Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 für die Analyse der Bildung und Reparatur der DNA Double-Strand Breaks

Zusammenfassung

Diese Handschrift enthält ein Protokoll für die Analyse von DNA-Doppel-Strangbrüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1.

Zusammenfassung

DNA-Doppel-Strangbrüchen (DSB) sind schwere DNA-Läsionen. Analyse der Bildung und Reparatur des DSB ist in einem breiten Spektrum von Forschungsgebieten einschließlich Genom Integrität, Genotoxizität, Strahlenbiologie, Altern, Krebs und Arzneimittelentwicklung. In Erwiderung auf DSB ist die Histon H2AX Serin 139 in einer Region mit mehreren Megabase Paare bilden diskrete nuklearen Herde nachweisbar durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie phosphoryliert. Darüber hinaus 53BP1 (p53 bindendes Protein 1) ist ein weiteres wichtiges DSB-responsive Protein Förderung der Reparatur des DSB bei nonhomologous Ende-homologe Rekombination zu verhindern. Entsprechend den spezifischen Funktionen der γH2AX und 53BP1 möglicherweise die kombinierte Analyse von γH2AX und 53BP1 durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie ein vernünftiger Ansatz für eine detaillierte Analyse des DSB. Diese Handschrift enthält eine Schritt für Schritt Protokoll ergänzt durch methodische Hinweise für die Durchführung der Technik. Insbesondere zeigt sich der Einfluss des Zellzyklus auf γH2AX Brennpunkte Muster in normalen Fibroblasten der Zelllinie NHDF. Darüber hinaus ist der Wert der γH2AX Brennpunkte als Biomarker in Röntgenstrahlung bestrahlt Lymphozyten eines gesunden Menschen dargestellt. Zu guter Letzt wird die genetischer Instabilität in CD34 + Zellen eines Patienten mit akuter myeloischer Leukämie durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 untersucht.

Einleitung

DNA wird kontinuierlich durch endogene beschädigt (z.B., Replikation Stress, reaktive Sauerstoffspezies, innere Instabilität von DNA) und exogene(z. B.chemische radikale, Bestrahlung) Quellen (Abbildung 1)^{1,2 ,3,4}. Unter DNA-Schäden DNA-Doppel-Strangbrüchen (DSB) sind besonders schwere Läsionen und Zelltod oder Karzinogenese induzieren können. Etwa 50 DSB ergeben sich pro Zelle und Zellzyklus⁵. In Säugetierzellen entwickelte homologe Rekombination (HR) und nonhomologous Ende verbinden (NHEJ) als wichtigen Wege für die Reparatur des DSB (Abbildung 2). HR in späten S/G2-Phase tritt und nutzt eine intakte Schwester Chromatids als Vorlage für potenziell fehlerfreie Reparatur. Im Vergleich dazu ist NHEJ während des Zellzyklus aktiv und potenziell mutagene wie Basenpaare hinzugefügt oder vor der Ligatur der gebrochenen enden reseziert werden. Darüber hinaus kann Alternativen Ende-Verbindung als eine langsame mutagene Back-up Repair-Mechanismus bei NHEJ Mangel^6,7betraut sein.

DSB induzieren die Phosphorylierung des Histon H2AX Serin 139 in einer Region von mehreren Megabase Paaren um jede DSB. Bildenden nuklearen Brennpunkte werden benannt γH2AX Brennpunkte und nachweisbar durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie-⁸. ΓH2AX fördert die Einstellung von weiteren DSB-responsive Proteine und Chromatin umgestalten, DNA-Reparatur und Signal Transduction⁹beteiligt ist. Da jeder γH2AX Schwerpunkt gilt, einen einzigen DSB zu vertreten, ist die Quantifizierung der DSB durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie möglich, die nachweislich in Krebszelllinien und Patientenproben^{10,11, 12 , 13 , 14}. 53BP1 (p53 bindendes Protein 1) ist eine weitere wichtige Protein bei der Vermittlung von DSB-Reparatur. Es ist bei der Rekrutierung von DSB-responsive Proteine, Checkpoint Signalisierung und der Synapsis DSB endet¹⁵beteiligt. Darüber hinaus spielt die 53BP1 eine entscheidende Rolle bei der DSB Reparatur Weg Wahl. Es löst die Reparatur des DSB in Richtung NHEJ, während HR verhindert¹⁶ist. In Betracht der echte Funktionen γH2AX und 53BP1 in der DSB-Reparatur möglicherweise die simultane Analyse von γH2AX und 53BP1 durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie eine nützliche Methode für die genaue Analyse der Bildung und Reparatur des DSB.

