Grundzustand Erschöpfung Super-Resolution Imaging in Säugerzellen

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für den Nachweis von einem oder mehreren Plasma und/oder intrazellulären Membranproteinen mit Grundzustand Erschöpfung (GSD) Super-Auflösung Mikroskopie in Säugerzellen. Hier besprechen wir die Vorteile und die Überlegungen der Verwendung solcher Ansätze zur Visualisierung und Quantifizierung von zellulären Proteinen.

Zusammenfassung

Fortschritte in der Fluoreszenz-Mikroskopie und Zellbiologie korrelieren eng mit der verstärkten Fähigkeit zu visualisieren, zelluläre Ereignisse führt häufig zu dramatischen Sprünge in unserem Verständnis, wie Zellen funktionieren. Die Entwicklung und Verfügbarkeit der Höchstauflösung Mikroskopie wurde erheblich erweitert die Grenzen der optischen Auflösung von ~ 250-20 nm. Biologen sind nicht mehr nur auf die Beschreibung der molekularer Interaktionen in Bezug auf NS1 innerhalb eines Bereichs von Beugung begrenzt, sondern es ist nun möglich, die dynamischen Wechselwirkungen einzelner Moleküle zu visualisieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Visualisierung und Quantifizierung von zellulären Proteinen Grundzustand Erschöpfung Mikroskopie für feste Zelle Bildgebung. Wir bieten Beispiele aus zwei verschiedenen Membranproteinen, Bestandteil des endoplasmatischen Retikulum Translocon, sec61β und^{einer Plasmamembran lokalisiert Voltage-gated Typ L Ca 2 +} -Kanäle (Ca_V1.2). Diskutiert werden spezifische Mikroskop Parameter, Fixierung Methoden, Foto-Umschaltung Puffer Formulierung und Fallstricke und Herausforderungen der digitalen Bildverarbeitung.

Einleitung

Zelluläre Reaktionen Signalisierung übersetzen wechselnde interne und externe Umgebungen um eine zelluläre Reaktion zu initiieren. Sie regelt alle Aspekte der menschlichen Physiologie, dienen als Grundlage für Hormon und Neurotransmitter-Freisetzung, der Herzschlag, Vision, Düngung und kognitive Funktion. Störung der diese Signalisierung Kaskaden kann gravierende Folgen in Form von pathophysiologischen Bedingungen wie Krebs, Parkinson und Alzheimer-Krankheit haben. Jahrzehntelang haben biologischer und medizinischer Forscher erfolgreich fluoreszierende Proteine, Sonden und Biosensoren gepaart mit Fluoreszenz-Mikroskopie als die wichtigsten Tools verwendet, um die genaue räumliche und zeitliche Organisation dieser zelluläre verstehen Signale.

Die Stärken des optischen Techniken wie Epifluoreszenz, konfokale, oder Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) sind ihre Empfindlichkeit, Geschwindigkeit und Kompatibilität mit live Cell imaging, während die große Einschränkung ist ihre Beugung begrenzte Auflösung, Bedeutung Strukturen oder Proteinkomplexe, die kleiner als 200-250 nm können nicht aufgelöst werden. Mit der theoretischen und praktischen Entwicklung von deterministischen Höchstauflösung (z.B.stimulierte Emission Depletion Mikroskopie (STED-¹), strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM²) oder stochastische Höchstauflösung (z.B. , photoaktiviert Lokalisierung Mikroskopie (PALM³) oder Grundzustand Erschöpfung (GSD^4,5)), laterale und axiale Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie erweitert darüber hinaus die Beugung Barriere zu Gunsten von Dutzende von Nanometern. So haben Ermittler nun die unvergleichliche Fähigkeit zu visualisieren und zu verstehen, wie Proteindynamik und Organisation Funktion auf in der Nähe von molekularer Ebene übersetzt.

