In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, für die Erkennung von in Vivo Antigen-spezifische Tötung einer Ziel-Zelle in einem Mausmodell ermöglichen.

Zusammenfassung

Aktuelle Methoden zur antigenspezifischen Tötung sind beschränkt auf in-vitro- Verwendung oder bei Infektionskrankheiten Modelle verwendet. Allerdings gibt es kein Protokoll speziell antigenspezifischen töten ohne eine Infektion zu messen. Dieses Protokoll dient und beschreibt Methoden, um diese Einschränkungen zu überwinden, indem es ermöglicht für den Nachweis von Antigen-spezifische Tötung von einer Zielzelle durch CD8⁺ T-Zellen in Vivo. Dies geschieht durch eine Impfung-Modell mit einem traditionellen CFSE--markierten Ziel töten Assay zusammenführen. Diese Kombination erlaubt es den Forscher, die Antigen-spezifische CTL Potenzial zu bewerten, direkt und schnell, da der Test nicht Tumorwachstum oder Infektion abhängig ist. Darüber hinaus das Auslesen basiert auf Durchflusszytometrie und so die meisten Forscher leicht zugänglich sein sollten. Die große Einschränkung der Studie ist die Zeitachse in Vivo identifizieren, die die Hypothese getestet werden. Variationen in Antigen Stärke und Mutationen in T-Zellen, die im Differenzial Zytolyse-Funktion ergeben müssen sorgfältig geprüft werden, um den optimalen Zeitpunkt für die Zellernte und Bewertung zu bestimmen. Die entsprechende Konzentration des Peptids für die Impfung wurde optimiert für hgp100_25-33 und OVA_257-264, aber weitere Validierung für andere Peptide, die möglicherweise besser geeignet, eine gegebene Studie benötigt werden würde. Insgesamt dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle Beurteilung der Funktion in Vivo zu töten und kann an jedem bestimmten Antigen angepasst werden.

Einleitung

Mehrere Protokolle gibt es zur Beurteilung der Zytolyse (CTL) Potenzials eine CD8⁺ oder CD4⁺ T-Zellen. Diese Einschätzung kann ohne weiteres in Vitro unter kontrollierten Bedingungen^1,2,3erfolgen. Darüber hinaus haben Infektionskrankheit Modelle, wie z. B. LCM, CTL-Funktion durch den Einsatz von differentiell CFSE-(5-(and 6)-Carboxyfluorescein Diacetat Succinimidyl Ester) mit der Bezeichnung Zielzellen klassisch geprüft wo die CFSE-^Hallo-markierte Zellen sind gepulst mit einem Peptid und CFSE-^lo-ungepulsten beschrifteten Ziel Zellen sind links. Die Zellen sind dann im Verhältnis 1:1 gespritzt und bewertet für den Verlust von den CFSE-^Hallo-gepulste Ziele von Flow Cytometry⁴beschriftet. Impfstoff und Ablehnung Modelle haben auch ähnliche Strategien zur Beurteilung der in Vivo zu töten, indem beide CD8 verwendet⁺ und CD4-Zellen sowie NK Zellen^5,6+ T. Dies ist ein leistungsfähiges Assay, sondern erfordert die Verwendung von Infektionserregern, die das Immunsystem vor der Ziel-Injektion prime.

Dieses Protokoll auf der anderen Seite erfordert keine vorherige Infektion des Wirtes und nutzt stattdessen eine Impfstrategie um das Immunsystem vor der Ziel-Injektion prime. Diese Impfung ist eine wasserbasierte Formulierung der Peptid-Impfstoff, der Bereitstellung von einer immunstimulierenden cocktail namens Covax⁷, bestehend aus einem Toll-Like Rezeptor 7 (TLR7) erfordert bestehend Agonist (Imiquimod-Creme), eine agonistische Anti-CD40 Antikörper und Interleukin-2 (IL-2) führt zu synergistische Kombination von immunstimulierenden Agenten für die Erhebung von Peptid-spezifische Grundierung und robuste Immunantwort. Als solches bietet dieser Assay eine schnellere Auslesen der CTL-Funktion, da der Impfstoff nur drei Tage vor der Injektion von den Zielzellen zusammen mit den Zellen zur Beurteilung der Funktion verwaltet wird. Darüber hinaus ist die Covax Grundierung stark genug, dass die Tötung Kapazität des grundiert antigenspezifischen T-Zellen zwischen 4 und 24 h nach der Injektion gesehen werden kann.

