Vorbereitung der Chitosan-basierten injizierbaren Hydrogele und deren Anwendung in 3D Zellkultur

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine einfache Zubereitung von Chitosan-basierten injizierbaren Hydrogele mit dynamischen Imin Chemie. Methoden der Hydrogel mechanische Festigkeit und seine Anwendung in 3D Zellkultur anpassen werden vorgestellt.

Zusammenfassung

Das Protokoll stellt eine einfache, effiziente und vielseitige Methode um Chitosan-basierte Hydrogele mit dynamischen Imin Chemie vorzubereiten. Das Hydrogel wird durch das Mischen von Lösungen von Glykol Chitosan mit einem synthetisierten Benzaldehyd beendet Polymer Geliermittel vorbereitet und Hydrogele werden effizient in einigen Minuten bei Raumtemperatur erhalten. Durch unterschiedliche Verhältnisse zwischen Glykol Chitosan, Polymer Geliermittel und Wassergehalten ergeben sich vielseitige Hydrogele mit verschiedenen Gelierung Zeiten und Steifigkeit. Wenn beschädigt, kann das Hydrogel seine Auftritte und e-Modul durch die Reversibilität der dynamischen Imin Anleihen als Crosslinkages wiederherstellen. Diese selbst heilbar Eigenschaft ermöglicht das Hydrogel zu injizierbaren sein, da es nach dem Spritzvorgang selbst geheilt aus gepressten Stücke zu einer integralen Bulk-Hydrogel. Das Hydrogel ist auch Multi-reagiert auf viele bioaktive Reize durch unterschiedliche Gleichgewichtherstellung Status der dynamischen Imin Anleihen. Dieses Hydrogel wurde als biokompatibel, bestätigt und L929 Maus-Fibroblasten-Zellen waren eingebettete folgende standard-Verfahren und die Zellproliferation wurde leicht durch eine 3D Zellprozess Anbau beurteilt. Hydrogel bieten eine verstellbare Plattform für verschiedene Forschung, wo eine physiologische Imitation einer 3D-Umgebung für Zellen profitiert wird. Zusammen mit seiner Multi-reagieren, selbst heilbar und injizierbaren Eigenschaften kann die Hydrogele potenziell als mehrere Träger für Medikamente und Zellen in zukünftigen biomedizinischen Anwendungen angewendet werden.

Einleitung

Hydrogele sind vernetzte Polymerwerkstoffe mit großen Mengen an Wasser und weichen mechanischen Eigenschaften, und sie haben in vielen Bio-medizinischen Anwendungen^1,2benutzt worden. Hydrogele bieten eine weiche und feuchte Umgebung, die sehr zu den physiologischen Umgebung für Zellen in Vivo ähnlich. Hydrogele sind daher eines der beliebtesten Gerüste für 3D Zelle Kultur^3,4geworden. Im Vergleich zu 2D Petrischale Zellkultur, hat 3D Zellkultur schnell avancierte um zu bieten, dass eine extrazelluläre Matrix (ECM) ahmte Mikroumgebung für Zellen zu kontaktieren und für Proliferation und Differenzierung Zwecke⁵montieren. Darüber hinaus könnte Hydrogele, enthält natürliche Polymere bieten ein Umfeld, biokompatibel und Förderung für Zellen zu vermehren und³unterscheiden. Hydrogele aus synthetischen Polymeren abgeleitet werden bevorzugt für ihre einfachen und klaren Komponenten, die komplexen Einflüsse wie Proteine tierischen Ursprungs oder Viren auszuschließen. Unter all den Hydrogel-Kandidaten für 3D Zellkultur werden Hydrogele, die sind einfach vorbereitet und verfügen über eine einheitliche Eigenschaft immer bevorzugt. Die Anlage der Hydrogel Eigenschaften verschiedenen Anforderungen anpassen anpassen ist wichtig wie gut⁶.