Grundzustand Erschöpfung Mikroskopie gefolgt von einzelnen Molekül zurück (GSDIM) oder einfach GSD umgeht wie es bekannt ist, die Beugungsgrenze durch Reduzierung der Anzahl der gleichzeitig emittierende Fluorophore^4,5. Hochenergie-Laser-Licht wird zur begeistern der Fluorophore beschriftet Probe, bombardieren Elektronen mit Photonen und erhöhen die Wahrscheinlichkeit sie unterziehen einen "Spin-Flip" und geben Sie die Triole oder "Dark-Staat" aus dem angeregten Zustand⁴. Dies verbraucht effektiv den Grundzustand, daher der Name "Boden stand Erschöpfung". Im Triplett-Zustand Fluorophore emittieren keine Photonen und die Probe erscheint dunkler. Jedoch diese Fluorophore stochastisch in den Grundzustand zurück und können durch mehrere Photonen emittieren aufgeregt Grundzustand Übergänge vor der Rückkehr in den Triplett-Zustand gehen. Mit weniger Fluorophore aussenden zu einem bestimmten Zeitpunkt, Photon platzt aus einzelnen Fluorophore werden räumlich und zeitlich voneinander benachbarte Fluorophore emittiert. Das Platzen der Photonen kann mit einer Gaußschen Funktion, fit sein, die Position der Fluorophor mit einer Genauigkeit der Lokalisierung der berechneten Schwerpunkt davon, die abhängig von der numerischen Apertur (NA) des Objektivs, die Wellenlänge des Lichts verwendet entspricht für Erregung und entscheidend ist, die Anzahl der Photonen pro Fluorophor. Eine Einschränkung der GSD ist, dass da nur eine Teilmenge der Fluorophore aktiv jederzeit abgibt, Tausende von Bildern über mehrere Minuten zum Aufbau einer vollständigen Lokalisierung Karte gesammelt werden müssen. Die lange Erfassungszeit kombiniert mit der hohen Laser Leistungsbedarf bedeutet, dass GSD besser repariert anstatt live Proben geeignet ist.

Dieser Artikel beschreibt die Vorbereitung von festen Proben für die Höchstauflösung Mikroskopie Bildgebung der Membrane und das endoplasmatische Retikulum (ER)-resident Proteine (für eine Liste der notwendigen Verbrauchsmaterialien und Reagenzien siehe Tabelle of Materials). Beispiele wie dieses Protokolls leicht angepasst, um die Größe und Grad der Cluster-Bildung von L-Typ Voltage-gated Ca^{2 +} -Kanäle (Ca_V1.2) in das Sarkolemm von kardialen Myozyten zu quantifizieren, oder verwendet werden kann, die zelluläre Verteilung von der Notaufnahme zu visualisieren, werden demonstriert. Verständnis für die Verteilung und Organisation dieser zellulären Komponenten ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Einleitung, Übersetzung und letztlich die Funktion der vielen Ca^{2 +}-abhängige Signalisierung Kaskaden. Zum Beispiel sind Ca_V1.2 Kanäle für Erregung-Kontraktion Kupplung, während Rezeptor-vermittelte Ca^{2 +} Entlassung aus der ER vielleicht die allgegenwärtige Signalkaskade in Säugetierzellen ist grundlegend wichtig.

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Protokoll

1. Waschen Glasdeckgläser

1. am Vortag Probenverarbeitung, reinigen #1.5 Glasdeckgläser in einer 1 M Lösung von KOH 1 h beschallen. Dies entfernt alle fluoreszierenden Verunreinigungen, die auf den Deckgläsern vorhanden sein können.
   1. KOH von Deckgläsern mit deionisiertes Wasser gründlich zu spülen.
   2. Einmal in KOH gereinigt, speichern in 70 % igem Ethanol bis zum Gebrauch der Deckgläsern.

2. Beschichtung Glasdeckgläser

Hinweis: Schritte in diesem Abschnitt sollte durchgeführt werden, in eine Zelle Kultur Haube um Kontaminationen zu vermeiden.

1. Zange verwenden, um die 70 % ige Ethanol-Lösung eine individuelle Deckglas entziehen und rasch Flamme um den Überschuss zu entfernen. Legen Sie die Deckgläsern in einer 6-Well-Platte. Flammen in einem Kultur-Abzug nicht möglich ist, sollten Autoklavieren die Deckgläsern nach dem Spülen mit deionisiertes Wasser und/oder Sterilisation unter dem UV-Licht in der Kultur-Haube für mindestens 30 Minuten
2. Adhäsion der Zellen Beihilfen, Beschichten Deckgläsern mit sterilen 0,01 % Poly-L-Lysin für 1 h bei Raumtemperatur.
3. Aspirieren der Poly-L-Lysin und spülen Sie die Deckgläsern mit sterilen Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). An der Luft trocknen und legen Sie über Nacht in den Kühlschrank stellen.
4. Am nächsten Morgen die Deckgläsern aus dem Kühlschrank nehmen und fügen Sie 300 µL Laminin, bei einer Konzentration von 50 µg/mL, für mindestens 30 min bei Raumtemperatur. Sicherzustellen, dass die Laminin direkt auf das Deckglas vorsichtig platziert ist.
   Hinweis: Diese Laminin Schritt ist nicht erforderlich für COS-7 oder HEK293 Zellen aber erforderlich für isolierten ventrikulären Myozyten. Andere primäre Zellen wie z. B. vaskulären glatten Muskelzellen oder Nervenzellen einhalten können besser zu Kollagen oder Fibronektin beschichtet Deckgläsern.

