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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Techniken für die Bewertung der chemische Vernetzung von den Kaninchen Sklera mit Erzeugung der zweiten harmonischen Bildgebung und differential scanning Kalorimetrie.

Zusammenfassung

Methoden, um Gewebe zu stärken, durch Einbringen von chemischen Bindungen (nicht-enzymatische Vernetzung) in Strukturproteinen (fibrillären kollagene) für die Therapie sind photochemische Vernetzung und Gewebe Vernetzung (TXL) Methoden. Solche Methoden zur Induktion mechanische Gewebe Eigenschaftsänderungen werden an der Hornhaut Hornhaut dünner (mechanisch geschwächt) Erkrankungen wie Keratokonus sowie der Sklera in progressive Myopie, wo Ausdünnung und Schwächung der hinteren eingesetzt Sklera auftritt und wahrscheinlich trägt zur axialen Dehnung. Die primäre Zielproteine für solche Gewebe stärken sind fibrillären Kollagene, die die große Mehrheit der Trockengewicht Proteine in der Hornhaut und Sklera darstellen. Fibrillären kollagene sind zufällig, die Hauptquelle der zweiten harmonischen Generation Signale in den Extrazellulärraum Gewebe. Daher könnten Veränderungen der Kollagen Proteine, wie Sie induziert durch Vernetzung Therapien, potenziell erkannt und quantitated durch den Einsatz von zweiten harmonischen Generation Mikroskopie (SHGM). Überwachung SHGM-Signale durch den Einsatz eines Laser-scanning-Mikroskopie-System gekoppelt mit einer Infrarot-Anregungslicht Quelle ist eine aufregende moderne bildgebende Verfahren, das weit verbreitete Verwendung in den biomedizinischen Wissenschaften zu genießen ist. So, die vorliegende Studie wurde unternommen, um die Verwendung von SHGM Mikroskopie zu bewerten, als ein Mittel zum Messen induzierte Vernetzung Effekte in ex Vivo Kaninchen Sklera, nach einer Injektion von einer chemischen Vernetzung Agent in der Sub-Zapfen Raum (sT), eine Injektion nähern das ist gängige Praxis für das verursachen der okulären Anästhesie während ophthalmologische klinische Verfahren. Die chemische Vernetzung Agent, ist Natrium Hydroxymethylglycinate (SMG), von einer Klasse der kosmetische Konservierungsstoffe wie Formaldehyd, die Freigabe von Agenten (FARs) bekannt. Skleralen Änderungen nach Reaktion mit SMG führten zu Erhöhungen der SHG Signale und korreliert mit Temperaturwechseln thermische Denaturierung, induziert eine Standardmethode zur Bewertung der Gewebe Vernetzung Effekte.

Einleitung

Progressive Myopie wird durch nicht-enzymatische skleralen Vernetzung (photochemische und/oder chemischen), behandelbar sein postuliert, was Sinn macht, da die Sperrung Kollagen enzymatischer Vernetzung experimenteller Form Entbehrung (FD) erhöhen kann-induzierte Myopie-1. Dank und Phillips2 kürzlich diskutiert, die Machbarkeit und das Potenzial der Verwendung von standard UV-A Strahlung (UVA)-Riboflavin vermittelte photochemische Vernetzung (auch bekannt als Dresden-Protokoll), abgekürzt als (Riboflavin CXL) zur hinteren skleralen Stabilisierung um axialen Dehnung in Myopie Einhalt zu Gebieten. Diese photochemischen Methode wird erfolgreich eingesetzt zur Behandlung von Destabilisierung der vorderen Kugel Oberfläche (d.h. die gewölbte Hornhaut) in Keratokonus und Post-LASIK Keratektasie gesehen. Anwendung dieses CXL-Protokolls für die Lederhaut wird jedoch durch Probleme im Zusammenhang mit Schwierigkeiten beim Zugang zu den hinteren Sklera mit einer ultravioletten (UV) Lichtquelle sowie eine viel größere Gewebe Fläche bearbeiten zu müssen behindert. Dass gesagt wird, die CXL-Ansatz verwendet wurde, um axialen Dehnung in visuell Form Einhalt zu Gebieten beraubt Kaninchen (durch Tarsorrhaphy), obwohl mehrere Regionen der posterioren Sklera mehrere separate Bestrahlung Zonen in dieser Studie3erforderlich. Im Gegensatz dazu könnte Injektion eine chemische Stabilisierungsmittel (d.h. Vernetzungsmittel) über den sT-Space eine einfachere Möglichkeit, die hinteren Sklera, Vermeidung der Notwendigkeit der Einführung einer UV-Lichtquelle ändern darstellen. Dieser Injektionstechnik ist bekannt als ein nützliches Instrument zur Induktion okuläre Anästhesie bei ophthalmologischen Eingriffen wie z. B. Katarakt Chirurgie4,5,6. Wollensak7 hat die Verwendung einer sT-Injektion mit Glyceraldehyde (eine chemische Vernetzungsmittel ähnlich im Konzept der Freigabe Agenten (FARs) in dieser Studie beschriebenen Formaldehyd) beschriebenen Kaninchen Sklera und wieder versteift hat gezeigt worden, um axiale Länge in FD Meerschweinchen8,9zu beschränken. Die Ermittler haben einen klaren Vorteil der Verwendung eines löslichen chemischen Arbeitsstoff über die photochemische CXL Technik gezeigt. So skleralen Vernetzung mit injizierbaren chemische Vermittler eines Typs, einschließlich der FARs (d.h., TXL)10, könnten eine machbare Behandlungsmethode, das Fortschreiten der skleralen Dehnung in Myopie gesehen zu stoppen.

