Stereotaktische Atlas-geführte Laser Capture Microdissection Hirnregionen von traumatischen Verletzungen betroffen

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Verwendung von Laser Capture Microdissection Proben unterschiedliche Zellpopulationen aus verschiedenen Gehirnregionen für gen- und MicroRNA Analyse zu erhalten. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der unterschiedlichen Auswirkungen von traumatischen Hirnverletzungen in bestimmten Regionen des Gehirns Ratte.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit, bestimmte Gehirnregionen von Interesse zu isolieren kann im Gewebe Dissoziation Techniken behindert werden, die nicht ihre räumliche Verteilung beibehalten. Solche Techniken neigen auch potenziell gen Expressionsanalyse, weil der Prozess selbst Expressionsmuster in einzelnen Zellen verändern kann. Hier beschreiben wir eine Lasermethode Erfassung Mikrodissektion (LCM) um gezielt bestimmte Gehirnregionen betroffen Schädelhirntrauma (SHT) durch die Verwendung einer modifizierten Nissl (Cresyl violett) Färbung, Protokoll und der Leitung von einer Ratte Gehirn Atlas zu sammeln. LCM bietet Zugriff auf Hirnregionen in ihren systemeigenen Positionen und die Fähigkeit anatomische Landmarken zur Identifizierung der einzelnen spezifischen Regionen verwenden. Zu diesem Zweck wurde zuvor LCM verwendet, Gehirn Region spezifische Genexpression in TBI zu untersuchen. Dieses Protokoll ermöglicht die Auseinandersetzung mit der TBI-induzierte Veränderungen im gen und MicroRNA Ausdruck in verschiedenen Hirnregionen innerhalb der selben Tier. Die Grundsätze dieses Protokolls können geändert und auf eine Vielzahl von Studien, die genomische Ausdruck in anderen Krankheit und/oder Tiermodellen angewendet werden.

Einleitung

Das Gehirn von Säugetiere ist erstaunlich komplex und heterogen mit Hunderten bis Tausenden von Zelle Arten¹. In der Tat, Studien am Menschen haben gezeigt, dass in Regionen wie dem frontalen Kortex, strukturelle und funktionelle Unterschiede in weißen und grauen Substanz spiegeln sich in unterschiedlichen und voneinander abweichenden transcriptional Profile². Gehirn Heterogenität wurde ein großes Hindernis für die Genexpressionsdaten zu interpretieren und auf dem Gebiet der Hirn-Trauma. Diese Mehrdeutigkeit in präklinischen Studien führte anschließend zu Hunderten gescheiterten klinischen Behandlungen für Gehirn-Verletzung-³.

Wir verwenden Laser Capture Microdissection (LCM) Methoden, um Schädelhirntrauma (SHT) zu studieren-induzierte gen Dysregulation in der Ratte Gehirn⁴, mit Schwerpunkt auf der Hippocampus, eine Hirnregion, die für lernen und Gedächtnis⁵unerlässlich. Die Fähigkeit, laser-Erfassung und Analyse der Genexpression in sterben und Überleben der Neuronen gibt uns ein besseres Verständnis der Rolle der SCND im Genausdruck in den Ausgang (neuronale überleben) nach TBI⁶. LCM-Techniken haben auch für die Erforschung der Auswirkungen von TBI auf hippocampal Neuronen, beim Vergleich von jungen und alternden Mäusen⁷ oder Ratten⁸bewährt.

In neueren Studien untersuchten wir andere Hirnregionen Ratte negativ beeinflusst von TBI, mit einem Fokus auf Bereiche in Ratten und menschlichen TBI Patienten, die mit leitender Funktion (d. h. frontalen Kortex⁹) und TBI Komorbiditäten verbunden sind; Diese Begleiterkrankungen sind Depressionen (d.h. Nucleus Accumbens¹⁰) und zirkadiane Rhythmusstörungen (suprachiasmatischen Kern¹¹). In früheren Studien, Huusko und Pitkanen¹² und Drexel Et al. ¹³ verwendet LCM zur Genexpression in den Thalamus und Hypothalamus Untersuchung. Unsere Studie baut auf diesen früheren Beobachtungen und umfasst vier anderen Gehirnregionen. Um die regionsspezifischen molekulare Veränderungen nach TBI zu studieren, war es notwendig, Know-how bei der Ermittlung und Beschaffung Zelltypen in diesen Regionen mit einem LCM-System gewinnen. Die UV-schneiden und Infrarot (IR) Laser ermöglichen präzise Mikrodissektion von gewünschten Hirnregionen. Hier beschreiben wir, wie wir verwenden dieses LCM-System, geleitet von stereotaktischen Koordinaten in der Ratte Gehirn Atlas¹⁴, um zu identifizieren und laser-Erfassung vier Ratte Hirnregionen, die differentiell durch die experimentelle Flüssigkeit-Percussion Gehirn Verletzungen Methode betroffen sind ⁴.