Die größte Beschränkung dieses Protokolls ist die Zeitachse in Vivo für den Nachweis von Ziel Tötung identifizieren, die angebracht ist, das Antigen und die Hypothese getestet. Sorgfältige Bewertung durchgeführt werden muss, als Variationen in Antigen Stärke sowie genetische Veränderungen in T-Zellen getestet Differenzial CTL-Funktion führen, die eine Erkennung von unterschiedlichem Timing Ziel töten erfordern würde. Darüber hinaus zwar die entsprechende Konzentration des Peptids für Impfung für menschlichen Melanom Antigen Glycopeptide 100 (hgp100_25-33) optimiert wurde und Ovalbumin_257-264 (OVA_257-264)^8,9 _, Verwendung eines anderen Antigen-Modells, die möglicherweise besser geeignet, eine gegebene Studie würde weitere Validierung erfordern. Optimierung der IL-2 Dosis Konzentration und Dosis Frequenz möglicherweise aufgrund erwarteten Unterschiede in einem Ziel-Antigene Kapazität, CTL-Effektor-Funktion in Kombination mit der Covax als Adjuvans zu stimulieren muss das gewünschte Ziel zu erreichen. Insgesamt ist dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle Beurteilung der Funktion in Vivo zu töten und kann an jedem bestimmten Antigen angepasst werden.

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Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Texas MD Anderson Cancer Center genehmigt.

1. Vorbereitung des Peptids für den Impfstoff

1. Auflösen der gefriergetrockneten Peptid mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf die entsprechende Konzentration und Wirbel für 30 s.
   Hinweis: Für hgp100_25–33, die Endkonzentration ist 1 mg/mL und für OVA_257–264, die Endkonzentration 0,5 mg/mL. Peptid vor der Injektion zu rekonstruieren. Lagern Sie nicht nach der Rekonstitution.

2. Isolierung des Splenocyten von transgenen Maus

Hinweis: Zelle isoliert aus der Milz muss auf sterile Weise durchgeführt werden.

1. Einschläfern der OT-1 transgenen Maus mit der genehmigten CO₂ Erstickung Methode und die Milz zu entfernen.
   Hinweis: Geeignete transgenen Maus wird in diesem Schritt spezifisch für das Peptid Wahl genutzt.
   1. Legen Sie die Maus auf der rechten Seite. Die linke Seite der Maus mit 70 % igem Ethanol (EtOH) besprühen. Ziehen Sie die Haut mit Pinzette und schneiden Sie die Haut mit einer chirurgischen Schere; die Milz ist innerhalb der Bauchhöhle sichtbar. Vorsichtig aufschneiden der Bauchhöhle um die Milz zu gelangen. Entfernen Sie die Milz mit Pinzette.
2. Disaggregieren der Milz, indem man es in einen 70 µm-Filter in einer Petrischale mit 2 mL Medium A (PBS mit 1 % fetalen bovine Serum (FBS)) und Zerschlagung der Milz mit dem Ende von einem Kolben.
   1. Sammeln Sie die Splenocyten aus der Petrischale und in einem 50 mL konische Röhrchen. Waschen Sie die Petrischale mit 5 mL Medium A zweimal, bis alle Zellen zu sammeln. 25 mL Medium A bis hinzu und Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei Raumtemperatur bei 475 X g.
3. Aspirieren Sie die Zellen und in 1 mL / pro Milz rote Blutzelle (RBC) Lysis Puffer aufzuwirbeln. Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. Fügen Sie 10 mL Medium A und Zentrifuge bei Raumtemperatur 475 X g. Aufschwemmen das Pellet in 10 mL Medium A und entfernen Sie Verschmutzungen durch Filterung der Zellsuspension durch einen 70 µm-Filter in einem sauberen 50 mL konisch.
4. Zählen der Zellen verwenden Trypan blau und ein Hemocytometer. Aufschwemmen Zellen in PBS, eine Endkonzentration von 10⁶ - 100⁶ Zellen/mL. Für OVA_257–töten,₂₆₄ spezifische 10⁶ Zellen/ml Aufschwemmen und für hgp100 töten,_25–33 bestimmten 100⁶ Zellen/ml aufzuwirbeln.
   1. Spin die verbleibenden Zellen bei Raumtemperatur für 5 min bei 475 X g. Aspirieren überstand und Aufschwemmen in 15 mL kaltem PBS, Zellen zu waschen. Wiederholen Sie der Waschschritt noch einmal. Spin die Zellen bei Raumtemperatur für 5 min bei 475 X g. Aspirieren überstand und in kaltem PBS nach das Endvolumen in Schritt 2.4 ermittelten aufzuwirbeln.
   2. Übertragen Sie einzelne Zellsuspension auf einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und auf dem Eis bis Injektion Empfänger C57/BL6 Maus.