In der hier vorgestellten Protokolle verwenden wir eine chemische Vernetzung Lösung von Natrium Hydroxymethylglycinate (SMG), über sT-Injektion an der Sklera cadaveric Kaninchen Augen geliefert. Wir haben ähnliche Protokolle bisher für aktuelle chemische Vernetzung in der Hornhaut implementiert. Insbesondere in diesen bereits berichteten Studien konnte Konzentration abhängige Effekte Vernetzung mit SMG, mit einem Effekt-Angebot umfasst weit über demjenigen erreichbar mit photochemischen CXL durch thermische Denaturierung Analyse11 gewonnen werden .

Hier beschreiben wir Protokolle, um die vernetzende Wirkung der SMG über sT Injektionen skleralen Gewebe, thermische Denaturierung mit Differential Scanning Kalorimetrie (DSC) und Second Harmonic Generation Mikroskopie (SHGM) geliefert.

Mit differential scanning Kalorimetrie (DSC), auch bekannt als thermische Analyse ist ein thermische Denaturierung Übergang gemessen die für skleralen Gewebe ist überwiegend durch die Eigenschaften der fibrillären kollagene geleitet, da sie die größte Mehrheit bilden, des Proteins. Diese Methode wertet die Stabilität von Kollagen molekulare Struktur und die vernetzte Bande, die die Kollagen-Fibrillen, die wichtigsten tertiären Proteinstruktur stabilisieren. Beim Heizen in der DSC erreicht eine kritische Übergangstemperatur Denaturierung des Moleküls Kollagen ergibt, wodurch Abrollen der triple Helix, ein Prozess, der bildet, was man gemeinhin als Gelatine bekannt. Diese thermische Denaturierung stört Wasserstoffbrückenbindungen entlang der Kollagen-Molekül und kann zu höheren Temperaturen durch induzierte Vernetzung Methoden12,13verschoben werden. Diese Methode wurde verwendet, seit vielen Jahrzehnten, besonders im Bereich Biomaterialien und für Prozesse, die Leder-Herstellung enthalten. Allerdings ist diese Methode erfordert Extraktion der Sklera Gewebe und kann daher nur als ein ex-Vivo -Verfahren nützlich sein.