Protokoll

Hinweis: alle Tierversuche sind durch die institutionelle Animal Care and Use Committee der University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas genehmigt, wie von den nationalen Instituten der Health Guide für die Pflege und Nutzung der Versuchstieren (8. Auflage, National Research Council).

1. Gewebe Sammlung, Region Identifikation und Berandungen

1. Thema Erwachsene, Männlich, Sprague-Dawley Ratten, etwa sechs Wochen alt und 250-300 g, experimentelle Flüssigkeit Percussion Verletzungen, wie in Shimamura Et al. beschrieben. ⁴.
2. Twenty-Four Stunden nach experimentellen TBI einschläfern menschlich die Tiere indem man sie in eine Kammer mit einer Isofluran-Konzentration von 4 % bis tief narkotisiert. Tod durch Enthauptung zu gewährleisten, Verbrauchsteuern die Gehirne und sofort einfrieren in Pulverform Trockeneis. Store Gehirne in einem Gefrierschrank-80 ° C eingefroren, bis schneiden.
3. Vor keinem LCM-Verfahren, die transkriptionelle Analyse beinhaltet alle Oberflächen mit RNase Reinigungsmittel beseitigen, um das Risiko für Verschmutzungen und RNA-Abbau reinigen.
   Hinweis: Diese Reinigung umfasst die Nutzfläche für Färbung, der Kryostat wo Gewebe geschnitten ist, und die Gegend um das LCM-Gerät.
4. Das Hirngewebe von Lagerung und Ort abzurufen, in einem Kryostaten gekühlt bis-20 ° C. zulassen, das Gehirn, um auf die Temperatur der Kryostat Kammer für ~ 10 min. equilibrate
5. Stellen die Gehirn ventralen Seite nach oben auf eine Gaze Blatt auf der Oberseite der Kryostat-Bühne. Mit einer Rasierklinge sauber, RNase-freie schneiden Sie den hinteren Teil nur rostral an das Kleinhirn (gespeichert oder verworfen) und das Teil nur anterior Optik Chiasmus (Och).
6. Ort eine kleine Menge der optimale Arbeitstemperatur (OCT) Medium in zwei separaten Cryomolds. Legen Sie das Gehirn (mit dem frontalen Verein Kortex (FrA) und dem Nucleus Accumbens Kern (AcbC)) in die Cryomolds vorderen Seite nach unten. Fügen Sie ausreichend OCT-Medium, um das Gewebe zu bedecken.
   1. Wiederholen Sie diesen Schritt mit dem Gehirngewebe mit dem Hippocampus (Hp) und suprachiasmatischen Kern (SCN).
   2. OCT Mittel-und komplett für ~ 20 min in der Kryostat einfrieren lassen.
7. Einmal die Gewebe und OCT Medium vollständig gefroren sind, drücken Sie eine kleine Menge von OCT auf eine Montage-Kopf und drücken Sie die gefrorenen Cryomolds, enthält das Gewebe auf den Montage-Kopf. Ermöglichen das OAT komplett gefrieren, so dass die Form, die das Gewebe enthält sicher am Kopf befestigt ist.
8. Der Kopfaufsatz an der speziellen Halterung zu sichern und die Schraube festziehen. Anpassen den Schnittwinkel in Bezug auf die Kryostat-Klinge mit den Hebeln der Anpassung zu gewährleisten, Querschnitte gleichmäßig.
9. Setzen die Schnittdicke bis 30 µm. Wenn die Gewebe-Block mit der FrA und AcbC schneiden, zum ersten Mal schneiden bis Großhirnrinde ersichtlich ist und dann Start sammeln.
10. Abschnitte unter Bezugnahme auf die Ratte Gehirn Atlas- ¹², Abschnitt und sammeln Gehirn durch sanftes Auflegen Raumtemperatur Polyethylen Napthalate (PEN) Membran Folien auf der geschnittenen Gewebe für die FrA bis der sekundäre motorische Kortex (M2 ) bei Bregma 5,16 mm erreicht ist.
    1. Visuell gewährleisten Einhaltung gleiten durch die Prüfung, wenn Gewebe und ÜLG auf Folie vollständig geschmolzen sind. Speichern Sie alle Folien mit Gewebeschnitten im Kryostaten bis beflecken.
11. Weiter schneiden, bis die vordere Kommissur (Aca) sichtbar und in einem kompletten Kommissur unter die jetzt offensichtlich lateralen Ventrikel (LV) bei Bregma 1.80 mm vereint.
12. Sammeln Abschnitte bis die LVs angezeigt Verbindung mit Aca am Bregma 0,84 mm.
13. Schnitt für die FrA und AcbC abgeschlossen, Block montiert Gewebe zu entfernen und ersetzen Sie durch den Block mit HP und SCN.
14. Abschnitt bis die Och am Bregma-0,480 mm, abgeflacht ist wenn der dritte Ventrikel (3V) erkennbar wird.
15. Sammeln Abschnitte für den SCN ab diesem Zeitpunkt bis Bregma-0,720 mm, beginnt die supraoptischen Decussation (Sox).
    Hinweis: Es möglicherweise notwendig, sammeln mehr Gewebeschnitte während der Och wie die SCN einfach übergangen wird.
16. Für HP Sammlung sind Abschnitt bis die Hörner des Granulat Zelle dentate Gyrus (GrDG) Schicht sichtbar offensichtlich am Bregma-3,000 mm.
17. Sammeln Abschnitte bis der hippocampal Unterfelder CA in den koronalen Abschnitte am Bregma verschmolzen sind-4,780 mm. Dieses Detail ermöglicht eine komplette Sammlung von Hippocampus unter der Kraniotomie und Verletzungen Website.
    Hinweis: Wie in früheren Publikationen aus diesem Labor gezeigt, die meisten verletzte Zellen werden innerhalb dieses Bereichs sichtbar und eignet sich für gen oder MicroRNA Expressionsanalyse.