Hier stellen wir eine einfache Vorbereitung ein Glykol Chitosan basierenden Hydrogel mit dynamischen Imin-Chemie, die eine vielseitige Hydrogel-Plattform für 3D Zelle Kultur⁷wird. Bei dieser Methode bekannte biokompatible Glykol Chitosan werden verwendet, um Bilder der Hydrogel-Netzwerke zu etablieren. Die Aminogruppen werden als Polymer Geliermittel, dynamische Imin Anleihen als Crosslinkages Hydrogele⁸zu bilden mit einem Benzaldehyd beendet Polyethylenglykol reagiert. Dynamische Imin Anleihen können bilden und zersetzen reversibel und entgegenkommend, Umgebung, stiften die Hydrogele mit mechanisch verstellbaren querverbunden Netzwerke^9,10,11. Aufgrund seiner hohen Wassergehalten, biokompatible Materialien und einstellbare mechanische Festigkeiten wird das Hydrogel als Gerüst für L929 Zellen in 3D Zelle Kultur^12,13erfolgreich eingesetzt. Das Protokoll hier beschreibt die Verfahren, einschließlich der Polymersynthese Geliermittel, Hydrogel Vorbereitung Zelle einbetten und 3D Zelle zu züchten.

Das Hydrogel zeigt auch einige andere Funktionen aufgrund seiner dynamischen Imin-Crosslinkages, einschließlich seiner Multi-reagieren auf verschiedene Bio-Reize (Säure/pH, Derivative Vitamin B6 Pyridoxal, Protein Papain, etc.), darauf hinweist, dass das Hydrogel sein könnte unter physiologischen Bedingungen⁸zersetzen induziert. Das Hydrogel ist auch selbst heilbar und injizierbare, was bedeutet das Hydrogel könnte über eine minimal invasive Injektion Methode verwaltet werden und einen Vorteil in der Drogen- und Zelle Lieferungen^14,15. Indem funktionelle Additive oder bestimmte vordefinierte Polymer Gelatoren Hydrogel ist kompatibel zur Gewinnung von spezifischen Eigenschaften wie magnetisch, Temperatur, pH-Wert reagieren, etc.^16,17, die zu erfüllen, könnte ein breite Palette von Forschungsbedarf. Diese Eigenschaften zeigen das Hydrogel potentielle Fähigkeit, eine injizierbare werden mehrere Träger für Medikamente und Zellen in Vitro und in Vivo biomedizinische Forschung und Anwendungen.

Protokoll

Vorsicht: konsultieren Sie bitte alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (SDB) vor dem Gebrauch. Bitte verwenden Sie geeignete Sicherheitsmaßnahmen beim Chemie-Experimente, einschließlich der Verwendung einer Dampfhaube und persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Schutzhandschuhe, Laborkittel, etc.) durchführen. Das Protokoll erfordert Standardzelle Umgang mit Techniken (Sterilisation, Zelle Erholung, Zelle Passagierung, Zelle Einfrieren, Zelle Färbung, etc.).