Diese Handschrift enthält eine Schritt für Schritt Protokoll für Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 in Zellkernen durchführen. Insbesondere ist die Technik in normalen Fibroblasten der Zelllinie NHDF, in x-ray bestrahlt Lymphozyten eines gesunden Menschen und CD34 + Zellen eines Patienten mit akuter myeloischer Leukämie angewendet. Die Einzelheiten des Verfahrens sind im Zusammenhang mit den vorgestellten Ergebnissen hingewiesen.

Protokoll

alle hier beschriebene Methoden wurden von der Ethik Komitee II in die medizinische Fakultät Mannheim der Universität Heidelberg zugelassen. Schriftliche Einwilligung von allen Personen eingeholt wurde.

1. Vorbereitung der Materialien

1. Antikoagulans-Stammlösung: bereiten ein Antikoagulans Stammlösung 200 IE Heparin pro mL in 0,9 % Natriumchlorid. Füllen Sie jeweils die Röhrchen (zeichnen Sie Volume 9 mL) mit 2 mL der gerinnungshemmenden Vorratslösung vor Entnahme der Proben Blut oder Knochenmark.
2. Lyse-Lösung für die Erythrozyten: bereiten die 10 x Lyse-Lösung für die Erythrozyten mit 82,91 g Ammoniumchlorid, 7,91 g Ammonium Bicarbonat und 2 mL 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic sauren Lösung einen pH-Wert von 8,0 durch Auflösen der Wirkstoffe in bidestilliertem Wasser für ein Gesamtvolumen von 1 L.
3. Fixierung Lösung: hinzufügen 8.3 µL einer 1 M Kalilauge zu 360 mg Paraformaldehyd (PFA) in einem Mikrotiter-Rohr. Füllen Sie das Rohr mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bis 1 mL-Markierung des Rohres und Wärme der Röhre in einem Heizblock bei 95 ° C, 1 mL einer 36 % PFA Lösung zu bekommen. Ein Rohr mit einer Kapazität von 15 mL übermitteln Sie 1 mL 36 % PFA Lösung. Die Lösung 1 mL 36 % PFA, 9 mL einer 4 % PFA Vorratslösung zu fügen Sie 8 mL PBS hinzu. Aliquoten 4 % PFA-Stammlösung und Speicher bei-18 ° C bis zur Fixierung der Zellen nutzen.
   Achtung: (1) Kalilauge ist ätzend. Beachten Sie Augen-und Haut. (2) PFA ist krebserregend. Vermeiden Sie Hautkontakt und Inhalation. Bereiten Sie die Fixierung-Lösung unter einer Haube.
4. Permeabilisierung Lösung: hinzufügen 50 µL Octoxinol 9 bis 50 mL PBS zu einer Lösung von ca. 0,1 % Octoxinol 9.
5. Blockiert Lösung: bereiten Sie 5 % und 2 % blockieren von Lösungen durch Mischen der Protein Blockierungsmittel mit PBS und Store bei 6 – 8 ° C.