2. Färbeprotokoll

1. vor alle färben, waschen Geschirr und Färbung Bereich in einer chemischen Abzugshaube mit RNase-Beseitigung Reinigungsmittel. Dieses Präparat verringert das Risiko der RNA-Abbau durch die Verseuchung.
2. Alle Färbung Reagenzien und Lösungen in Nuklease vorzubereiten, freies Wasser.
3. Nehmen eine Rack mit Folien in den Kryostaten und Platz in der Dunstabzugshaube gespeichert. Folien für 30 S. Platz erwärmen sie in Färbung Lösungen (mit Nuklease freies Wasser zubereitet) wie folgt zu ermöglichen: 75 % EtOH für 1 min, Nuklease kostenlos Wasser für 1 min, 1 % Cresyl violett für 1 min, Nuklease freies Wasser für 30 s, Nuklease freies Wasser für 30 s , 95 % EtOH für 30 s, 100 % EtOH für 30 s, 3 min Xylol und Xylol für 3 min.
4. Ermöglichen das Rack nicht mehr als 10 min bei Raumtemperatur in der Dunstabzugshaube an der Luft trocknen. Alternativ legen Sie Regale in eine Rnase-freie Vakuum Exsikkator zum schnelleren Trocknen. Sobald getrocknet, gehen Sie sofort zum LCM.