3. Vorbereitung der Zellen

1. kultivierten Zellen
   1. wachsen COS-7 Zellen (oder bevorzugte Zelllinie) auf einen 10 cm Kulturschale in 10 mL Dulbecco ' s geändert Eagles Medium (DMEM) Kulturmedium ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin (PS) Lösung. Wachsen die Zellen in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO ₂.
   2. Wenn die Zellen erreichen 90 % Konfluenz, ernten sie aus 10 cm Teller durch Absaugen der DMEM Medien und Hinzufügen von 5 mL Trypsin-EGTA-Lösung 0,05 %. Sobald die Zellen beginnen sich zu runden und lösen, sofort neutralisieren Sie die Trypsin mit ergänzt DMEM.
      1. Verwendung einer 5 mL serologische Pipette auf die Zellen aus der Schale entfernen. Pipette das Medium gegen die Basis der Schale mehrmals um alle Zellen zu entfernen, die bleiben Anhänger und homogen zu verteilen, die Zellen in das Kulturmedium.
   3. Platte Zellen auf 35 mm-Kultur-Gerichte, 70 % Konfluenz zur Transfektion zu erreichen. Machen Sie das Volumen des Mediums in der Schale mit frischen DMEM/FBS/PS-Lösung bis zu 2 mL.
   4. Transfect COS-7 Zellen mit das gewünschte Plasmid DNA-Konstrukte (z. B. sec61β-mCherry-Plasmid), mit einer entsprechenden Transfection Reagens und laut Hersteller ' s Anweisungen.
      Hinweis: Es kann dauern 24-48 h für das Protein zum Ausdruck zu bringen, je nach dem Plasmid und/oder die Transfection Reagens verwendet.
2. Erwachsenen Maus ventrikuläre Myozyten
   1. erwachsenen Maus ventrikuläre Myozyten mit etablierten Langendorff Perfusion Methode ⁶ zu isolieren. Wieder aussetzen der daraus resultierenden Pellet der Myozyten im Medium 199 (M199) ergänzt mit 2,5 % FBS und 1 % PS.

4. Galvanischen Zellen

1. COS-7 transfizierten Zellen
   1. Aspirieren 2 mL DMEM/FBS/PS-Lösung von 35 Millimeter-Teller und 1 mL Ca ^{2 +}-freie PBS. Zurück die Schüssel in den Inkubator für 2 min. Ernte Zellen aus der Schale von ersten Absaugen der Ca ^{2 +}-kostenlose PBS und dann hinzufügen 1 mL Trypsin-EGTA-Lösung 0,05 %.
      1. Sobald die Zellen beginnen sich zu runden und lösen, sofort neutralisieren die Trypsin mit 1 mL ergänzt DMEM. Pipette vorsichtig nach oben und unten mehrmals darauf die transfizierten Zellen gleichmäßig verteilt 2 mL Trypsin-EGTA-DMEM Aufhängung.
   2. Platte transfiziert COS-7 Zellen auf Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläsern in eine entsprechende Dichte, so dass Einzelzellen visualisiert werden, und füllen Sie die Schale Volumen bis zu 2 mL DMEM/FBS/PS (z. B. das Deckglas 90 µL Zellsuspension hinzufügen dann fügen Sie 1.910 µL ergänzt DMEM, wirbeln Teller um Zellen gleichmäßig verteilen).
      Hinweis: Zellen müssen nicht gezählt werden, aber das Volumen der Zellen hinzugefügt werden, jedes Gericht ist die Konfluenz der Zellen abhängig.
   3. Rückkehr vernickelt Zellen in der Zelle Kultur Inkubator über Nacht zu den Zellen zu halten und zu erholen.
2. Erwachsenen Maus ventrikuläre Myozyten
   1. Aspirieren Laminin und Platte Myozyten direkt auf der beschichteten Deckgläsern in eine entsprechende Dichte, so dass einzelne Zellen visualisiert werden können. Dies hängt von der Dichte der lebensfähigen Zellen aus der Isolation.
   2. Balance die Zellsuspension in einer Kuppel auf dem Deckglas und in eine Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO ₂ ~ 45 min erlauben Adhäsion.