Erzeugung der zweiten harmonischen Mikroskopie (SHGM) basiert auf der nichtlinearen optischen Eigenschaften von bestimmten Materialien mit nicht Centrosymmetric molekulare Umgebungen. In solchen Materialien, intensives Licht, zum Beispiel Licht durch Laser erzeugt, erzeugt SHG Signale, in denen das einfallende Licht in Frequenz verdoppelt wird. Biologische Materialien, die bekannt sind, SHG Signale zu erstellen sind Kollagen, Mikrotubuli und Muscle Myosin. Zum Beispiel wird Kollagen begeistert mit einem Infrarot-Licht von 860 nm Wellenlänge ein SHG-Signal im sichtbaren Bereich mit 430 nm Wellenlänge emittieren. Zweite harmonische Erzeugung (SHG) Signal Bildgebung ist eine vielversprechende Methode zur Bewertung der therapeutischen Kollagen Vernetzung. Es ist seit mehr als 30 Jahren bekannt, dass Kollagen-Fibrillen in Geweben SHG Signale14abgeben. Allerdings konnte erst vor kurzem Bilder mit hoher Auflösung15 in einer Vielzahl von Geweben, einschließlich Sehne16, Haut, Knorpel17, Blutgefäße18, und Kollagen Gele19abgerufen werden.

Basierend auf diesem wissen, wertet diese Studie die SHG Signaländerungen induziert in der Sklera durch SMG chemisch induzierte Vernetzung von Kollagen. Die Ergebnisse zeigen, dass SMG Modifikation der Sklera die SHG-Signale aus Gewebe Kollagen Faserbündel (höhere Reihenfolge quartäre Struktur bestehend aus Kollagen-Fibrillen) hergestellt erhöht und auch einen morphologischen Strukturwandel im Kollagen produziert Glasfaser-Netzwerk, spiegelt sich in Faser Bundle "Aufrichtung."

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Protokoll

Alle Verfahren wurden mit cadaveric Kaninchen Augen innerhalb intakten fremd-Kaninchen Köpfe durchgeführt. Alle Institutionen und nationale Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren folgten.

1. Vorbereitung der Lösungen

  1. SMG-Vorbereitung für TXL:
    1. Bereiten Sie 1 mL 0,2 M Konzentration von Natriumbicarbonat (Nahco33) Lösung mit 0,0165 g NaHCO3 Pulver in 1 mL destilliertem Wasser gelöst.
    2. Lösen Sie 0,1016 mg pulverisierten Natrium Hydroxymethylglycinate (SMG auf) in 1 mL destilliertem Wasser zu einer Endkonzentration von 800 mM SMG. Natriumbikarbonat-Lösung, um eine Endkonzentration von 0,1 M Nahco33 und 400 mM SMG anpassen. Konzentrationen von SMG je nach Vernetzung Effekt gewünscht. In dem hier beschriebenen Protokoll haben wir 40, 100 und 400 mM SMG.

2. SubTenon Injektion für TXL mit SMG

  1. Füllen Sie zwei 1 mL Insulinspritzen (25G Nadeln) bzw. mit 400 µL Kontrolle und SMG-Lösung.
  2. Legen Sie den Hasenkopf in eine Profilebene mit Hilfe von einem Kissen. Styropor oder einem Papierstapel kann verwendet werden, um den Kopf in eine optimale Position zu fixieren.
  3. Ziehen Sie die Augenlider mit einem pädiatrischen Lidsperrer.
  4. Messen Sie den erste intraokularen Druck (IOP) ein abgeplatteter Tonometrie-Gerät.
  5. Markieren der gewünschten Injektionsstelle auf den oberen mittleren Teil der Limbus mit einer Gewebe-Markierung.
  6. Zurückziehen Sie die Bindehaut, die Umgebung der Injektionsstelle mit einem Bindehaut Zangen (oder eine Zange mit gezackten Rundspitze) und stechen Sie die Nadel durch die Bindehaut, Eingabe von Tenon Kapsel nur geringfügig über der markierten limbisches Website (d.h.2-3 mm aus dem Limbus). Ein kleiner Schnitt in der Bindehaut kann auch mit der Iris-Schere erfolgen, um den Durchgang von der Nadel durch Tenon Kapsel zu erleichtern.
  7. Einmal innerhalb der Tenon-Kapsel, stellen Sie sicher, dass die Nadel frei beweglich ist, von Seite zu Seite bewegen. Während dieser Zeit sollte die Welt nicht bewegen. Dies bestätigt die richtige Platzierung der Nadel oberhalb der Sklera in der Sub-Capsula (sT) Raum.
  8. Injizieren Sie die Lösung aus der Spritze zu und entsorgen Sie die Nadel. Unmittelbar nach der Injektion sammelt die Flüssigkeit in den sT-Raum schaffen eine vordere Beule durch die Bindehaut (d.h. Chemosis) gesehen.
  9. Wiederholen Sie IOP Messung, um zu bestätigen, dass es nicht durch einen versehentlichen Perforation der Welt ändern.
  10. Entfernen Sie das Deckel-Spekulum und führen Sie digitale Massage durch die geschlossenen Augenlider für ca. 2-3 min.
  11. Lassen Sie den Kopf für eine Inkubationszeit von 3,5 h (Raumtemperatur = 18 ° C), vor dem Umzug mit dem nächsten Schritt fort.