3. Stereotaktische Atlas geführte Laser Capture Microdissection mit dem LCM-System

1. vor Beginn jedes LCM-Verfahren zur RNA-Analyse, wischen Sie den Abholort und die Gegend um das Gerät mit RNase-Beseitigung von Reinigungsmittel und 100 % EtOH.
2. Drehen Sie den ein-/Ausschalter auf der IR-Laser Erzeugungseinheit vor dem Einschalten Mikroskop Basis, und lassen Sie das System zu initialisieren, bevor Software vom Desktop aus gestartet wird.
   Hinweis: Wenn nicht in dieser Reihenfolge abgeschlossen, die Software nicht erkennen das Mikroskop.
3. Sobald die Software gestartet und die Initialisierung Schritte durchlaufen, drücken Sie die " derzeit " Button in der Software " Setup Panel. " die modulare Bühne bewegt sich in Position, wo LCM Makro Kappen und Folien können geladen und off-loaded.
4. Legen Sie die Stift Membran Folien in die Halterungen (bis zu drei gleichzeitig) mit satiniertem Rand nach rechts vor.
   Hinweis: Wenn in der Halterung in der falschen Ausrichtung platziert, die Software möglicherweise nicht richtig erkennen, die gewünschte IR oder UV-Schneidbereich.
5. Klicken Sie auf die " Mem " Kontrollkästchen in der " Kappe und Folienbereich Umgang mit " neben der jeweiligen Folie (d.h., A, B oder C). Dieser Schritt bezeichnet, wenn die Folie eine Membran-Glas-Folie ist. Klicken Sie auf die gewünschte Folie zuerst erfasst werden.
6. , Die Kamera ein gekacheltes Bild für Gewebe-Standort und Ausrichtung für GAP Praktika zu machen wählen Sie " Bild " auf die Symbolleiste und wählen Sie " erwerben Übersicht. "
   Hinweis: Wenn der Benutzer vertraut mit dem Gewebe gesammelt ist, dieser Schritt ausgelassen werden durch Verwendung der manuellen Scrollball zur Positionierung der " Region Mitte " für Sammlung.
7. Platzieren Sie den Mauszeiger über den Bereich auf der gekachelten Bildern (oder relative Position ohne gekacheltes Bild), der rechten Maustaste und wählen Sie " Ort Cap bei Region Zentrum. " die Software findet automatisch eine Kappe über der ausgewählten Position.
Wählen Sie eine Position aus
8. .
   Hinweis: Um sicherzustellen, dass die IR-Laser richtig ausgerichtet ist und holt nur Bereiche, in denen Flecken von der Software gelegt werden muss es, bevor Sie fortfahren befinden.
   1. Umzug in ein Gebiet im Rahmen der GAP, wo kein Gewebe vorhanden ist. Klicken Sie " ich " in der " Microdissect Tools Bereich " und wählen Sie die " IR Locate " Registerkarte ". Im Bereich Brandschutz einen IR-Test shot um zu beurteilen, wo die IR-Laser schießt und die Größe des Spots.
   2. Mit dem Cursor in der Mitte IR vor Ort und wählen Sie Rechtsklick " gelegen IR Spot. "
      Hinweis: Größe und Intensität der IR-Strahl können geändert werden, durch die manuelle Veränderung der " Leistung, Durchmesser oder Dauer " unter jeder Punktgröße Designator oder durch Verschieben der gleitenden Skala am unteren Rand des Dialogfelds. Einige Testaufnahmen müssen entlassen werden, um korrekte Punktgröße zu gewährleisten. Der IR-Laser muss jeder beim nächsten Einschalten die Position der Kappe Änderungen oder Folien sind neu gefunden werden.
   3. Für UV schneiden, lokalisieren den UV-Laser durch die Auswahl der " UV-Locate " Registerkarte im Dialogfeld ".
      Hinweis: Weil der UV-Laser und die IR-Laser im Einklang bewegen, gibt es keine Notwendigkeit, ständig den UV-Laser jedes Mal wieder zu finden die Position geändert wird.
9. Wählen Sie die " Freihandzeichnen " option in der " wählen Sie Tools-Bereich ". Mit einem Touchscreen-Stift, zeichnen Sie im Umkreis der Region des Interesses während darauf achten, nicht den Kontakt zwischen dem Touchscreen und dem Stift Kopf verlieren. Achten Sie darauf, die Anfangs- und Endpunkte miteinander zu verbinden.
   Hinweis: IR-Spots werden festgelegt werden automatisch durch die Software, aber der Benutzer kann wählen, legte sich zusätzliche Spots zu gewährleisten, das Gewebe ist an der Kappe eingehalten, nachdem UV schneiden durchgeführt worden ist.
10. Für FrA Sammlung, führen Sie eine grobe Laser Erfassung der kortikalen Gewebe bis zu wenn die M2-Kortex am Bregma 5,16 mm steht.
    Hinweis: Dieses Detail kann geändert werden, so dass nur bestimmte Teile des FrA oder bestimmte Zelltypen gesammelt werden.
11. Für AcbC Sammlung, Laser Capture eine Gegend in der Nähe in der Nähe der RH.
    Die Kern und Schale von der AcbC verschiedene Funktionen und sind physiologisch einzigartig. Daher ist es wichtig, die Gehirn-Atlas so nah wie möglich zu folgen. Es empfiehlt sich, sammeln von nicht weiter vorbei an Bregma 0,84 mm, wie die beiden Subregionen zu eng mit einander verbunden werden.
12. Für Hp Sammlung, Laser erfassen die CA 1, 2 und 3 hippocampal Unterfelder beginnend am Bregma 3,00 mm und mit vollständig ausgebildeten GrDG als eine physische Wahrzeichen für morphologische Identifikation.
    Hinweis: Für die Zwecke dieser Studie, sammeln Sie keine Vergangenheit Bregma-4,780 mm, die optisch als Punkt abgegrenzt werden können, wenn die Hp Unterfelder verschmolzen sind und ventral zeigen. Dieser Bereich wurde gewählt, da am meisten verletzt Neuronen können entdeckt werden, direkt nach der Verletzung Seite ⁶.
13. Für SCN Sammlung zuerst visuell identifizieren die dicht gepackten Kerne, die dorsale, die Och sitzen und dann sammeln.
14. Nach Sammlung von Regionen (siehe oben), LCM-Makro-Kappen zum Verschieben der " QC Position " und inspizieren für Einhaltung der komplette Gewebe optisch dadurch UV geschnitten Gewebe an der Membran befestigt ist. Schnell setzen Sie die Kappe Ontoan RNase-freie 0,5 mL dünnen ummauerten Reaktionsgefäß mit 100 µL der Zelle Lysis Puffer.
15. Vortex Proben kurz zu gewährleisten komplette Lyse bei-80 ° c lagern Zu diesem Zeitpunkt LCM kann angehalten und Proben aufbewahrt bis zur nachgelagerten Genomanalyse ⁶.