5. Fixierung der Zellen

1. Zellen aus dem Inkubator zu entfernen und vorsichtig Aspirieren Mediums.
   1. Spülen die adhärenten Zellen einmal mit PBS.
   2. Fix Zellen mit optimal an die individuelle Anwendung und Antikörper Fixiermittel.
      Hinweis: Ein wichtiges Kriterium zu beachten bei der Auswahl ein Fixiermittel ist die Erhaltung der Zellstruktur der Probe, während auch sicherstellen, dass es keine Konformationsänderung in das Antigen von Interesse. Für die Zwecke dieses Protokolls Fixierung mit 3 % paraformaldehyde/0.1% Glutaraldehyd (PFA/GA) und Fixierung mit 100 % Methanol diskutiert.
2. PFA/GA Fixierung von COS-7 transfizierten Zellen mit dem Ausdruck Sec61β-mCherry
   1. mischen 1,9 mL 16 % PFA und 20 µL 50 % GA und fügen Sie PBS zu einem Endvolumen von 10 mL.
   2. Add 1 mL frisch zubereitete PFA/GA Lösung für jedes Gericht von Zellen und Fix für 10 min bei Raumtemperatur.
   3. Aspirieren der PFA/GA und spülen Zellen 3 Mal mit PBS.
   4. Waschen die eingehalten Zellen mit PBS, 5 Mal für 5 Minuten. Führen Sie alle Waschschritte auf ein Rotator setzen auf eine moderate Geschwindigkeit (z. B. 50 Zyklen pro Minute).
   5. Als nächstes reduzieren die freien Aldehyd-Gruppen mit 1 mL frisch zubereitete 0,1 % Masse/Volumen Natriumborohydrid deionisiertes Wasser.
   6. Spülen Zellen zweimal dann waschen 3 Mal für 5 min in PBS, entfernen alle Spuren von Natriumborohydrid und der Alkohol, die es erzeugt, wenn sie mit freien Aldehyden reagiert.
3. Methanol Fixierung der erwachsenen Maus ventrikuläre Myozyten
   1. sorgfältig fügen Sie 1 mL eiskaltes 100 % Methanol zu den Zellen. Kippen Sie die 6-Well-Platte und pipette das Methanol gegen die Seitenwand nicht direkt auf das Deckglas. Dann kippen Sie die 6-Well-Platte zurück zur horizontalen erlauben das Methanol, gleichmäßig zu waschen über die Zellen. Fix für 5 min bei-20 ° c
   2. Aspirieren Fixiermittel und spülen Zellen 3 Mal mit PBS.
   3. Waschen die eingehalten Zellen mit PBS, 5 Mal für 5 min auf ein Rotator.

6. Blockiert eine unspezifische Bindung

1. Block für 1 h bei Raumtemperatur in der blockierenden Lösung (siehe die Tabelle der Werkstoffe).
   Hinweis: Verschiedene Lösungen können verwendet werden, um unspezifische Antikörperbindung einschließlich 3 % Rinderserumalbumin (BSA) oder nicht-immunen Serum aus der gleichen Art wie die primären Antikörper blockieren.

