Ein RANKL-basierte Osteoklasten Kultur Assay der Maus Knochenmark zu untersuchen, die Rolle von mTORC1 in Osteoklasten Bildung

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zum isolieren und Kultur Osteoklasten in Vitro aus Maus Knochenmark und zur Untersuchung der Rolle von Säugetieren/mechanistischen Ziel von Rapamycin Komplex 1 in Osteoklasten-Formation.

Zusammenfassung

Osteoklasten sind einzigartige Knochen-resorbierbarem Zellen, die von der Monocyte/Makrophagen-Linie des Knochenmarks zu unterscheiden. Dysfunktion von Osteoklasten kann eine Reihe von metabolischen Knochenerkrankungen wie Osteoporose führen. Um pharmazeutische Ziele für die Vermeidung von krankhaften Knochenschwund Masse zu entwickeln, müssen die Mechanismen, durch die Osteoklasten aus Vorstufen unterscheiden, verstanden werden. Die Fähigkeit zu isolieren und eine große Anzahl von Osteoklasten in-vitro- Kultur ist entscheidend, um die Rolle bestimmter Gene in Osteoklasten Differenzierung bestimmen. Inaktivierung von Säugetieren/mechanistischen Ziel von Rapamycin Komplex 1 (TORC1) in Osteoklasten kann Osteoklasten Anzahl verringern und Knochenmasse zu erhöhen; jedoch bedürfen die zugrunde liegenden Mechanismen weiterer Untersuchungen. In der vorliegenden Studie wird ein RANKL-basiertes Protokoll zu isolieren und Kultur Osteoklasten aus Maus Knochenmark und Untersuchung des Einflusses von mTORC1 Inaktivierung auf Osteoklasten Formation beschrieben. Dieses Protokoll führte erfolgreich eine große Anzahl von riesigen Osteoklasten in der Regel innerhalb einer Woche. Löschen von Raptor beeinträchtigt Osteoklasten Bildung und nahm die Aktivität des sekretorischen Tartrat-resistente saure Phosphatase, anzeigend, dass mTORC1 für Osteoklasten Bildung entscheidend.

Einleitung

Knochen ist ein ständig wechselnden Organ und wird von Osteoblasten und Osteoklasten zeitlebens umgebaut. Osteoklasten sind verantwortlich für mineralisierten Matrix Resorption und Osteoblasten zu synthetisieren und sezernieren neue Knochen Matrizen¹. Die Balance zwischen Knochenabbau und Knochenaufbau ist entscheidend für die Knochengesundheit, einschließlich der Wartung der Knochen Masse und Reaktion auf Stimulation und Verletzungen. Wenn dieses Gleichgewicht gestört ist, kann eine Reihe von metabolischen Knochenerkrankungen wie Osteoporose und parodontale Erkrankungen auftreten. Bei diesen Erkrankungen übersteigt Knochen Masse Verlust infolge osteoclastic Knochenabbau Knochen bilden Kapazität von Osteoblasten^2,3. So um pharmazeutische Ziele zur Behandlung von Skeletterkrankungen wie Osteoporose zu entwickeln, ist es wichtig zu verstehen, die Erzeugung und die Biologie der Osteoklasten⁴.

Osteoklasten sind einzigartige mehrkernigen Riesenzellen befindet sich an oder nahe der Knochenoberfläche und gehören zu der Familie Monocyte/Makrophagen-¹. Ibbotson K. J. Et al. eine Methode zur Erzeugung Osteoklasten-wie Zellen in Vitro mit 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3⁵-haltigem Medium berichtet. Die Identifizierung von Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und Rezeptor Aktivator für nukleare Faktor κ B Ligand (RANKL) als wesentliche Faktoren der Osteoklasten Bildung hat dramatisch zugenommen, die Effizienz der Osteoclastogenesis in vitro ^{1 , 6 , 7}. die Möglichkeit, Kultur Osteoklasten in Vitro hat unser Verständnis der Generation und Regulierung der Osteoklasten verbessert.