Ergebnisse

Im Schaltplan dargestellt in Abbildung 1 veranschaulicht die gesamten Arbeitsablauf von Atlas geführte LCM von bestimmten Gehirnregionen und nachgelagerte Analyse Anwendungsmöglichkeiten. Diese Studie konzentriert sich auf vier Hirnregionen mit TBI Pathophysiologie und zur Entwicklung der Begleiterkrankungen: FrA, AcbC, SCN und Hp. Eine Einschränkung, die von bestimmten Gehirnregionen in LCM vorhanden ist, dass anatomische Standorten oft durch einen Mangel an definierte Grenzen verdeckt sind, wie in Abbildung 2 (A, D, G, J)gesehen werden kann. Die Verwendung eines Gehirn-Atlas zu führen-Schnitt und laser-Erfassung bestimmter Regionen verringert die Gefahr einer Kontamination der Probe mit Hirnregionen als das Ziel. Wenn darauf geachtet wird, Gewebe Sehenswürdigkeiten, beim Schneiden und nach Nissl-Färbung folgen, bieten LCM-Technologie eine äußerst konsistente Möglichkeit des Erwerbs von diskreten Populationen von Zellen, Kernen oder Regionen¹⁵. Die langfristigen Ziele dieser Studien sind Gene und Micro-RNAs, die potenziell als Surrogat, dienen können nichtinvasive Biomarker der Region bestimmten Hirnverletzung zu identifizieren. Der erste Schritt in dieser Biomarker-Entwicklungs-Pipeline ist die Charakterisierung der gewebespezifischen transcriptional Änderungen nach experimentellen TBI. Diese Daten können dann mit Verletzungen verursachten Veränderungen in zirkulierenden auszahlt korreliert werden.