2. Vorbereitung der Proben

1. Fibroblasten in der Zellkultur: pflegen menschliche Fibroblasten der Zelllinie NHDF in einer befeuchteten 5 % CO ₂ Atmosphäre bei 37 ° C in RPMI 1640 Medium ergänzt mit 10 % fetalen Kälberserum, 4 mM Glutamin, und 1 % Penicillin/Streptomycin.
   1. Vorbereitung der einen Objektträger mit Anhänger Fibroblasten
      1. Entfernen Sie das Medium aus der Flasche (75 cm ² Wachstumsbereich) mit exponentiell wachsenden NHDF Fibroblasten. Fügen Sie 10 mL PBS in den Kolben. Vorsichtig waschen anhaftenden Fibroblasten durch manuell Schütteln der Flasche für 1 min.
      2. Die PBS zu entfernen und fügen Sie 1 mL Trypsin in den Kolben. Schütteln Sie die Flasche vorsichtig, um sicherzustellen, dass alle adhärente Zellen von Trypsin abgedeckt werden. Die Trypsin aus der Flasche zu entfernen. Legen Sie die Flasche in den Brutkasten für 5 min bei 37 ° c
      3. Nehmen die Flasche aus dem Inkubator und 10 mL RPMI 1640 Medium in den Kolben. Pipette das Medium nach oben und unten mehrmals die Fibroblasten zu zerstreuen.
      4. Der dispergierten Fibroblasten auf jeweils zwei Felder der Objektträger 0,3 mL pipette und setzen Sie die Folie in den Brutkasten für 24 h, so dass die Fibroblasten zur Folie haften. Für Immunostaining von γH2AX und 53BP1 in Kernen von Fibroblasten, fahren Sie mit Schritt 3.1.
2. Patientenproben
   1. Blutproben: verwenden Sie die Röhrchen, die angefüllt waren mit 2 mL der gerinnungshemmenden Vorratslösung und fügen 7 mL Blut in die Rohre. Speichern Sie die Proben über Nacht bei Raumtemperatur (d.h., 18-20 ° C). Am nächsten Tag isolieren die G0/G1-Phase ruhen Mononukleäre Zellen durch Dichte Gradienten Zentrifugieren (Schritt 2.2.3).
   2. Knochenmarkproben: verwenden Sie die Röhrchen, die angefüllt waren mit 2 mL der gerinnungshemmenden Vorratslösung (Schritt 1.1) und fügen Sie 7 mL Knochenmark in den Rohren. Speichern Sie die Proben über Nacht bei Raumtemperatur (d.h., 18-20 ° C). Am nächsten Tag isolieren der G0/G1-Phase ruhen Mononukleäre Zellen durch Dichte Gradienten Zentrifugieren (Schritt 2.2.3). Verwenden Sie CD34 Microbeads und Zell-Trennsäulen für die Isolierung von CD34 + Zellen.
   3. Isolierung von mononukleären Zellen durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung
      Hinweis: Mononukleäre Zellen sind von Blut und Knochenmarkproben durch Dichte Gradienten Zentrifugation ^{17 , 18 , 19} isoliert.
      1. Verdünnt den heparinisierten Blutprobe in einem Verhältnis von 1:1 mit PBS und der heparinisierten Knochenmarkprobe in einem Verhältnis von 1:3 mit PBS. Aussetzen der Zellen sanft durch Zeichnen sie in die und aus der Pipette zweimal.
      2. Volumen Dichte Gradienten Medium zu einem neuen Schlauch. Sanft Schicht verdünnten Blut oder Knochenmark auf das Dichte-Gradienten-Medium. Achten Sie darauf, nicht die beiden Schichten mischen.
      3. Zentrifugieren der Röhre für 30 min bei Raumtemperatur und 400 X g. Abziehen der oberen Plasmaschicht mit der Pipette. Dann ernten Sie sorgfältig die mononukleären Zellen in der Schicht über das Dichte-Gradienten-Medium. Übertragen der mononukleären Zellen in ein frisches Gefäß.
      4. Mindestens drei Bände von PBS hinzufügen der mononukleären Zellen in der Röhre. Aussetzen Sie die Zellen sanft durch Zeichnen sie in die und aus der Pipette zwei Mal. Zentrifugieren Sie das Rohr für 10 min bei Raumtemperatur und 400 X g.
      5. Nach dem Spin den Überstand zu entfernen und 10 mL 4 ° C, 1 x Lyse-Lösung für die Erythrozyten. Aufschwemmen der Zellen sanft durch Zeichnen sie in die und aus der Pipette zwei Mal, und das Rohr für 5 min auf Eis legen. Dann fügen Sie 30 mL PBS bei 4 ° C und Zentrifugieren Sie das Rohr für 10 min bei Raumtemperatur und 400 X g.
   4. Vorbereitung der Cytospins
      1. bereiten Sie zwei Cytospins mit mononukleären Zellen von Patientenproben (d. h., ein Cytospin für γH2AX Immunfluoreszenz Färbung und eine Cytospin für γH2AX und 53BP1 kombiniert Immunfluoreszenz-Färbung) durch Zentrifugieren (300 X g, 10 min) von 1,0 x 10 ⁵ Zellen für jede Zubereitung ( Abbildung 3 und 4).

3. γH2AX und 53BP1 Immunfluoreszenz Färbung

1. Fixierung und Permeabilisierung: befestigen Sie die Zellen mit 200 µL 4 % PFA 10 min. lang. Waschen Sie nach der Fixierung die Zellen vorsichtig dreimal mit 30 mL PBS für 5 min auf einem Labor-Shaker. Dann permeabilize die Zellen mit 200 µL von 0,1 % Octoxinol 9 für 10 min. die Zellen sanft dreimal waschen mit 30 mL 5 % blockieren Lösung für 5 min auf einem Labor-Shaker. Blockieren Sie die Zellen in 30 mL frische 5 % blockiert Lösung für 1 h
2. Inkubation mit Antikörpern
   1. inkubieren, eine Vorbereitung der Zellen mit einer Maus monoklonalen Anti-γH2AX Antikörper (1: 500) und die weitere Vorbereitung der Zellen mit einer Maus monoklonalen Anti-γH2AX Antikörper (1: 500) und eine polyklonale Kaninchen Anti-53BP1 Antikörper (1: 500) über Nacht bei 4 ° c
   2. Nach Inkubation der Zellen vorsichtig waschen 3 Mal mit 30 mL 2 % blockieren Lösung für jede 5 min auf einem Labor-Shaker.
   3. Entfernen Sie die blockierende Lösung und inkubieren Sie die erste Vorbereitung der Zellen mit einer Ziege Alexa488-konjugierten Anti-Maus Sekundärantikörper (1: 500) und die zweite Vorbereitung der Zellen mit einer Ziege Alexa488 konjugierten Anti-Maus Sekundärantikörper ( 1: 500) und ein Esel Alexa555-konjugierten Anti-Kaninchen Sekundärantikörper (1: 500) für 1 h bei Raumtemperatur.
3. Eindeckmittel: setzen Sie die Folie mit den Zellen in eine Schüssel geben und die Zellen vorsichtig dreimal für jeweils 5 min auf einem Labor-Shaker mit 30 mL PBS waschen. Entfernen Sie die PBS und montieren Sie die Zellen mit Eindeckmittel mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole. Vorsichtig ein Deckglas auf das Eindeckmittel gelegt, so dass keine Luftblasen sind eingebettet. Warten Sie mindestens 3 h zum Härten des Mediums Montage vor der Analyse der Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie.