Das Säugetier/mechanistischen Ziel von Rapamycin (mTOR) Funktionen in zwei strukturell und funktionell unterschiedliche komplexe, nämlich mTORC1 und mTORC2^8,9. Die zwei Multi-Protein-komplexe sind aufgrund ihrer unterschiedlichen Komponenten und nachgelagerten Substrate voneinander. mTORC1 enthält das einzigartige regulatorischen-assoziierten Protein mTOR (Raptor), während mTORC2 Rapamycin-unempfindliche Begleiter von mTOR (Rictor)⁹enthält. mTORC1 können integrieren und übertragen wichtige Signale, Zellwachstum, Proliferation und Differenzierung zu regulieren. Vor kurzem haben wir gezeigt, dass diese mTORC1 spielt eine Schlüsselrolle im Netzwerk der katabolen Knochenabbau durch Löschen des Raptor , mTORC1 in Osteoklasten¹⁰zu inaktivieren. Jedoch bedürfen die zugrunde liegenden Mechanismen weiterer Untersuchungen. In der vorliegenden Studie wurde eine Osteoclastogenic RANKL-basierte Methode Osteoklasten aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs) der Wildtyp (WT) und Rap^Ctsk Mäuse zu generieren und Untersuchung des Einflusses von mTORC1 Inaktivierung auf Osteoklasten verwendet. Bildung.

Protokoll

Alle Verfahren in Bezug auf die Tiere wurden nach dem Protokoll von der Stanford-Verwaltungs-Panel auf Laboratory Animal Care (APLAC) genehmigt durchgeführt und wurden durch die Animal Care and Use Committee des Shanghai Institute für Biochemie und Zelle genehmigt Biologie.

1. Vorbereitung

1. Generieren von Osteoklasten bestimmte Raptor Löschung Mäuse (Raptor^fl/fl; Ctsk-Cre, jenseits ^CtskRap) bei der Paarung Raptor^fl/fl -Mäuse mit Ctsk-Cre Mäuse. Verwenden Sie die Raptor^fl/fl -Mäuse als WT-Kontrolle in dieser Studie.
2. Haben Sie einen Behälter mit Eis, isolierte Knochen zu halten.
3. Kulturmedium vorzubereiten.
   1. Bereiten Sie α-MEM Kulturmedium durch Ergänzung minimale wesentliche mittlere Alpha (α-MEM) mit 1 X Glutamin, Penicillin-Streptomycin und 10 % fetalen Kälberserum vor.
   2. Vorbereiten des Knochenmarks Makrophagen Induktion Medium bestehend aus 50 mL α-MEM Medium und M-CSF bei 20 ng/mL.
   3. Bereiten Sie Osteoklasten Induktion Medium bestehend aus M-CSF und RANKL bei 20 ng/mL, bzw., in 50 mL α-MEM Medium vor.
4. Bereiten Sie die folgenden Puffer vor der Falle zu beflecken.
   1. Bereiten Sie Fix-Lösung bestehend aus 6,5 mL Aceton, 2,5 mL Citrat-Lösung und 0,8 mL 37 % (Vol/Vol) Formaldehyd-Lösung.
   2. Bereiten Sie TRAP Färbelösung vor.
      1. Prewarm deionisiertes Wasser auf 37 ° C.
      2. 100 µL schnell Granat GBC Basislösung und 100 µL Natrium Nitrit-Lösung in einem 1,5 mL Reaktionscup und mischen durch sanfte Umkehrung für 30 S. lassen die Mischung für 2 min stehen.
      3. Prewarm 9 mL entionisiertem Wasser auf 37 ° C. Fügen Sie 200 µL des Diazotized schnell Granat GBC Basislösung aus Schritt 1.4.2.2, 100 µL Naphthol AS-BI-Phosphat-Lösung, 400 µL Acetat-Lösung und 200 µL Tartrat-Lösung.
      4. Halten Sie die Falle Färbelösung Mischung in einem Wasserbad bei 37 ° C.
5. Bereiten Sie den folgenden Puffer vor der Falle Aktivität Quantifizierung Kulturmedium.
   1. Bereiten Sie Tartrat Puffer (50 mL): 2 mL 0,33 M L-Weinsäure Säure, 48 mL 0,33 M-Natrium-Tartrat Diabas-entwässern. Stellen Sie den pH-Wert auf 4,9.
   2. 4-Nitrophenyl Binatrium (pNPP) Phosphatpuffer (200 mL) vorbereiten: 1,502 g Glycin, 41 mg MgCl₂, 27,2 mg ZnCl₂und 180 mL entionisiertem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 10.4 mit 3 M NaOH und die Lautstärke auf 200 mL mit entionisiertem Wasser.
   3. Vorbereiten der pNPP Puffer mit Phosphatase Substrat (einer 96-Well-Platte): 49,37 mg Phosphatase Substrat und 175 µL pNPP Puffers von Schritt 1.5.2.
   4. Bereiten Sie Substratpuffer (9 mL/96-Well-Platte): 6,24 mL deionisiertes Wasser, 360 μL der Acetat-Lösung und 2,4 mL Tartrat Puffer. Mischen von Wirbel und Heizen Sie bei 37 ° C vor dem Gebrauch.
   5. 9ml vorgeheizten Substrat buffer(1.5.4) um eine Substratmischung und Wirbel für 10 90 μL pNPP Puffer mit Phosphatase substrate(1.5.3) hinzufügen s.