(3) Gewebe-Vorbereitung

  1. Ziehen Sie die Augenlider mit dem Augenlid Spekulum um Zugang zu der ganzen Welt zu optimieren. Wählen Sie das optimal dimensionierte Spekulum entsprechend der Größe des Auges.
  2. Die Bindehaut umgibt den Limbus zu trennen. Wenn es bereits in der Nähe der Injektionsstelle eingeschnitten wurden, umlaufend erweitern Sie die Grenzen, sodass es eine Inokulum-Größe von ca. 1 x 1 cm enthalten würde.
  3. Schneiden Sie die extraokularen Muskeln an ihren Standorten der skleralen einsetzen.
  4. Heben Sie den Augapfel mit der Pinzette, drücken Sie ihn von der hinteren Seite. Dies ermöglicht den Zugriff auf den hinteren Globus und Schneiden des Sehnervs mit ophthalmologischen Arterie und Vene in der Nähe der hinteren Pol der Erde erleichtern.
  5. Schneiden Sie die Corneoscleral Komplex, mit der äußeren Grenze einschließlich der markierten Injektionsstelle. Der Fleck sollte noch auf den verbleibenden Teil der Sklera sichtbar sein.
  6. Entfernen Sie der Korpus gallertartige und alle Ebenen auf der Innenseite der Sklera durch Traktion mit Gewebe Zange.
    Hinweis: Weitere Schritte richten sich nach den folgenden Verfahren durchgeführt: 4. - DSC-Analyse, 5 - SHG-Mikroskopie.

(4) für regionale DSC-Analyse

  1. Für die behandelten Auge: aus vier skleralen Sektoren aus dem restlichen skleralen Cup mit der Schere ausschneiden, so dass die Injektionsstelle befindet sich im oberen Bereich und zentral ausgerichtet. Schneiden Sie die restlichen 3 Sektoren von beiden seitlichen Seiten (d.h., nasalen und temporalen) und unten.
    Hinweis: die Nummerierung der Sektoren (1-4), die Quadrate (1-16) weiter unterteilt werden in Abbildung 1Azeigt.
  2. Schneiden Sie der skleralen Sektoren (1-4) in kleinere Quadrate (1-16) von ca. 4 x 4 mm. Sektor 1 sollte 9 Quadrate aufgeteilt werden (dem genauen Ort der Injektion stellen einen individuelle [Platz 2]). Teilen Sie Sektoren 2 und 3 in 2 Quadrate (Plätze 10-11 und 12-13) und Sektor 4 in 3 Quadrate (Quadrate 14-16).
  3. Weisen Sie eine Nummer für jedes Quadrat, wie in Abbildung 1A, um den Abstand des untersuchten Gewebes von der Position der Injektionsbereich zu lokalisieren.
  4. Für das Steuerelement Auge: nach der Aufteilung des Gewebes in vier skleralen Sektoren (ähnlich wie das behandelte Gewebe) schneiden Sie quadratische Stücke von Gewebe aus den folgenden Speicherorten: 3 Quadrate aus den oberen Sektor (1) 1 aus jeder Seite (Sektoren 2 und 3) und 1 von der unteren Bereich (4).
  5. Kratzen Sie die verbleibenden Schichten der Netzhaut und Aderhaut und waschen zweimal mit frischem PBS jedes Mal verlassen die Stücke unter Wasser in Lösung für ca. 10 s zu einem Zeitpunkt.