1. Vorbereitung der Hydrogele

1. 1. vor Austrocknung der PEG Synthese von Benzaldehyd beendet di funktionalisiert Polyethylenglykol (PEG DF) Polymer
      1. wiegen 4,00 g PEG (4.000 MW, 1,00 Mmol), übertragen sie in ein Rundboden-Flasche (250 mL), und fügen Sie Toluol (100 mL).
         Hinweis: Andere Heringe mit Molekülmassen können für die Hydrogel-Bildung arbeiten aber führt zu unterschiedlicher Steifigkeit.
      2. Heizen die Lösung mit einer Heißluftpistole (oder einer heißen Platte ca. 40 ° C) mild, die Polymere lösen zu helfen. Nachdem alle Polymere zu lösen, verwenden Sie einen Verdampfer, um die Lösungsmittel zu entfernen. Wiederholen Sie diese auflösen und Trockenverfahren zweimal um die getrockneten PEG Polymere,.
         Achtung: Dies sollte in einer Abzugshaube mit äußerster Vorsicht durchgeführt werden. Toluol ist brennbar.
   2. Benzaldehyd Kündigung Reaktion von PEG
      1. fügen Sie ein Magnetrührer und Tetrahydrofuran (THF, 100 mL) in den Kolben und PEG mit einem Rührer zu lösen. 4-Carboxybenzaldehyde (0,90 g, 6,0 Mmol) und hinzufügen 4-Dimethylaminopyridine (0,07 g, 0,6 Mmol) nacheinander die Lösungen für alle Körper vollständig aufzulösen.
      2. Add N, N '-Dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1,25 g, 6,0 Mmol) zur Lösung, und fügen Sie eine Trocknung Rohr, das wasserfreie CaCl ₂ bis die Flasche voll ist. Halten Sie die Reaktion unter Rühren bei Raumtemperatur (~ 20 ° C) für ca. 12 Std.
   3. Post-Reaktionsvorgangs
      1. herausfiltern der weißen Feststoff in die Lösung durch ein Vakuum erzeugt, nachdem die Reaktion beendet ist. Gießen Sie die Lösung in kalten Diethylether (500 mL) unter Rühren zu der weißen Feststoff ausgefällt. Die weißen Feststoffe durch Filter sammeln und Trocknen der Feststoffe in einer Dampfhaube.
      2. Der weißen Feststoff in THF wieder auflösen, unlöslichen weißen Feststoff herausfiltern, Gießen Sie die Lösung in frischem kalten Diethylether der weißen Feststoff ausgefällt und trocknen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei-bis dreimal, und legen Sie dann den weißen Feststoff in eine Vakuumtrocknung Ofen (20 ° C, 0,1 Mbar), um sie vollständig zu trocknen. Das weiße Pulver wie das fertige Produkt zu sammeln: Benzaldehyd beendet DF PEG.
2. Vorbereitung der Hydrogele
   1. wiegen unterschiedliche Mengen an DF PEG (0,11 g, 0,028 Mmol 0,22 g, 0,055 Mmol; 0,44 g, 0.110 Mmol) in einem Rohr (10 mL), deionisiertes Wasser (5,0 mL) hinzufügen und verwenden ein Wirbel oder Magnetrührer Das Polymer auflösen.
   2. Glykol Chitosan (0,495 g, 6,18 x 10 ^-3 Mmol) in entionisiertem Wasser (15,0 mL) in einem Rohr (50 mL) auflösen und einen Strudel für ein paar Minuten zu verwenden, um die Chitosan-Lösung (3 Gew.-%) homogenisieren.
   3. Glykol-Chitosan-Lösung (0,2 mL, 3 Gew.-%) und DF PEG Lösungen (0,2 mL) nacheinander in einer Röhre (2,0 mL) dazugeben. Verwenden Sie einen Wirbel um die Lösungen homogen zu Form Hydrogele in einigen Minuten mischen. Befolgen Sie die Verhältnisse in Tabelle 1 Hydrogele der unterschiedlichen Festigkeiten machen.
      Hinweis: Verwenden Sie die Röhre invertierenden Methode um festzustellen, ob das Hydrogel schon gebildet hat.
3. Rheologie Analysen
   1. Rheologie Analysen auf eine rotierende Rheometer mit einer parallelen Stahlplatte durchführen (Durchmesser: 20 mm). Verteilen Sie für die Gelierung Test Glykol-Chitosan-Lösung (0,2 mL, 3 Gew.-%) auf eine untere Platte. Dann fügen Sie DF PEG wässrige Lösungen (0,2 mL, 2 Gew.-%) gleichmäßig tropfenweise auf die Chitosan-Lösung-Oberfläche und mischen mit einer Pipette schnell. Tiefer unten die obere Platte und beginnen zu Test
   2. Für Hydrogel ' s Steifigkeit Test, schneiden ein Hydrogel in einem Kreis (Durchmesser: 20 mm) und Messen Sie die Speicher-Modul (G ') Werte im Vergleich zu Frequenzanalysen bei 1 % Dehnung. Typische G ' Werte bei 6,3 rad s ^{− 1} in Tabelle 1 aufgeführt sind.
      Hinweis: Analysen durchführen, die Rheologie Hydrogel 0,5 h nach der Hydrogel-Bildung um dynamische Bindung Stabilisierung der Hydrogel sicherzustellen.
   3. Für das Hydrogel ' s selbst heilbar-Eigenschaft zu testen, ein Hydrogel in Stücke schneiden und die Stücke zu heilen, ein integraler Teil versammeln. Dann schneiden Sie das Hydrogel Stück zu einem Kreis (Durchmesser: 20 mm) und legen Sie es auf dem Rheometer, die Rheologie-Analyse durchführen.