2. Präparation (Tag-1)

1. Einschläfern Sie 3 ein-Monat-alte weibliche WT und Rap^Ctsk Mäuse durch CO₂ getrennt. Durchführen Sie CO₂ -Inhalation mit geeigneter Ausrüstung von geschultem Personal.
2. Tauchen Sie 6 Mäuse in ein Becherglas mit 100 mL 75 % Ethanol (Vol/Vol) für 5 min, bakterielle Kontamination zu verhindern und dann auf eine Dissektion Brett in Rückenlage legen. Machen Sie einen Schnitt an der distalen Tibia vertikal und sezieren Sie die Haut entlang der hinteren Gliedmaßen mit ophthalmologischen Schere.
3. Geschnitten Sie das Gelenke Ligament des Hüftgelenks mit einer Schere und verrücken Sie der hinteren Gliedmaßen aus dem Kofferraum.
4. Schneiden Sie die artikuläre Bandverletzungen des Kniegelenks und trennen Sie sorgfältig zu, der Tibia und Femur aus dem Kniegelenk. Entfernen Sie vorsichtig das Weichgewebe mit einer Schere.
5. Legen Sie alle Knochen ein Genotyp in einem einzigen Mausklick in jede Vertiefung eine sechs-Well-Platte mit 2 mL α-MEM auf Eis.
   Hinweis: Um die Zellviabilität zu erhalten, sollte der Knochen unter diesen Bedingungen weniger als 1 h gehalten werden.

3. Isolation (Tag-1)

1. Einen Brunnen von einer sechs-Well-Platte mit 75 % Ethanol (3 mL) und die weiteren 5 Bohrungen mit α-MEM Medium (3 mL) füllen.
2. Setzen Sie alle Knochen von einem Genotyp in der Ethanol-Wäsche für 15 s und waschen Knochen 5 Mal mit α-MEM Medium für 10 s jedes Mal.
3. Die Epiphysen mit der Schere abgeschnitten und 0,45 mm Spritze Nadel in den Hohlraum und Flush Knochenmark, mit α-MEM Medium in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen.
4. Spülen Sie den Knochenhohlraum mit der gleichen Methode vom anderen Ende des Knochens. Mindestens zweimal wiederholen Sie, um den Knochenhohlraum gründlich waschen, bis der Knochen blass ist.
5. Zentrifugieren Sie das Knochenmark um eine Zelle Pellet bei 800 X g und 4 ° C für 5 min. Absaugen der Überstand zu erhalten.
6. Fügen Sie 3 mL der roten Blutzelle Lysis Puffer in die Zentrifugenröhrchen und Pipette vorsichtig auf das Knochenmark Aufschwemmen. Halten Sie die Zentrifugenröhrchen für 8 min zu den Erythrozyten zu lysieren auf Eis.
7. Fügen Sie 6 mL α-MEM Medium in die Zentrifugenröhrchen, Zelle Lysis zu stoppen. Bei 500 x g und 4 ° C für 10 min Zentrifugieren und den Überstand abgesaugt.
8. In 3 mL Kulturmedium α-MEM Aufschwemmen Sie und legen Sie die Zellen in einem sechs-Well-Platte (in der Regel eine Maus pro Well).
9. Über Nacht bei 37 ° C in einem 5 % CO₂ Inkubator inkubieren.