Die vorgestellten Verfahren wurden optimiert, zur Verringerung des Risikos der RNA-Abbau um RNA Analyse über reverse Transkription von Gesamt LCM-RNS vor quantitative Echtzeit-PCR (RT-qPCR) zu ermöglichen. Gesamt-RNS (einschließlich der kleinen und großen RNA-Spezies) wurde mit einem spaltenbasierten Isolationsmethode auf Gewebe, das Laser-eingefangen von einzelnen Gehirnregionen war isoliert. RNA-Integrität, Qualität und Quantität nach Isolierungsmaßnahmen bewerten, wurden RNA-Proben kurz bei 70 ° C denaturiert und laufen auf einem RNA-Analysator. Qualitative Messungen enthalten Peak Amplituden der 18 s und 28 s rRNA Bands ()Abbildung 3(), die Vertreter der allgemeinen Verschlechterung sein können, zu analysieren und anhand der "RNA Integrität" (RIN). Wenn Sie vorsichtig RNase-freie Techniken verwenden, isoliert RNA von LCM Proben in der Regel Ergebnisse in RINs, die reichen von 6-8. Eine niedrigere RIN kann bedeuten schlechten RNA-Qualität und die Genauigkeit der gen- und MicroRNA Expressionsanalyse möglicherweise verringern kann. Umgekehrt kann eine höhere RIN Vertrauen in die Gültigkeit der Ergebnisse der RNA-Analyse verbessert werden.

RT-qPCR erfolgte mittels Primer/Sonden-Sets für einzelne Gene und Micro-RNAs (Abbildung 4). Ca. 1 ng von Gesamt-RNS war umgekehrt in cDNA umgeschrieben und bereits verstärkt, bevor qPCR laut Protokoll des Herstellers durchgeführt wurde. Verletzungsbedingte Gene untersucht in dieser Studie gehörten BCL2 verbunden X, Apoptose-Regler (Bax), B-Zell-CLL/Lymphom-2 (Bcl-2), Caspase-3, Apoptosis-Related Cystein Peptidase (Casp3) , Brain Derived Neurotrophic Factor (Bdnf) und CAMP Responsive Element Binding Protein 1 (Creb). MiR-15 b wurde ausgewählt, weil sich gezeigt hat, nach experimentellen TBI in einzelnen sterbenden Neuronen verändert werden. Es wurde auch experimentell überprüft und Bioinformatically vorausgesagt gen Ziele mit pro-Überlebensfunktionen (unveröffentlichte Daten). Normalisierte Falte-Änderung-Verhältnisse wurden durch Vergleich gen und MicroRNA Ausdruck in TBI Tiere und naiv-Steuerungen mit Normalisierung zu einem endogenen gen (Gapdh) oder kleine RNA (U6), bzw. ΔΔCt-Methode berechnet. Eine Falte-Änderung über 1 zeigt eine allgemeine Hochregulation in diesem Gen oder MicroRNA, und umgekehrt, eine Falte niedriger als 1 zeigt eine Herabregulation ändern. Statistische Analyse zeigte signifikanten Veränderungen in der Genexpression zwischen TBI und naiv Kontrolle (p ≤ 0,05), die Region des Gehirns angewiesen waren. Keine nennenswerten Veränderungen in MiR-15 b Ausdruck wurden zwischen die TBI und naiv Steuerung erkannt, aber gab es Entwicklungen in Richtung einer höheren und niedrigeren Ausdruck in einem Gehirn Region abhängigen Mode. Diese Daten deuten darauf hin, dass die weitere Optimierung notwendig, Änderungen in MicroRNA Ausdruck zu beurteilen ist. Es ist auch möglich, die Größe der Stichprobe zu klein, um statistische Signifikanz, teilweise aufgrund der inhärenten Variabilität im Ausdruck zu gewinnen war. Zukünftige Studien werden auch Augenwischerei betrieben Tiere um sicherzustellen, dass gen und MicroRNA Ausdruck Änderungen sind TBI und nicht durch die chirurgische Vorbereitung zurückzuführen.