7. Erkennung

1. Primärantikörper Inkubation
   1. Aspirat die blockierende Lösung. Nicht waschen oder spülen.
   2. Bereiten Sie die primären Antikörper-Lösung wie folgt (siehe Schritt 7.1.5.): den primäre Antikörper zu einer Konzentration von 10 µg/mL zu verdünnen (oder Hersteller ' s vorgeschlagene Konzentration) in der Antikörperlösung Inkubation (Tabelle der Werkstoffe anzeigen ). Balancieren Sie dieses kleine Volumen auf dem Deckglas zu und legen Sie vorsichtig ein Quadrat aus Kunststoff Paraffin-Film an der Spitze. Dies hilft, das kleine Volumen der Antikörper auf das Deckglas verteilt und schützt vor Verdunstung.
   3. 6-Well-Platte in eine feuchte Kammer und inkubieren Sie über Nacht in den Kühlschrank stellen.
   4. Am Morgen entfernen Sie die Zellen aus der feuchten Kammer, sorgfältig entfernen Sie den Paraffin-Film quadratisch von der Oberfläche des das Deckglas und aspirieren Primärantikörper Lösung.
   5. Spülen mit PBS, 3 mal 5 Mal für 5 min mit Waschlösung Block dann waschen (siehe Tabelle der Materialien) auf den Rotator.
      Hinweis: Dieses Protokoll verwendet die folgenden Antikörper, Anti-RFP Maus monoklonale Antikörper für Bilder in Abbildung 2 dargestellt und Kaninchen polyklonale FP1 ⁷ Anti-Ca _V 1.2 Antikörper (ein Geschenk von Prof. Johannes Hell, UC Davis) für Bilder, die in Abbildung 3 dargestellt. In Bezug auf die feuchte Kammer eine Kunststoff Lunch-Box mit einem dicht schließenden Deckel, ausgekleidet mit feuchten Papiertüchern Werke. PBS darf für Waschschritte, aber dieses Protokoll verbessert die Kennzeichnung Spezifität und Hintergrund verringert mithilfe einer verdünnten blockierenden Lösung für Waschschritte.
2. Sekundärantikörper Inkubation
   1. aspirieren Sie die Waschlösung und 200 µL konjugierten Sekundärantikörper Lösung verdünnt 1:1,000 in Inkubation Antikörperlösung hinzufügen. Legen Sie ein Quadrat von Paraffin-Film auf dem Deckglas (siehe Schritt 7.1.2).
   2. Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
   3. Sekundärantikörper Absaugen und Spülen mit PBS 3 x.
   4. Zellen mit verdünnten blockierende Lösung 5 Mal für 5 min auf die Wippe zu waschen.
   5. Wash 3 Mal für 5 min mit PBS.
      Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Anti-Maus Alexa 647 konjugierten Sekundärantikörper und Anti-Kaninchen-Alexa 647 konjugierten Sekundärantikörper für Abbildung 2 und Abbildung 3, beziehungsweise. Für einzelne Protein Kennzeichnung, Alexa 647 ist die bevorzugte Fluorophor aufgrund seiner hohen Photon Graf (verbessert die Genauigkeit der Lokalisierung) und geringer Einschaltdauer (verbessert die Zeitauflösung) ⁸. Viele andere Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper Optionen, z. B. Atto oder Cy-Farbstoffe, zur Verfügung. Beziehen sich auf Dempsey Et al. ⁸ und Chozinski Et al. ⁹ für umfangreiche Auswertungen über die Eignung der verschiedenen Fluorophore/Farbstoffe für Super-Resolution Imaging.

8. Post-Fixierung (optionaler Schritt)

1. verdünnen 50 µL 50 % GA in 10 mL PBS eine 0,25 % GA-Lösung zu erhalten. Post-Zellen für 10 Minuten in dieser Lösung bei Raumtemperatur zu beheben.
2. Waschen mit PBS 3 Mal für 5 min auf ein Rotator.

9. Lagerung von Proben

1. lagern Proben im Kühlschrank (4 ° C) in einem Aluminium-Folie ausgekleidet-Behälter bis Bildgebung vor Licht zu schützen.
2. Für langfristige Lagerung von Proben (bis zu mehreren Monaten), speichern in PBS mit 3 mM Natriumazid, Bakterienwachstum zu verhindern.

10. GSD Super-Resolution Imaging Photoswitching Puffer Vorbereitung

1. vorzubereiten, der Sauerstoff Aufräumvorgang ' GLOX ' Lösung wie folgt:
   1. In einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch hinzufügen 12,5 µL Katalase (Lager 34 mg/mL), 3,5 mg Glukose-Oxidase und 0,5 µl 1 M Tris (pH = 8) 49,5 µL PBS.
   2. Vortex kurz zu Komponenten in Lösung auflösen dann Zentrifugieren bei 20.800 x g für 3 min bei 4 ° c
      Hinweis: Sauerstoff-Aufräumvorgang Lösungen wie GLOX, gegen Immunofluoreszenz gefunden. GLOX sollte bis zu einer Woche im Kühlschrank aufbewahrt werden. Wiederholen Sie die Zentrifuge Schritt jedesmal dient.
2. Photoswitching-induzierende vorbereiten Thiol-Lösung wie folgt:
   1. 100 mM β-Mercaptoethylamine (MEA) Lösung mit PBS-Puffer vorbereiten und verändern den pH-Wert auf pH 8 oder alternativ Nutzung β-Mercaptoethanol (βME). Speichern regelmÄÑig MEA-Lösung in den Gefrierschrank (-20 ° C) für bis zu 1 Woche.
3. Unmittelbar vor der Bildgebung, bereiten die endgültige Schaltungen Puffer auf Eis durch das Hinzufügen der Thiol und Sauerstoff-Aufräumvorgang Komponenten zusammen. Für 500 µL GLOX-MEA, 50 µL MEA 5 µL GLOX hinzufügen (pH = 8) und 445 µL saline Puffer (2,5 mL 1 M Tris pH = 8, 29,22 mg NaCl (10 mM Endkonzentration), 5 g Glucose und 47,5 mL Wasser). Alternativ für GLOX-βME-Lösung hinzufügen 5 µL GLOX 5 µL βME und Kochsalzlösung 490 µL Puffer.
   1. Die Lösungen auf dem Eis halten und verwenden Sie je nach Bedarf Proben auf Objektträgern Depression montieren.
      Hinweis: Thiol enthaltende Lösungen wie βME oder MEA induzieren Photoswitching Cyanin-basierte Farbstoffe wie Alexa 647 ¹⁰ oder Xanthene-basierte Farbstoffe wie Alexa 568. ΒME produziert bessere Ergebnisse mit Alexa 647 während MEA wird bevorzugt für Alexa 568 oder als 2-Proteine mit einem doppelten Kennzeichnung Ansatz unter Verwendung Alexa 568 und 647 abgebildet werden sollen. Der Puffer wird über einen Zeitraum von Stunden durch Versauerung verschlechtern. Dies führt zu einem Rückgang der Anzahl der durchschnittlichen Photon der Probe. Um dies zu verhindern, empfiehlt es sich, frisch Photoswitching Puffer nach 2-3 h oder wenn, entweder einen Rückgang der Anzahl der durchschnittlichen Photon oder eine bemerkenswerte Verlängerung der Verarbeitungszeit für induzierte Photoswitching festgestellt wird zu machen. Ein kürzlich erschienener Artikel beschrieben einen neuen bildgebenden Puffer Ox-EA die wir noch nicht getestet haben, aber angeblich Exponate stabilen pH für mehrere Tage Niveaus und besseren Ergebnissen als GLOX für Multi-Color imaging Anwendungen ^{11 führt}.