(4) Beschichtung (Tag 0)

1. Übertragen des Überstands auf eine 15 mL Zentrifugenröhrchen, die ungebunden Zellen am nächsten Morgen zu sammeln.
2. Bei 800 x g und 4 ° C für 5 min Zentrifugieren und den Überstand abgesaugt.
3. Aufschwemmen Sie in 4 mL Kulturmedium α-MEM.
4. 20 µL der Zelle Lösung nehmen und mischen mit 20 µL Trypan blau. Die Zählkammer 10 µL der Mischung hinzu und erhalten Sie die Zellzahl pro mL Lösung.
5. Fügen Sie einem entsprechenden Volumen α-MEM Kulturmedium eine Zelle Lösung von 500.000 Zellen/mL zu erhalten.
6. Fügen Sie 500 µL und 50 µL Knochenmark Makrophagen Induktion Medium in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte und 96-Well-Platte, beziehungsweise.
7. Fügen Sie 500 µL und 50 µL der Zelle Lösung in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte und 96-Well-Platte, beziehungsweise.
8. 3 Tage bei 37 ° C in einem 5 % CO₂ Inkubator inkubieren.

5. Differenzierung (3-7 Tage)

1. Drei Tage nach der Beschichtung, kassiere 50 µL Medium in jede Vertiefung der 96-Well-Platte und bei-20 ° C eingefroren und aspirieren Sie passives Medium.
2. Fügen Sie 1 mL und 100 µL Osteoklasten Induktion Medium in jedem Brunnen von einer 24-Well-Platte und einer 96-Well-Platte, beziehungsweise.
3. 2 Tage bei 37 ° C inkubieren.
4. Kassiere in jede Vertiefung 50 µL Medium und aspirieren Sie passives Medium.
5. Fügen Sie Osteoklasten Induktion Medium in jede Vertiefung.
6. 1 Tag bei 37 ° C inkubieren.
   Hinweis: Zu diesem Zeitpunkt sollten große, mehrkernigen Osteoklasten unter einem inversen Mikroskop (Abbildung 2A) eingesehen werden.
7. Wenn Osteoklasten nicht gesehen werden, verändern Sie die Osteoklasten Induktion Medium und täglich zu beobachten Sie, bis die Osteoklasten zu sehen sind.
8. Sammeln Sie 50 µL Medium aus jeder Quelle des 96-Well-Platte, nachdem Osteoklasten gebildet haben.

6. Tartrat resistente saure Phosphatase (TRAP) Färbung

Hinweis: Reifen Osteoklasten können nach 6-7 Tagen der in-vitro- Kultur (Schritt 4) vorhanden sein.

1. Aspirieren Sie Medium und waschen Sie vorsichtig 3mal mit 1 X PBS.
2. Beheben Sie die Zellen in jede Vertiefung der 96-Well-Platte mit 100 µL Lösung für 30 s bei Raumtemperatur.
3. Aspirieren Sie nach der Fixierung die Lösung und waschen Sie sanft 3 Mal mit entionisiertem Wasser auf 37 ° c vorgewärmt Deionisiertes Wasser abzusaugen.
4. Fügen Sie 100 µL der TRAP Fleck in jede Vertiefung der 96-Well-Platte hinzu und platzieren Sie die Platte in einem Inkubator bei 37 ° C für 30 min und Schild aus Licht.
5. Nach dem Färben, Aspirieren des TRAP-Flecks und 3 Mal mit entionisiertem Wasser sanft waschen.
6. Bild Osteoklasten mit einem inversen Mikroskop bei 40 X Vergrößerung.

(7) Falle Aktivität Quantifizierung Kulturmedium

1. Sammle 30 µL Kultur Überstand von jedem Bohrloch der 96-Well-Platte aus Schritt 5.1, 5.4 und 5.8; Verwenden Sie 30 µL-kultivierte Osteoklasten Induktion Medium als die negativ-Kontrolle. Legen Sie die Proben in einer neuen 96-Well-Platte.
2. Fügen Sie 90 μL der Substrat-mixture(1.5.5) in jede Vertiefung der 96-Well-Platte.
3. Legen Sie die Platte in einem Inkubator bei 37 ° C für 1 h und Schild aus Licht.
4. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 50 µL 3 M NaOH in jede Vertiefung der 96-Well-Platte.
5. Messen Sie Theabsorbance bei der Wellenlänge von 405 nm.

(8) Western Blotting

Hinweis: Nach 6-7 Tagen der in-vitro- Kultur in der 24-Well-Platte, sollte Reifen Osteoklasten sichtbar sein.