(5) für die SHG Bildgebung

  1. Schneiden Sie den oberen Teil des der Sklera mit einer Schere zur Schaffung eines 1 x 1 cm mit der Injektionsstelle zentral ausgerichtet.
  2. Kratzen Sie die verbleibenden Schichten der Netzhaut und Aderhaut und waschen zweimal mit frischem PBS jedes Mal, so dass die Stücke in Lösung für ca. 10 s.
  3. Legen Sie das Gewebe in 1 mL Röhrchen gefüllt mit PBS-Lösung für den Transport der bildgebenden Einrichtung. Die Verfahren, nach der Inkubationszeit und beginnend mit der Dissektion des Augapfels sollte innerhalb einer Stunde durchgeführt werden.

(6) Mikroskopie-Protokoll

Hinweis: Dieses Protokoll für bildgebende zurückgestreute SHG Signal von Kollagen der Sklera Gewebe ist maßgeschneidert für die Laser-scanning-Mikroskop.

  1. Mikroskopie, einrichten
    1. Zur Maximierung der Optimierung der Signal und Auflösung beim Ausführen SHG Mikroskopie eine Objektiv verwenden um Infrarot Licht und mit einer hoher numerischer Apertur (NA) übertragen. Unser Ziel ist es Nikon Apo LWD 25 X / NA1.1 Wasser eintauchen.
    2. Passen Sie die Korrektur Kragen der Linse auf die Tiefe der Probe, in diesem Fall entsprechen, die die Dicke des Deckglases, 0,17 Millimetern ist.
    3. Montieren Sie das 25 X Objektiv und fügen Sie eine großzügige Menge Gleitgel Wasserbasis zur Deckung die bildgebende Oberfläche vor der Montage der Probenmaterials. Das wasserlösliche Gel wird während des Experiments nicht verdunsten und somit werden Bildqualität beibehalten.
    4. Ort der skleralen Gewebe aus einer 1-mL-Tube mit PBS ohne Trocknung zwischen zwei 25-mm-Runde Deckgläsern (Augenhaut Seite nach unten) bietet maximalen Kontakt zwischen dem Episclera und dem Deckglas Oberfläche.
      Hinweis: Das Gewebe kann auch aufgedeckt auf dem Deckglas platziert werden. Eine gute Menge an PBS sollte das Gewebe während der Bildgebung hydratisiert halten. In diesem Fall fügen Sie das Gewebe und die PBS nach der Montage der Cellchamber.
    5. Montieren der Zelle Kammer, indem man ein 25 mm Runde Deckglas, single oder in einer Sandwich-Technik, auf dem Unterteil der Kammer und verschrauben den oberen Teil um ein versiegeltes Runde Kammer zu schaffen. Schrauben Sie nicht nach unten eng wenn eine obere Deckglas verwendet wird, um zu vermeiden, künstlich Abflachung und das Gewebe schädigen.
    6. Montieren Sie die Zelle Kammer mit der Gewebeprobe auf den Mikroskoptisch.
    7. Legen Sie das Mikroskop für die Vogelperspektive mit Durchlicht auf.
    8. Positionieren Sie die Bühne und stellen Sie die Höhe des Ziels, so dass die Unterseite der Probe im Fokus, wie von Hellfeld Inspektion durch das Okular bestimmt.
    9. Schalten Sie alle Lichter außer dem Computer-Monitor und blockieren Sie so viel Licht aus dem Monitor möglichst mit Aluminium Folienblätter auf den Mikroskoptisch drapiert. Jede Streulicht erreichen die Detektoren zu minimieren wird geräuscharm Erwerb, dafür sorgen wie GaAsP NDD-Detektoren hohen Empfindlichkeit haben.
    10. Prüfen Sie im Bedienfeld "Ti-Pad" der Software, ob die Linse Definition korrekt ist.