11. Montage der Proben

1. Mount Deckgläsern mit beschrifteten Zellen (siehe Abschnitte 1-9) auf die Depression Rutschen, mit 100 µL bildgebenden Puffer.
2. Seal die Ränder der Deckglas mit einem Silikonkleber, schnelle Oxidation des Puffers Bildgebung zu verhindern. Warten Sie einige Minuten, bis der Silikonkleber das Deckglas sonst voll ausgehärtet ist driftet beim abbilden.
   Hinweis: Silikonkleber härtet nicht, kommt es in Kontakt mit βME. Achten Sie darauf, die Ränder der Deckglas zu verhindern, dass der Silikonkleber Kontaktaufnahme mit den bildgebenden Puffer trocknen.

12. Bild Erwerb

1. Siehe Tabelle1 für eine Liste von imaging-Parameter in Abbildung 2 und Abbildung 3.
   1. Zu beginnen, wählen die geeigneten Laser zur Beleuchtung der Probe abhängig von der Fluorophor ausgewählt. In diesem Protokoll verwendeten SR GSD-System ist ausgestattet mit High-Power-Laser (488 nm, 1,4 KW/cm ²; 532 nm, 2,1 KW/cm ²; 561 nm, 2,1 KW/cm ² 642 nm, 2,1 KW/cm ²). Abbildung 2 verwendet die 642 nm Laser.
2. Verwenden eine Öl-Immersion-Objektiv mit einer hohen Na Die hier verwendeten SR GSD-System verfügt über eine HC PL APO 160 X / 1,43 NA Ziel.
3. Wählen Sie den entsprechenden dichroitischen bildgebenden Cube. Das SR-GSD-System in diesem Protokoll ist ausgestattet mit 488 HP-T, 532 HP-T, 568 PS-T 642 HP-T mit Emission Bandpass-Filter von 505-605 nm, 550-650 nm und 660-760 nm.
4. Wählen Sie die 2D Akquisitionsmodus. Stellen Sie die Kamera auf Frame-Transfer-Modus und Belichtung Zeit auf 10 ms (100 Hz). Legen Sie den EM-Gewinn auf 300. Wählen Sie die Nachweisgrenze.
   Hinweis: Niedrige Schwellen erzeugen Bilder mit hoher Hintergrund. Das Signal von Interesse können hohe Schwellen herausfiltern. Bestimmen Sie den Grenzwert basierend auf negative Kontrollen wie imaging Deckgläsern nicht transfizierten Zellen oder Zellen mit nur Sekundärantikörper inkubiert.
5. Schalten Sie Auto Ereignissteuerung und festgelegte Ereignisse pro Bilder auf 8.
6. Geben Sie die Pixelgröße in der Registerkarte "GSD-Übernahme" (beginnen Sie mit 10 nm oder 20 nm Pixelgröße). Stellen Sie sicher, dass " Histogramm-Modus " wird in der GSD Registerkarte "Extras" unter das hochauflösende Bild Berechnungsoptionen vor Bildaufnahme ausgewählt.
7. Bild-Proteine an der Plasmamembran, wählen den TIRF-Modus und ändern den Einfallswinkel um die Eindringtiefe zu bestimmen.
8. , Elektronen an den dunklen Zustand (so genannte Pumpen) senden, Laserintensität auf 100 % eingestellt.
9. Wählen Sie Einzelmolekül-Erkennung beim Pumpen und stellen automatisch zu erwerben, wenn die Frame-Korrelation 0,20 ist.
10. Für Akquisition, Laserintensität auf 50 % eingestellt.
11. Legen Sie die Anzahl der Erwerb Frames auf 60.000.
    Hinweis: Die Ermittler kann feststellen, dass eine Probe mehr oder weniger Bildern als dies erfordert. Ändern Sie die Frameanzahl basierend auf Beobachtungen der Fluorophor Immunofluoreszenz und Stop, wenn keine weiteren Ereignisse nachweisbar sind.
12. Start Übernahme.
    Hinweis: Zu Beginn des Erwerbs, alle Farbstoffmoleküle sind im fluoreszierenden Zustand und wechseln Sie dann in den dunklen Zustand. Wenn die Frame-Korrelation 0.20 erreicht, startet Bilder erworben werden. Wenn weniger als 8 Veranstaltungen pro Frame erkannt werden, wird der 405 Laser einschalten, ermutigend Fluorophore, Übergang von der dunklen Zustand in den Grundzustand. Beim Erwerb von Bildern für ein Dataset von n = x Zellen von n = y Tiere, Parameter, wie z. B. TIRF Eindringtiefe, Nachweisgrenze und Anzahl der Frames erworben konstant gehalten werden sollen.