3. Injektion von Splenocyten von transgenen Mäusen

1. Legen Sie Empfänger C57/BL6 Maus in eine einschränkende mit der dorsalen Seite nach oben. Sprühen Sie Injektion Schweif Grundfläche mit 70 % Isopropylalkohol. Verwalten Sie 100 µL der einzelnen Zellsuspension (Abschnitt 2) intravenös in die Rute Vene mit einer 27 G Nadel mit der abgeschrägten Seite nach oben.

4. Covax Verwaltung

Hinweis: Wenn Zellen am Nachmittag injiziert werden, sollte die Covax am nächsten Morgen innerhalb von 18 Stunden Zelle Injektion verabreicht.

1. Platzieren Sie den Mauszeiger in einer klaren Anästhesie-Box mit ca. 1-3 % Isofluran. Nachdem Mäuse vollständig betäubt sind, übertragen Sie die Mäuse an der Nase Kegel an den Verteiler in der Anästhesie-Kammer angebracht. Halten Sie Mäuse zurückhaltend mit der dorsalen Seite oben.
   Hinweis: Anesthetization wird bestätigt durch eine kurze Zehe Prise zu überprüfen, ob eine Rücknahme-Antwort nicht ausgelöst wird. Bundesgesetz schränkt Isofluran-Nutzung in der Größenordnung von einem zugelassenen Tierarzt.
2. Sprühen Sie Injektion Schweif Grundfläche mit 70 % Isopropylalkohol. 100 µL der Peptidlösung (von Abschnitt 1) subkutan injizieren mit einer 27 G Nadel mit der Spritze, 4-5 mm in der Rute Basiszone der Nadel abgeschrägten Seite nach oben eindringt.
   Hinweis: Die Mäuse werden in einer Flanke mit subkutane Injektion an der Unterseite der Rute¹⁰geimpft.
3. 100 µL Anti-CD40 Antikörper (0,5 mg/mL Brühe) seitlich auf die Injektionsstelle Impfstoff zu injizieren.
4. Imiquimod-Creme 50 mg/Maus sorgfältig auf die Impfung-Seiten anwenden Reiben Sie Imiquimod-Creme auf der Oberfläche, bis die Creme nicht mehr sichtbar ist und wird vollständig absorbiert.
5. 100 µL 100.000 IU/mL RhIL-2 Protein intraperitoneale Injektion (i.p.) an der unteren Bauchregion. Beobachten Sie Mäuse für 5 Minuten, nachdem sie vollständig aus der Narkose zu erholen.
   Hinweis: Experiment wird an dieser Stelle für 3 Tage angehalten.

(5) Isolierung von Target Splenocyten zur Beschriftung mit CFSE

Hinweis: Zelle isoliert aus der Milz muss auf sterile Weise durchgeführt werden.

1. Einschläfern der C57BL/6 Mäusen nach genehmigten CO₂ Erstickung Methode. Spleen(s) wie in Schritt 2.1.1 zu entfernen. Disaggregieren der Milz und Splenocyten wie in den Schritten 2.2.1 - 2.2.3 zu waschen. Lyse der roten Blutkörperchen wie in den Schritten 2.3 - 2.3.2.
2. Zellen für die Zählung mit einem Hemocytometer zu entfernen und für eine Endkonzentration von Zellen bei 10⁶ Zellen/mL in CFSE--Kennzeichnung Lösung (in Schritt 7 beschrieben) zu berechnen. Drehen Sie die verbleibende Zellen bei Raumtemperatur für 5 min bei 475 x g. Aspirat überstand.

(6) Peptid Pulsieren des Target Splenocyten

Hinweis: Peptid pulsieren muss auf sterile Weise durchgeführt werden.

1. Aufschwemmen Zellen 10⁶ Zellen/ml in komplette Medien (RPMI 1640 Medien mit 10 % FBS, 1 % L-Glutamin (L-Gln), 1 % Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)). Teilen Sie die Zellen in 2 Röhren (15 mL Conicals). Beschriften Sie jedes Rohr als gepulste oder ungepulsten.
2. Fügen Sie Peptid, das Rohr mit der Bezeichnung gepulst. Fügen Sie für OVA_257–264 pulsieren 1 µg/mL und für hgp100_25–33 pulsieren, fügen Sie 2 µg/mL.
   Hinweis: Die ungepulsten Zellen durchlaufen die gleichen Inkubation wie die gepulsten Zellen nur ohne den Zusatz des Peptids.
   1. Inkubieren Sie Zellen + Peptid bei 37 ° C für 1 h.
3. Fügen Sie 10 mL komplette Medien (RPMI 1640 Medien mit 10 % FBS, 1 % L-Glutamin (L-Gln), 1 % Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)) auf jedes Rohr zu waschen beide gepulsten und ungepulsten Zielzellen. Drehen Sie die verbleibende Zellen bei Raumtemperatur für 5 min bei 475 x g. Aspirat überstand.