    11. Im A1 kompakt GUI-Fenster wählen Sie die IR-Laser für die Bildgebung, wählen Sie die NDD-Detektoren und DAPI-Kanal, der mit einem 400-450 nm Bandpassfilter ausgestattet ist.
    12. Die Wellenlänge der Infrarot-Laser soll im Bereich A1 MP GUI 860 nm und öffnen Sie den Auslöser.
    13. Laser-scanning-Bedingungen im Bereich A1 kompakt GUI wie folgt festgelegt. Wählen Sie: (a) Galvano-Scanner (b) unidirektional scannen, (c) Pixel wohnen Zeit 6.2 µs, (d) Frame Größe 1.024 x 1.024 Pixel, (e) Linie von durchschnittlich 2 x
      Hinweis: Die Galvano Scanner und Scannen von unidirektionalen sorgt für genaue Punkt für Punkt ausrichten. Eine Größe von 1.024 x 1.024 für volles Sehfeld übersetzt in eine Pixelgröße von 0,5 µm /pixel. Linie im Durchschnitt verringert das Schuss Rauschen im Bild.
    14. Festlegen von bildgebende Bedingungen im A1 kompakt GUI-Panel durch Anpassung der Laserleistung und Detektor gewinnen. Öffnen Sie die Look Up Table (LUTs), die ein Histogramm der Pixelwerte Intensität in das aktuelle Bild angezeigt wird. Schalten Sie live Imaging "Suchmodus" und maximieren Sie den erkannten Wertebereich Pixel durch Anpassung Laser Power und Detektor Gewinn. Vermeiden Sie Sättigung. Typische Werte sind 2,5 % Laserleistung von insgesamt 2,35 W bei 860 nm und 100 HV (Detektor Gewinn).
    15. Hinweis: Für dieses Setup die Laserleistung, gemessen mit einem internen Leistungsmesser ist 5,2 mW. Jedes Mal, wenn ein Experiment durchgeführt wird, erneut passen Sie den Laser Prozentsatz so, dass die internen Leistungsmessung konstant bei 5,2 mW zwischen imaging-Sitzungen. Festlegung der Laserleistung ist Vorsicht geboten. Der Chamäleon II-Laser ist ein 3 W Laser bei 800 nm und eine 10 % oder höherer Gewalt könnte potenziell induzieren Gewebeschäden.
  2. Bildaufnahme
    1. Im Vorschau-Modus scan-Gewebebereich mit dem XYZ-Übersicht-Tool.
    2. Legen Sie die Bildgebung auf niedrigere Auflösung (256 x 256 Pixel und keine Linie Mittelung), um die Übernahme der Bilder in diesem Modus zu beschleunigen.
    3. 5 x 5, 3 x 3 oder einzelnen Sichtfelder auf die gesamte Oberfläche des Gewebes zu erfassen. An jedem Standort vor der Einnahme Übersicht "Scan" live-Modus schalten und das Gewebe in den Fokus zu bringen. Beachten Sie, dass verschiedene Regionen des Gewebes werden leicht unterschiedliche Positionen in axialer Richtung.
    4. Finden Sie einen flachen Bereich, wo die Kollagenfasern in das gesamte Sichtfeld zu sehen sind, und doppelklicken Sie auf diese Position in die Übersicht-Tool auf die Bühne an diesem Speicherort zu verschieben.
    5. Schalten Sie live "Scan"-Modus, passen Sie die Z-Position des Ziels an, so dass die untere Ebene im Fokus und in der Ti-Pad verwenden Sie Laufwerk Z: auf der optischen Ebene 10-15 μm oberhalb dieser unteren Ebene bewegen.
    6. Erwerben Sie ein Bild mit hoher Auflösung mit 1.024 x 1.024 Pixel und 2 X Line mit durchschnittlich, verwenden die "Aufnahme"-Taste.
    7. Speichern der Position in der XYZ-Übersicht mit der Taste "+". Dadurch wird sichergestellt, dass der gleichen Gegend des Gewebes nicht zurückerobert ist.
    8. Für jedes Stück des Gewebes 10 Aufnahmen von nicht-überlappende Gesichtsfelder.