13. Bildanalyse

1. verwenden, um Protein-Clustergröße zu quantifizieren, die ' Partikel zu analysieren ' Merkmal des ImageJ.
   Hinweis: Weitere Analyse kann mit stochastischen optische Rekonstruktion relativen Lokalisierung Mikroskopie-basierte Analyse (Sturm-RLA) oder ähnliche ¹³ durchgeführt werden.
   1. Cluster-Analyse ( Abbildung 3) mit ImageJ wie folgt durchführen:
   2. Öffnen Sie die Image-Datei analysiert werden. Dies sollte eine 10 nm Histogramm Einzelmolekül Lokalisierung Karte, wie in der imaging-Software (Abschnitt 12) beschriebenen generiert.
   3. Stellen Sie die Helligkeit und den Kontrast des Bildes zu visualisieren: Klicken Sie auf das Menü "Bild", wählen Sie anpassen, dann Helligkeit und Kontrast. Klicken Sie auf die Option "Auto".
   4. Ändern Sie den Bildtyp in 8-Bit: Wählen Sie das Menü "Bild", dann wählen Sie Typ, und wählen Sie 8-Bit.
   5. Legen Sie den Maßstab des Bildes: das Analyse-Menü zu öffnen, klicken Sie auf Set Maßstab und geben Sie die folgenden Parameter: Abstand = 1, bekannt Entfernung = 10, 1 Pixel = 10 nm.
   6. Um die Messungen zu erreichenden auszuwählen, öffnen Sie das Analyse-Menü, wählen Sie Set Messungen und aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben der Option Bereich.
   7. Passen Sie den Schwellenwert des Bildes. Öffnen Sie das Menü "Bild", wählen Sie anpassen, und wählen Sie dann die Schwelle, wählen Sie über/unter. Verschieben Sie den maximalen Wert auf 255 und der Mindestwert 1 und klicken Sie auf anwenden.
   8. , Die Partikel zu analysieren das Analyse-Menü zu öffnen, wählen Sie Analyze Partikel. Setzen Sie ein Häkchen, um wählen Pixeleinheiten und zeigen Ergebnisse zusammenfassen. Legen Sie die Größe auf 4-unendlich (da Auflösung ~ 20 nm), wählen Sie die nackten Konturen-Option und klicken Sie auf ok. Eine zusammenfassende Datei erstellt werden, die die Analyse-Details wie die durchschnittliche Clustergröße und die Anzahl der Cluster im Bild enthalten wird.
      Hinweis: Vorsicht sollte ausgeübt werden, wenn so dass Rückschlüsse auf die Zahl der Proteine in einem bestimmten Cluster als die Anzahl der lokalisierte Punkte nicht linear mit der Anzahl der Proteine korreliert ist. GSD lokalisiert Farbstoffe, die konjugiert sind, Antikörper, wodurch ein Gestänge-Fehler, der das fluoreszierende Label aus der Epitops durch verdrängt > 10 nm in eine beliebige Richtung. Darüber hinaus Wenn polyclonal Antikörper verwendet werden, mehrere Antikörper kann an ein einziges Antigen binden und um das Problem weiter, kommerzielle sekundäre verwirren Antikörper sind konjugiert, im Durchschnitt ca. 3-6 Moleküle des Farbstoffes, so dass ein Fluorophor ist nicht immer gleich ein Protein. Gestänge-Fehler reduziert werden, indem Konjugation einen Farbstoff direkt an den primären Antikörper (Beseitigung der Sekundarstufe) oder eine gemeinnützige-basierte Kennzeichnung Schema ¹⁴.