2. 3D Zellkultivierung in Hydrogele

1. Herstellung von Hydrogel Gelierung Lösungen
   1. wiegen DF PEG (0,44 g, 0,11 Mmol) in ein steriles Röhrchen (4,0 mL), in Zellkulturmedien (RPMI-1640, 2.0 hinzufügen (mL), und verwenden ein Wirbel oder Rührer Auflösen des Polymers um die Polymerlösung (20 Gew.-%) zu erhalten. Laden Sie die Projektmappe in einer Spritze (10,0 mL) und dann indem man es durch einen Bakterien-remanent Mikron-Filter (0,22 µm) zu sterilisieren.
   2. Wiegen der Glykol-Chitosan (0,165 g, 2,06 x 10 ^-3 Mmol) in ein steriles Röhrchen (15,0 mL), fügen Sie in Zellkulturmedien (RPMI-1640, 4,0 mL) und Wirbel zu helfen, das Polymer zu Glykol-Chitosan-Lösung (4,0 Gew.-%) auflösen. Laden Sie die Projektmappe in einer Spritze (10,0 mL) und mit einem Bakterien remanent 0,22 µm-Filter filtern.
2. Zellkultivierung in Hydrogele
   Vorsicht: führen Sie alle entsprechenden Verfahren in einer Gewebekultur Kapuze Zelle. Grundkenntnisse in steriler Technik wird erwartet.
   1. Vorbereitung der Zellsuspension
      1. Kultur L929 Zellen RPMI-1640 Medium ergänzt mit 10 % FBS, 5 % Penicillin (10 mL) in ein Petri-Schale (Durchmesser 10 cm), und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO ₂. Jeden Tag vor Gebrauch das Medium wechseln.
      2. Ernten die L929 Zellen mit PBS mit Trypsin (0,025 w/V %) und EDTA (0,01 % w/V), anschließend Zentrifugieren (70 X g, 5 min) und wieder auszusetzen, die Zellen im RPMI-1640 Medium (1,0 mL). Führen Sie die Zellzählung mit standard Operation Blut zählen Board. Wieder aussetzen die Zellen, um die Zellkonzentration zu justieren ~ 3,75 × 10 ⁶ Zellen/mL.
   2. Zelle Kapselung in Hydrogele
      1. L929 Zellsuspensionen (0,4 mL, 3,75 x 10 ⁶ Zellen mL ^-1) mit Glykol-Chitosan-Lösung (0,4 mL) in einem Rohr (4,0 mL) von Vortex mischen. Pipette L929/Glykol-Chitosan-Lösung (0,8 mL) in die Mitte einer konfokalen Petrischale (Durchmesser 2,0 cm). Pipette die DF PEG-Lösung (0,2 mL) in das gleiche Gericht und pipette vorsichtig mischen Sie die Lösung zu induzieren Hydrogel Bildung.
         Hinweis: Bewerten die Hydrogel-Bildung durch Kippen der Petrischale.
      2. Für direkte Zellkultur hinzufügen zusätzliche Mengen von RPMI-1640 Nährmedien (1,0 mL) auf das Hydrogel. Legen Sie die Zelle eingebettet Hydrogele (1,0 mL, 4,0 Gew.-% DF PEG, 1,5 Gew.-% % Glykol Chitosan 1,5 × 10 ⁶ Zellen mL ^-1) in einem Inkubator (37 ° C, 5 % CO ₂) und verändern Sie das Medium jeden Tag. Bereiten Sie für die Zelle Bildgebung am Tag 1, 3, 5 und 7 nach Zelle Kapselung.
   3. Vorbereitung der 3D Post-Zellkultur in Hydrogele nach Injektion, Zelle geladen Hydrogel (1,0 mL, siehe Punkt 2.2.2) in einer Spritze (10,0 mL, 48 G-Nadel). Nach der Hydrogel-Formen Hydrogel langsam in eine Petrischale für die konfokale Bildgebung zu injizieren. Fügen Sie einen zusätzlichen Betrag von Nährmedien (1,0 mL) auf das Hydrogel und ändern Sie es jeden Tag. Setzen der Petrischale in einem Inkubator (37 ° C, 5 % CO ₂) und bereiten sich für danach imaging.
      Achtung: Bitte überprüfen Sie und das Sicherheitsprotokoll Betrieb einer Spritze zu folgen.
3. Lebensfähigkeit Zellanalyse
   1. konfokale Beobachtung
      1. Spülen die Hydrogele mit PBS (1,0 mL) zwei Mal. Färben Sie die Hydrogele mit Fluorescein-Diacetat (FDA, 0,5 mL, 0,05 mg/mL) und Propidium Jodid (PI, 0,5 mL, 0,08 mg/mL) Lösungen für 15 Minuten. Nach dem Färben, entfernen Sie alle Lösungsmittel.
      2. Beobachten die Hydrogele mit einem konfokalen Mikroskop unter Erregung Wellenlängen von 488 nm und 543 nm live zu visualisieren und toten Zellen, beziehungsweise. Z-Stapel durch jeden 2 µm Tiefe der Hydrogele, eine gleichmäßige Verteilung der Zellen im ganzen zu validieren zu nehmen.
         Hinweis: FDA Flecken lebenden Zellen während PI abgestorbene Zellen Flecken.
   2. Degradieren Hydrogel (1,0 mL) mit Essigsäure (HAc, 3 V %, 1,0 mL) für 5 min und Pipette in ein Rohr (4,0 mL). Sammeln Sie Zellen durch Zentrifuge (70 X g, 5 min) zu und wieder auszusetzen Sie, die Zellen im Zellkulturmedium RPMI-1640 (1,0 mL). Zellzählung mit einem Blut zählen Board durchführen.