(7) DSC Protokoll

Hinweis: Fahren Sie mit diesem Schritt als Gewebe Vorbereitung ist abgeschlossen, für regionale DSC-Analyse oder nach Gewebe Bildgebung, wenn SHGM durchgeführt wird.

  1. Bereiten Sie DSC Pfannen, gewogen und etikettiert.
    Hinweis: Dieser Schritt sollte vor Gewebe Dissektion erfolgen um Gewebe Austrocknung zu minimieren.
  2. Trocknen Sie jedes skleralen Quadrat mit einem saugfähigen Tuch und legen Sie es flach auf den Boden einer DSC-Pfanne mit gezahnten Pinzette.
  3. Wiegen Sie die Pfanne mit dem Gewebe im Inneren und Deckel gecrimpt und bedeckt, das Gewebe zu erhalten nass Gewicht (Masse der Proben sollte im Bereich von 5 bis 11 mg).
    Hinweis: Jede Dichtung Schwenken mit Crimper bevor Sie mit der nächsten Gewebeprobe. Die Pfannen sind hermetisch abgeriegelt und verhindert jede Wasserverlust vor der thermischen Analyse.
  4. Sobald die Probe gewellt ist, legen Sie es auf ihren Bestimmungsort auf dem DSC-Tablett. Es sollte 6 Proben für die Kontrolle und 16 für die behandelten Auge.
  5. Erstellen Sie eine Methode mit Instrument Management Software, das Gewicht des Gewebes angibt, und die thermische Analyse mit den folgenden Parametern ausführen: Temperaturbereich von 40 bis 80 ° C, Aufheizgeschwindigkeit: 1 ° C/min, Wärmestrom: 17,37 mW, Gasströmung (N2): 19,8 mL/min, Gasdruck: 2,2 Bar.
  6. Abschluss, analysieren Sie die Daten für jede Probe durch die Extraktion der Übergang Temperatur Peak bei denen thermische Denaturierung erfolgt über das Instrument Management Software.

8. die Bildanalyse

  1. SHG-Signal
    1. Wählen Sie mindestens 5 bis 10 der repräsentativsten Bilder aus jeder Behandlung und deren Kontrolle, so dass das Gebiet des Bildes von meist Kollagenfasern besetzt ist.
    2. Jedes Bild in ImageJ Software hochladen und messen die durchschnittliche Pixel Intensität durch die Auswahl analysieren > Maßnahme für das aktive Bild.
    3. Die Werte extrahiert sind als die mittleren Pixel Intensität gemeldet und können ebenfalls durch das Histogramm der Intensitäten durch Auswahl aus dem Menü zeichnen analysieren > Histogramm.
    4. Mit Hilfe einer Excel-Tabelle erstellen einer Tabelle, alle gemessene Daten entsprechend zu dokumentieren, die Probe-ID.
    5. Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung der Pixel-Intensität für jede Behandlung und Kontrolle Bedingung.
    6. Des Schülers mit t-Test, vergleichen Sie Unterschiede für alle paarweisen Vergleiche von Konzentrationen (d. h.40 mM SMG vs. 0 bis 400 mM SMG vs. 0). [P≤0.05].
  2. Welligkeit
    1. Wählen Sie ein Bild, das zeigt der Kollagenfasern. (Einschließlich einer Kontrollprobe für jede Konzentration - mindestens 40 insgesamt) sollte mindestens 10 Bilder pro Probe analysiert werden.
    2. Offene ImageJ > Plugins > NeuronJ. NeuronJ erfordert die vorherige Installation.
    3. Laden Sie alle Imagesby in einem geöffneten NeuronJ -Fenster ziehen.
    4. Erstellen Sie Ablaufverfolgung Linien entlang der Fasern, Anschluss an die Kontur der Fibrille mit der Maus (Federzeichnung Tabletten verwendet werden könnte), klicken Sie auf M um die Entfernung der gesamten Länge zu messen.
    5. Wählen Sie "Option" um eine tangentiale gerade Linie zeichnen und verbinden Sie den Anfang und das Ende der zuvor gezeichnete Faser Kontur. Klicken Sie nun auf M um die End-to-End-Länge zu messen.
    6. Wiederholen Sie das gleiche Verfahren auf mindestens 10 Fibrillen pro Bild.
    7. Sammeln Sie diese beiden Messungen aller 10 Fibrillen und geben Sie die Daten in eine Excel-Tabelle, mit dem Ausdruck total Faserlänge (Kontur) und End-to-End-Länge (gerade Verbindungslinie) als Länge [Curve] und [linear], beziehungsweise.
    8. Die Welligkeit Index (W) mit der Formel berechnen: W = Länge [Curve] / Länge [linear].
    9. Die % der Welligkeit Vergleich der Daten aus den Bildern der behandelten samples(SMG) mit den Bildern von Kontrollproben mit Hilfe der Formel zu berechnen: (W [SMG] - 1) / (W [STRG] - 1)
    10. Führen Sie einen paarweisen t-Test für Welligkeit Index (W), um statistische Unterschiede (p-Werte) der Kollagen Fasern Morphologie zwischen verschiedenen Behandlungsbedingungen und Kontrolle zu bestimmen.