7. Vorbereitung der CFSE zur Kennzeichnung Ziel Splenocyten

1. Bereiten Sie CFSE--Kennzeichnung Lösung, während die Zelle im Schritt 6.3 waschen; Die gepulsten Zellen werden als CFSE-^Hallo und die ungepulsten als CFSE-^lobeschriftet werden. 10⁶ Zellen 1 mL CFSE--Kennzeichnung Lösung vorbereiten.
   Hinweis: CFSE ist lichtempfindlich und sollte zu allen Zeiten vor Licht geschützt werden.
   1. Bereiten CFSE-^Hallo -kennzeichnen Medien durch Zugabe von 1 uL/mL CFSE (5 mM Stammlösung) für eine Endkonzentration von 5 µM/mL RPMI Medien 1640 mit 2 % FBS.
   2. Bereiten CFSE-^lo -kennzeichnen Medien durch Zugabe von 1 uL/mL CFSE (0,5 mM Stammlösung) für eine Endkonzentration von 0,5 µM/mL RPMI Medien 1640 mit 2 % FBS.

8. Kennzeichnung der Ziel-Splenocyten mit CFSE-

Hinweis: CFSE-Kennzeichnung muss auf sterile Weise durchgeführt werden.

1. Aufschwemmen der gepulsten und ungepulsten Zielzellen (aus Schritt 6.3) bei 10⁶ Zellen/mL CFSE--Kennzeichnung Media. Aufschwemmen der gepulsten Zellen mit vorbereiteten CFSE-^Hallo-Kennzeichnung, Medien und die ungepulsten Zellen mit vorbereitet CFSE-^lo-kennzeichnen Medien.
2. Mischen Sie Zellen und CFSE--Kennzeichnung Medien durch sanfte Umkehrung oder wirbeln. Verwechseln Sie nicht durch aufschütteln. Brüten Zellen und CFSE--Kennzeichnung Medien bei 37 ° C für 15 min. Remix den Zellen alle 5 Minuten.
3. Jede Zelle Aussetzung und Spin-Zellen bei Raumtemperatur für 5 min bei 475 X g 10 mL komplette Medien hinzufügen.
4. Aspirieren Sie überstand und aufzuwirbeln Sie Zellen in 10 mL kaltem PBS. Spin-Zellen bei 4 ° C für 5 min bei 475 X g.
5. Wiederholen Sie Schritt 8.4.
6. Zählen der Zellen und Mix Peptid-gepulste CFSE-^Hallo-beschriftet mit ungepulsten, CFSE-^lo-Zellen im Verhältnis 1:1 für die Injektion in Empfänger Mäuse beschriftet. Halten Sie eine Aliquote von 1 x 10⁶ gemischte Zellen für einen Flow Cytometry Basisbewertung (Abschnitt 11) zu verwenden.
   Hinweis: Das Endvolumen Injektionslösung ist 100 µL pro Maus. Die endgültige Zellenzahl ist 10e6 Zellen. Verlust von Volumen in der Spritze und Nadel muss Rechnung getragen werden und sollte bei 500 µL abgeschätzt werden.

(9) Injektion von Zielzellen

Hinweis: Halten Sie CFSE--markierte Zellen vor Licht vor und während der Injektion so weit wie möglich geschützt.

1. Legen Sie Empfänger C57BL/6 Mäusen in eine einschränkende mit der dorsalen Seite nach oben. Sprühen Sie Injektion Schweif Grundfläche mit 70 % Isopropylalkohol. Verabreichen Sie 100 µL der einzelnen Zellsuspension intravenös mit der abgeschrägten Seite nach oben in die Rute Vene.

10. erneute Isolation der Zielzellen

Hinweis: Der Zeitpunkt für diesen Schritt ist kritisch und abhängig von der CTL Zytotoxizität und die Stärke des Antigens zur Stimulation. Zur Beurteilung einer OVA_257–264 gepulste Ziel zu töten müssen die Zellen geernteten 4-6 h nach der Injektion. Da CFSE--markierte Zellen Licht empfindlich, Prozess Milz im Dunkeln.