Ergebnisse

Eine schematische Darstellung dieses Protokolls auf Hydrogel Vorbereitung und seine Verwendung als 3D Zellkultur wird in Abbildung 1angeboten. Informationen der Hydrogel Inhalte und Kennzahlen mit unterschiedlichen Festigkeiten vorbereitet werden in Tabelle 1zusammengefasst. Das Hydrogel ist selbst heilbar und Rheologie-Eigenschaft stellt die Hydrogel Steifigkeit durch Speicher-Modul gegen frequenztest in Abbildung 2. Die Zelle konfokale Bilder ...

Diskussion

Das Hydrogel präsentiert in diesem Protokoll (Abbildung 1) besteht aus zwei Hauptkomponenten: natürliches Polymer Glykol Chitosan und synthetischen Benzaldehyd beendet Polymer Geliermittel DF PEG, die beide biokompatible Werkstoffe sind. Synthese von DF PEG wird vorgestellt mit einer einstufigen Modifikation Reaktion. PEG Molekulargewicht 4.000 wurde dieses Protokoll in Belange der Löslichkeit, Änderung Effizienz sowie Hydrogel Steifigkeit gewählt. Eine Reihe von Hydrogele mit unterschi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycol chitosan	Wako Pure Chemical Industries	39280-86-9	90% degree of deacetylation
4-Carboxybenzaldehyde	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	619-66-9	99%
N, N'-dicyclohexylcarbodiimide	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	538-75-0	99%
Calcium chloride anhydrous	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	10043-52-4	96%
4-dimethylamiopryidine	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	1122-58	99%
Polyethyleneglycol	Sino-pharm Chemical Reagent	5254-43-7	99%
Tetrahydrofuran	Sino-pharm Chemical Reagent	109-99-9	99%
Toluene	Sino-pharm Chemical Reagent	108-88-3	99%
Ethyl ether	Sino-pharm Chemical Reagent	60-29-7	99%
Acetic acid	Sino-pharm Chemical Reagent	64-19-7	99%
Anhydrous CaCl2	Sino-pharm Chemical Reagent	10043-52-4	99%
Fluorescein diacetate	Sigma	596-09-8	99%
Propidium iodide	Sigma	25535-16-4	94%
RPMI-1640 culture media	Gibco
Fetal bovine serum	Gibco
Trypsin-EDTA	Gibco		0.25%
PBS	Solarbio		0.01 M
Penicillin streptomycin solution	Hyclone		10,000 U/mL
Rheometer	TA Instrument		AR-G2
Confocal microscope	Zeiss		710-3channel
L929 Cells	ATCC		NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L
Evaporator	EYELA		N-1100
48 guage needle	ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD		48-guage
Microscope	Leica		DM3000 B
Microscope software	Imaris
Heat gun	Confu		KF-5843
Petri dish	NEST