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Ergebnisse

Thermische Denaturierung Temperatur (Tm) als Assay Methode auszuwertende TXL Vernetzung Effekt: Insgesamt 16 Augenpaare Kaninchen wurden in diesen Experimenten für die TXL-Verfahren verwendet. Als ersten Teil dieser Studie war die Lokalisierung der vernetzende Wirkung induziert durch eine einmalige Injektion von SMG Vernetzungsmittel sT-Bereich in den cadaveric Hasenkopf ausgewertet. Diese Art von Experiment hat Relevanz für die klinische Behandlung von Patienten, da In...

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Diskussion

Experimente haben gezeigt, Nachweise für die Verwendung der SHG Signal Mikroskopie als Methode für die Bewertung von Kollagen Vernetzung Effekte in der Lederhaut, Anhebung der zukünftigen Möglichkeit der Verwendung dieser Technik als Kontrollinstrument zur Vernetzung Behandlungen Das Ziel Kollagen Proteine. Der Hinweis ist ein Instrument bereits im klinischen Einsatz, die möglicherweise diese SHG Signal erfassen können. Obwohl dieses Instrument in erster Linie für bildgebende menschlichen Dermis der Haut entwickel...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren danken Tongalp Tezel, MD, für Beratung bei sT-Injektion; Theresa Swayne, PhD, für Beratung bei SHG Mikroskopie; und Jimmy Duong aus dem Design und Biostatistik-Ressource und die biostatistische zentrale Einrichtung des Irving Institute an der Columbia University Medical Center.

Teilweise unterstützt durch Forschung zur Erblindung verhindern und nationale Institute der Gesundheit Stipendien NCRR UL1RR024156, NEI P30 EY019007 und NCI P30 CA013696 NEI R01EY020495 (DCP). Columbia University besitzt damit verbundenen geistigen Eigentums: ausgestellt U.S. Patent keine: 8.466.203 und Nein: 9.125.856. International zum patent angemeldet: PCT/US2015/020276.

Bilder wurden in der Confocal gesammelt und spezialisiert Mikroskopie Shared Resource Herbert Irving Comprehensive Cancer Center an der Columbia University, unterstützt von NIH gewähren #P30 CA013696 (National Cancer Institute). Das konfokale Mikroskop angeschafft mit NIH #S10 RR025686 zu gewähren.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
MILLI-Q SYNTHESIS A10 120VEMD Millipore, Massachusetts, USADouble distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1
Sodium hydroxymethylglycinate Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USACrosslinking reagent - protocol step 1.1.2
Injection needle with luer-lock syringeBD Eclipse, NJ, USASyringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1
Rabbit headLa Granja poultryOutbredRabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2
Tono-pen Reichter Technologies Depew, NYIOP measurements - protocol step 2.4
DSC 6000 AutosamplerPerkin-Elmer Waltham, MA, USAThermal denaturation analyzer - protocol step 7.4
Pyris software Perkin-Elmer, Waltham, MA, USAVer 11.0 protocol step 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MPNikon Instruments, Melville, NY, USAA water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1.
GenTeal Alcon, Fort Worth, TX B000URVDQ8Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1
Chameleon Vision II Coherent, Santa Clara,CA, USATi:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11
AttoFluor cell chamberThermo Fisher Scientific IncA7816Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3
25-mm round coverslips, #1.5Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USAGG-25-1.5protocol step 8.1.3
Eclipse Ti-ENikon Instruments, Melville, NY, USAprotocol step 8.1.4.
Non-descanned (NDD) GaAsP detectorNikon Instruments, Melville, NY, USAEquipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7
A1R-MP laser scanning systemNikon Instruments, Melville, NY, USACompatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8
NIS Elements softwareNikon Instruments, Melville, NY, USAVer 4.3refered to as "software" in the text - protocol step 8.1.9
Fiji/ImageJNational Institute of Health protocol step 9.1.2
NeuronJEric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlandshttps://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2
Microsoft Excel Microsoft Corporation, Redmond, WA, USAVer 14protocol step 9.2.8

Referenzen

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