4. Analyse von γH2AX und 53BP1 Schwerpunkte

1. Fluoreszenz-Mikroskopie: γH2AX und 53BP1 Brennpunkte in den Zellkernen mit einem Fluoreszenzmikroskop, ausgestattet mit Filter für DAPI, Alexa 488 und Cy3 während der Bildgebung auf ein 100 X Objektiv zu analysieren Vergrößerung. Bilder mit einer Kamera aufnehmen und verarbeiten der Bilder mit entsprechenden Imagingsoftware.

Ergebnisse

Analyse der γH2AX Herde in den Zellen ist in der G0/G1-Phase und G2-Phase als γH2AX Herde als verschiedene fluoreszierende Punkte (Abbildung 5A) erscheinen am genauesten. Im Gegensatz dazu wird durch verteilte Pan-nuklearen γH2AX Flecken verursacht durch den Replikationsprozess (Abb. 5 b) Analyse der γH2AX Brennpunkte in Zellen in der S-Phase erschwert.

Fixierung de...

Diskussion

Immunfluoreszenz-Mikroskopie von γH2AX und 53BP1 ist eine nützliche Methode für die Analyse der Bildung und Reparatur des DSB in einem breiten Spektrum von Forschungsgebieten. Wichtige Parameter, die Einfluss auf das Ergebnis der Experimente sind die Phase des Zellzyklus, die Agenten für die Fixierung und Permeabilisierung der Zellen, die die Antikörper und die Hardware und Software von dem Fluoreszenzmikroskop verwendet.

Die Beeinflussung des Zellzyklus γH2AX Brennpunkte Muster zeigte s...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI medium	Sigma-Aldrich	R0883	Medium for cell culture
Heparin sodium	ratiopharm	PZN 3029843	Heparin 5,000 I.U. / mL
Sodium chloride solution 0.9%	B. Braun	PZN 1957154	Component of the anticoagulant stock solution
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare	17-5442-02	Medium for isolation of mononuclear cells
Trypsin solution 10X	Sigma-Aldrich	59427C	Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture
CD34 MicroBead Kit	Miltenyi Biotec	130-046-702	Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells
Diagnostic microscope slides	Thermo Scientific	ER-203B-CE24	Microscope slides
Megafuge 1.0 R	Heraeus	75003060	Tabletop centrifuge
Cytospin device
Lid	Heraeus	76003422	Lid for working without micro-tubes
Cyto container	Heraeus	75003416	Cyto container with 2 conical bores
Clip carrier	Heraeus	75003414	Carrier for holding a cyto container and a slide
Support insert	Heraeus	75003417	Support insert for holding a clip carrier
Triton X-100 (Octoxinol 9)	Thermo Scientific	85112	Detergent for permeabilization of cell membranes
Potassium hydroxide solution 1M	Merck Millipore	109107	Necessary for preparing the paraformaldehyde solution
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Fixation agent
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	D8537	Balanced salt solution
Chemiblocker	Merck Millipore	2170	Blocking agent
Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301)	Merck Millipore	05-636	Primary antibody for detection of γH2AX
Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304)	Novus Biologicals	NB100-304	Primary antibody for detection of 53BP1
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody	Invitrogen	A-11001	Secondary antibody
Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody	Invitrogen	A-31572	Secondary antibody
Vectashield mounting medium	Vector Laboratories	H-1200	Contains DAPI for staining of DNA
Axio Scope.A1	Zeiss	490035	Fluorescence microscope
Cool Cube 1 CCD camera	Metasystems	H-0310-010-MS	Camera system for digital recording
Isis software	Metasystems	Not applicable	Microscope software