapier. Die Gitter trocknen und für die nachfolgende TEM-Bildgebung aufbewahren.

Ergebnisse

Die Kapselmethode produziert gute Qualität Negativfärbung für TEM-Bildgebung:

Zuerst haben wir die Qualität der Bilder ausgewertet, die durch die Verwendung der manuellen Tröpfchenmethode und der Kapselmethoden für die Negativfärbung von Zaire ebolavirus erzeugt wurden. Ebolaviren sind Mitglieder der Filoviridae Familie, zusammen mit Marburg Virus. Ebolavirus hat typischerweise einen Durchmesser von 80 bis 100 nm ...

Diskussion

Negative Färbung ist eine wertvolle TEM-Technik zur Bewertung und Größenbestimmung von Viren, Proteinkomplexen und Nanopartikeln. Die Tröpfchenpräparation dieser Proben durch manuelles Bewegen von Gittern von Reagenz zu negativen Flecken ist seit mehr als einem halben Jahrhundert das klassische Protokoll. Es ist ein einfacher Prozess, aber erfordert Know-how durch Training für den erfolgreichen Abschluss gewonnen. Ausgezeichnete Negativfärbung gilt nach wie vor als hochmoderne Kompetenz und ist in vielen TEM-Labo...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formvar/carbon coated TEM grids	SPI	3420C-MB	200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g capsules	EMS	85010-01	box
mPrep/f couplers	EMS	85010-11	standard 16/Pk
glutaraldehdyde	EMS	16320	50% solution, EM grade
Osmium Tetroxide	EMS	19190	4% aqueous solution
Uranyl Acetate	EMS	22400	powder
Potassium phosphotungstic acid	EMS	19500	powder
filter paper	Whatman	1450-090	size 50
Tranmission Electron Microscope	JEOL	JEM-1011	TEM