Abbildung 1: Workflow der Atlas-geführte LCM für nachgeschaltete Genomanalyse. (A-F) Verfahren aus tierischen Vorbereitung zur nachgelagerten qPCR-Analyse: (A) Erwachsenen, männlichen Sprague-Dawley Ratten (~ 6 Wochen alt und mit einem Gewicht von 300 g) betäubt, Fluid Percussion TBI unterzogen und Human eingeschläfert 24 h nach der Verletzung. (B) Serienschnitte (30 µm) frisch gefrorenen Gehirne basieren auf Koordinaten von bestimmten Gehirnregionen (FrA, AcbC, Hp, SCN) aus Paxinos und Watsons The Rattengehirn Atlas. (C) Abschnitte sind feste, Nissl gebeizt (1 % Cresyl violett), dehydriert, und luftgetrocknet. (D). LCM durchgeführt auf Hirnregionen mit einem LCM-System identifiziert. (E) LCM Makro Kappen auf eine RNase-freie 0,5 mL-Tube mit 100 μL der Zelle Lysis Puffer übertragen und bis zur RNA-Isolierung für nachgeschaltete Genomanalyse bei-80 ° c gelagert. RNA kann dann rückwärts transkribiert für gen oder MicroRNA RT-qPCR-Analyse, differentielle Expression der molekularen-Zielen nach TBI und/oder zwischen Hirnregionen von Interesse (F)zu untersuchen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: LCM von TBI betroffenen Hirnregionen. Repräsentative Bilder von Gewebeschnitten gesammelt von der ipsilateralen Seite der Verletzung Aufstellungsort mit IR und UV-laser-Funktionen auf dem LCM-System (A-ich). Gewebe wurde geschnitten auf einem Kryostat (30 µm) und auf den Stift Membran Folien gesammelt. Abschnitte wurden dann behoben, Nissl-gefärbt mit Cresyl violett (1 %) und zur Identifizierung von bestimmten Gehirnregionen basierend auf anatomischen Landmarken in Paxinos und Watsons die Ratte Gehirn Atlas verwiesen dehydriert. (A-C) Ein Bereich des frontalen Verein Kortex (FrA) (D-F) Komponenten der CA1, CA2 und CA3 pyramidalen Schichten des Hippocampus (Hp) befindet sich neben der voll ausgebildeten Hörner der Granulat-Schicht dentate Gyrus (GrDG). (G-ich) Ein Bereich des Nucleus Accumbens coRe (AcbC) proximal und rostral an der vorderen Kommissur (Aca). (J-K) Suprachiasmatischen Kern (SCN) rostral zu supraoptischen Chiasmus (Och). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3. Vertreter-Scans von RNS-Qualität. Vertreter Electropherograms und zugehörigen Gelbilder RNA abgeleitet von LCM gesammelt Gewebe (A-D). Electropherograms und damit verbundenen Gelbilder zeigen intakt RNA anhand der Darstellung der 18 s und 28 s rRNA Gipfeln und Gel-Bands. Diese RNA eignet sich für alle downstream-Anwendungen, einschließlich genomic und Proteomic Analysen. (A) Frontal Verein Kortex (FrA) RNA. RIN 6.1. (B) Hippocampus (Hp) RNA. RIN 4.4. (C) Nucleus Accumbens Kern-RNA (AcbC). RIN 7.3. (D) Suprachiasmatic Nucleus (SCN) RNA. RIN 7.6. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4. Nachgelagerte Analyse des Gehirns regionsspezifische gen und MicroRNA Ausdruck über RT-qPCR. Einzelnen RT-qPCR für Gene von Interesse (Bcl-2, Bdnf, Casp3, Bax, Creb) und MicroRNA von Interesse (MiR-15 b) erfolgte am Laser erfasst Hirnregionen nach TBI (Hp und AcbC n = 5, FrA n = 4) und im Vergleich zu unverletzt naiven Tieren (n = 4). Analyse von Genen im Zusammenhang mit TBI Pathogenese erfolgte für Hp, AcbC, FCx. Daten als normalisierte Falte Änderung Verhältnisse im Vergleich zu naiv Kontrolle Hirnregionen dargestellt wird (ungepaarten t-Test mit Welch es Korrektur ± SEM; * p ≤ 0,05) (A). Differentielle Expression von MiR-15 b in verschiedenen Gehirnregionen wird als normalisierte Falte Änderungen im Vergleich zur naiven Kontrolle (± SEM) präsentiert (B). Daten vom SCN (n = 2) nicht enthalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

LCM ist für molekulare Studien über das Gehirn von Säugetieren eine wesentliche Technik geworden. Dieser Artikel zeigt, dass durch die Kombination der IR und UV-Laser Schneiden im LCM System genomische Veränderungen in jeder Region das Gehirn von Säugetieren erfassen kann. Diese Regionen sind mit konventionellen LCM-kompatiblen Flecken wie Cresyl violett oder Hämatoxylin und Eosin identifizierbar. Die Geschwindigkeit des Laser-Capture-Prozess und Leistungsfähigkeit LCM auf dickeren 30 µm Bereiche auf Stift Membran Folien ermöglicht nicht nur ausreichende Mengen von Zellproben zu erhalten, sondern auch RNA von LCM Proben geeigneter Qualität für alle Arten von nachgelagerten zu isolieren genomische Analyse; Diese Analysen umfassen Microarrays¹⁶, PCR-Arrays¹⁷und quantitative Echtzeit-PCR-¹⁸.