1. Die Empfänger C57BL/6 Mäusen nach der genehmigten CO₂ Erstickung Methode einschläfern.
2. Spleen(s) wie in Schritt 2.1.1 zu entfernen. Disaggregieren der Milz und Splenocyten wie in den Schritten 2.2.1 - 2.2.3 zu waschen. Lyse der roten Blutkörperchen wie in den Schritten 2.3 - 2.3.2.
3. Aufzuwirbeln Sie Zellen in 1 mL Fluoreszenz aktiviert Zelle sortieren (FACs) Puffer (1 % BSA + PBS) für die Bewertung von Durchflusszytometrie.

11. gating Logik CTL-Aktivität durch Durchflusszytometrie bestimmen

1. Führen Sie Beurteilung der CTL-Aktivität mit einem standard Flow Cytometry Protokoll. Zellen mit der FITC-Kanal auf einem Durchflusszytometer mit 488 nm Laser für Erregung¹¹zu erwerben.
   1. Tor auf live Lymphozyten mit den forward Scatter (FSC) Vs Side Scatter (SSC) Parametern. Subgate innerhalb des live Lymphozyten-Gates für die Gesamtbevölkerung CFSE--positiv.
      Hinweis: Die injizierten CFSE--markierten Zellen werden eine kleine Teilmenge der gesamten Lymphozyten vorhanden in der Milz bilden. Die CSFE-positiven Zellen sollte als zwei verschiedene Populationen auf der logarithmischen Skala angezeigt werden.
   2. Verwenden Sie ein Histogramm-Format um zu bestimmen, den Prozentsatz der ungepulsten (linke Spitze, CFSE-^lo) und gepulste (richtige Spitze, CFSE-^Hallo) Bevölkerungen. Verlust der CFSE-^Hallo Zellen zeigt die Antigen-spezifische CTL Aktivität.

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Ergebnisse

Vor der Injektion des CFSE--markierten Zielzellen läuft die Zelle 1:1-Mischung auf einem Durchflusszytometer bestimmen die Grundlinie Frequenzen CFSE-^Hallo sowohl des CFSE-^lo Zielzellen. Abbildung 1 A zeigt die gating Strategie zum Erkennen von Änderungen in der CFSE-Bevölkerung, eine erste Tor erfolgt über FSC und SSC-Parameter. Die gesamte CFSE--positiven Zellen sind dann vor der Bewertung der Änderungen in der Fr...

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Diskussion

Während dieses Protokolls sehr einfach ist, gibt es ein paar wichtige Schritte, die sorgfältig durchgeführt werden müssen. Die Covax Grundierung nach Injektion von antigenspezifischen T-Zellen getestet ist notwendig, um jegliches Töten der gepulsten Ziele zu sehen. Es ist zwar möglich, dass die wässrige Covax Impfung eine akute entzündliche Erkrankung, für die chronischen entzündlichen Phase schafft kann anstelle der kurzlebigen wasserbasierte Formulierung mit einem langsam-Antigen Version Öl basierenden Ansat...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 to 12 week old female C57BL/6 mice	Charles River	027	C57 Black 6 mice
OT-1 6-12 week old female mice	Jackson Labs	003831
hgp10025–33	CPCScientific	834139	KVPRNQDWL
OVA 257–264	CPCScientific	MISC-012	SIINFEKL
Imiquimod cream 5%	Fougera	51672-4145-6	Aldara Cream
CD40-specific mAb	BioXcell	BE0016-2	clone FGK4.5
rhIL-2 protein	Hoffman LaRoche Inc	136	Recombinant human IL-2 protein
70% isopropyl alcohol Prep	Kendall	S-17474
PBS	Life Technologies	10010-023	Phosphate Buffered Saline
FBS	Life Technologies	26140-079	fetal bovine serum
RBC lysis buffer	Life Technologies	A10492-01	red blood cell lysis buffer
RPMI 1640 Media	Life Technologies	11875119
L-Glutamine	Life Technologies	25030081
Pen/Strep	Life Technologies	15140122	penicillin/streptomycin
CFSE	Life Technologies	C34554	5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A4503
1.5 mL MCT graduated natural	Fisher	05-408-129	microcentrifuge tube
70% ethanol	Fisher	BP8201500	EtOH
Trypan blue solution, 0.4%	Life Technologies	15250-061
Hemocytometer	Fisher	267110
27 gauge needle	BD	305109
1 mL syringe	BD	309659