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Ergebnisse

Wie in der Einleitung beschrieben, gibt es viele andere super-Auflösung Mikroskopie bildgebende Modalitäten. Dieses Protokoll konzentriert sich auf GSD Höchstauflösung Bildgebung. Repräsentative Bilder und Lokalisierung Karten sind in Abbildung 2 und Abbildung 3gezeigt.

Abbildung 2 zeigt eine COS-7-Zelle, mit der ER Protein, mCherry-Se...

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Diskussion

Die jüngste Explosion von Technologien, mit denen Bildgebung jenseits der Beugungsgrenze haben neue Fenster in die Komplexität der Säugetier-Zelle signalisieren in Raum und Zeit angeboten. Diese Technologien sind Sturm, STED, PALM, GSD, SIM und ihre Varianten (z.B. dSTORM, FPALM). Der Einfallsreichtum der Wissenschaftler hinter diesen Techniken ermöglichte uns, die Beschränkungen durch die Gesetze der Physik für die Beugung von Licht zu umgehen. Trotz dieser großen Leistung jede dieser Techniken macht ein...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOH	Thermo Scientific	P250-500	To clean coverglass
#1.5 coverglass 18 x 18 mm	Marienfeld Superior	0107032)	To grow/process/image cells
10x PBS	Thermo Scientific	BP3994	Dilute to 1x with de-ionized water
Poly-L-Lysine	Sigma	P4832	Aids with cell adhesion to cover glass
laminin	Sigma	114956-81-9	Aids with cell adhesion to cover glass
Medium 199	Thermo Scientific	11150-059	Ventricular myocyte culture media
DMEM 11995	Gibco	11995	Cell culture media
Fetal bovine Serum (FBS)	Thermo Scientific	10437028	Media supplement
Penicillin/streptomycin	Sigma	P4333	Media supplement
0.05% trypsin-EDTA	Corning	25-052-CL	Cell culture solution
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transient transfection reagent
Ca2+-free PBS	Gibco	1419-144	Cell culture
100 % Methanol	Thermo Fisher Scientific	A414-4	Cell Fixation
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Cell Fixation
Glutaraldehyde	Sigma Aldrich	SLBR6504V	Cell Fixation
SEAblock	Thermo Scientific	37527	BSA or other blocking solution alternatives exist
Triton-X 100	Sigma	T8787	Detergent to permeabilize cells
Rabbit anti-CaV1.2 (FP1)	Gift	N/A	Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003)
Mouse monoclonal anti-RFP	Rockland Inc.	200-301-379	Primary antibody
Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen (Thermo Scientific)	A31573	Secondary antibody
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen (Thermo Scientific)	A11031	Secondary antibody
Sodium azide	Sigma	S2002	Prevents microbial growth for long term storage of samples
Catalase	Sigma	C40	Photoswitching buffer ingredient
Glucose oxidase	Sigma	G2133	Photoswitching buffer ingredient
Tris	Sigma	T6066	Photoswitching buffer ingredient
beta-Mercaptoethylamin hydrochloride	Fisher	BP2664100	Photoswitching buffer ingredient
β-mercaptoethanol	Sigma	63689	Photoswitching buffer ingredient
NaCl	Fisher	S271-3	Photoswitching buffer ingredient
Dextrose	Fisher	D14-212	Photoswitching buffer ingredient
Glass Depression slides	Neolab	1 – 6293	To mount samples
Twinsil	Picodent	13001000	To seal coverglass
sec61β-mCherry plasmid	Addgene	49155
Leica SR GSD 3D microscope	Leica
ImageJ
Washing block solution			20 % SEAblock in PBS
Primary antibody incubation solution			0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS
Secondary antibody incubation solution			1:1000 in PBS