1. Aspirieren Sie das Medium.
2. Waschen Sie sanft mit vorgekühlten 1 x PBS 3 Mal.
3. Aspirieren Sie PBS.
4. 100 µL 1 x SDS Lyse Puffer mit Protease-Inhibitor cocktail hinzufügen.
5. Sammeln Hitze Lysates bei 105 ° C für 10 min und Zentrifuge bei 12.000 × g und 4 ° C für 10 min. die Überstände, die Proteine enthalten.
6. Trennen Sie die Lysates mit 30 µg Protein durch 10 % SDS-PAGE¹¹ und übertragen Sie dann auf eine Polyvinylidene Fluorid (PVDF) Membran.
7. Die Membranen mit 5 % Magermilch für 30 min zu blockieren.
8. Inkubieren Sie die Membranen mit Anti-Raptor, Anti-P-S6, Anti-S6, Anti-β-Aktin in 1:1,000 Verdünnung über Nacht in 5 % fettfreie Milch bei 4 ° C.
9. Waschen Sie die Membranen mit Tris gepufferte Kochsalzlösung mit Tween-20 (TBST) für 10 min bei Raumtemperatur.
10. Wiederholen Sie Schritt 8,9 zweimal.
11. Die Membranen mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) inkubieren-konjugierten Anti-Maus oder Kaninchen-IgG-Antikörper bei 1:5,000 Verdünnung in 5 % Magermilch für 1 h bei Raumtemperatur.
12. Waschen Sie die Membranen 3 Mal mit TBST für 10 min bei Raumtemperatur.
13. Für die Erkennung von Chemolumineszenz westlichen Chemolumineszenz HRP Substrat auf den Membranen hinzufügen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Abtropfen Sie das überschüssige Substrat und setzen Sie die Flecken auf Röntgenfilm.

Ergebnisse

Mit Hilfe dieses Protokolls, wurden eine große Anzahl von riesigen Osteoklasten am 6. Tag gesehen; Wenn riesige Osteoklasten nicht gesehen werden, möglicherweise einen weiteren Tag der Osteoklasten Differenzierung benötigt (Abbildung 1). Erfolgreiche Osteoklasten Bildung bestätigte Falle Färbung (Abbildung 2A). Osteoklasten waren Wein rot/violett Riesenzellen mit mehr als 3 Kerne. Mehr als 250 Osteoklasten wurden in jede Ver...

Diskussion

Die Osteoclastogenic-Assay ist die am weitesten verbreitete Methode zur Isolierung und Kultur Osteoklasten in-vitro-^12,13. Während mehrere RANKL-basierte Osteoklasten Induktionen beschrieben^13,14,15gewesen sein, beschrieben die vorliegende Studie ein Protokoll mit einigen Änderungen basierend auf den bisherigen Methoden.

In der vora...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Raptorfl/fl mice	The Jackson Laboratory	013188
Ctsk-cre mice			a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
α-MEM	Corning	10-022-CVR
Glutamine	Gibico	25030081
Penicillin streptomycin	Gibico	15140122
Fetal calf serum	BioInd	04-001-1A
Recombinant mouse M-CSF protein	R&D	Q3U4F9
Recombinant mouse RANKL protein	R&D	Q3TWY5
RBC lysis buffer	Beyotime	C3702
Trypan blue	Sigma-Aldrich	302643
Acetone	Shanghai Chemical Co. Ltd.
Citrate solution	Sigma-Aldrich	915
Formaldehyde solution	Shanghai Chemical Co. Ltd.
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma-Aldrich	387A-1KT
Fast Garnet GBC Base solution	Sigma-Aldrich	3872
Sodium Nitrite Solution	Sigma-Aldrich	914
Naphthol AS-BI Phosphate Solution	Sigma-Aldrich	3871
Acetate solution	Sigma-Aldrich	3863
Tartrate solution	Sigma-Aldrich	3873
Dulbecco's phosphate-buffered saline	Corning	21-031-CVR
L-tartaric acid	Sigma-Aldrich	251380
Sodium tartrate dibasic dehydrate	Sigma-Aldrich	s4797
Glycine	Shanghai Chemical Co. Ltd.
MgCl2	Shanghai Chemical Co. Ltd.
ZnCl2	Shanghai Chemical Co. Ltd.
NaOH	Shanghai Chemical Co. Ltd.
Phosphatase substrate	Sigma-Aldrich	P4744
anti-Raptor	Cell Signaling Technology	2280
anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236)	Cell Signaling Technology	2317
anti-ribosomal protein S6	Cell Signaling Technology	2211
anti-β-actin	Santa Cruz Biotechnology	sc-130300
37% formaldehyde	Xilong scientific
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane	Bio-Rad
Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL)	Millipore	00000367MSDS
IX71	Olympus
Envision	Perkin Elmer
0.45-mm Syringe
Scissor
Mosquito forcep