Unsere Daten liefern eine Begründung für Studien, die LCM Gewebe zu nutzen. Wir finden, dass MiR-15 b hochreguliert in den Hippocampus und Cortex (Abbildung 4) aber herunterreguliert in dem Nucleus Accumbens und möglicherweise biologisch relevant für das Verständnis der unterschiedlichen Auswirkungen der TBI im Gehirn. Eine frühere Studie vorgeschlagen, dass Erhöhungen der kortikale neuronale Anfälligkeit für Verletzungen durch Überexpression von mehreren MiRNAs entstehen, die pro-überleben Gene, wie Bcl-2¹⁹negativ regulieren. Ziel-Scan Analyse zeigt Bcl-2 unterliegt auch MiR-15 b; so, unsere Daten deuten darauf hin eine mechanistische Erklärung dafür, warum bestimmte Regionen des Gehirns (d. h., FCx) selektiv für TBI anfällig sein kann. Es ist wichtig zu erinnern, die meisten Gene werden durch mehrere MiRNAs geregelt und korrelierenden Veränderungen in jedem ein MiRNA zu einem bestimmten Ziel-gen ist schwierig. Diese Daten zeigen, dass bestimmte Veränderungen im gen und MicroRNA Ausdruck als Biomarker der Region-spezifischen Hirnschäden verwendet werden können. In der Tat, wir nutzen derzeit diese Daten in Studien Wirkstoffe mit antidepressive Eigenschaften wie neue neuroprotektive differentiell gen und MicroRNA Ausdruck in den Gehirnregionen verbunden mit neuropsychiatrischen Störungen beeinflussen können. Eine Einschränkung unserer Studie ist, dass während der mehrere Schritte der Folie Verarbeitungsverfahren für LCM RNA Integrität beeinträchtigt werden kann. Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte zur Verringerung des Risikos der RNA-Abbau. Eine weitere Einschränkung ist die relativ kleine Stichprobengröße für die statistische Berechnung verwendet. In Zukunft sollten Studien, Erhöhung der Stichprobengröße die Auswirkungen der Gene und MiRNA Ausdruck Unterschiede zwischen den einzelnen Tieren verringern.

Der Vorteil der LCM ist in translational genomischer Studien mit Tiermodellen der Krankheit beim Menschen und kranke Gewebe^20,21,22,23realisiert. Ohne die Fähigkeit, spezifische Zellpopulationen zu erfassen wäre die transcriptional Profile der verschiedenen Gehirnregionen eine unerkennbar und düster Mischung von vielen Zelltypen. Mit LCM Methoden im Gehirn Verletzungen Studien führte zur derzeitigen Bemühungen, Gehirn Region spezifische Biomarker zu beschreiben und zu verstehen, wie sie korrelieren mit zirkulierenden Biomarkern der TBI.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arcturus Laser Capture Microdissection System	Applied Biosystems (Life Technologies)
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA
Agilent 6000 Pico Kit	Agilent Technologies	5067-1513
Arcturus PEN Membrane Glass Slides	Applied Biosystems (Life Technologies)	LCM0522
Capsure LCM caps	Applied Biosystems (Life Technologies)	LCM0211/LCM0214
Cresyl Violet Acetate	Sigma-Aldrich	C5042-10G
Xylene (Histological grade)	Fisher Scientific	X3P-1GAL
Ethanol 200 proof (Histological grade)	UTMB Pharmacy
RNAqueous Micro- Kit	Life Technologies (Ambion)	AM1931
Taqman Gene Expression Primer/Probes	Applied Biosystems (Life Technologies)	4331182
Taqman microRNA Expression Primer/Probes	Applied Biosystems (Life Technologies)	A25576
Lightcycler 96 System	Roche