Transiente Expression von Fremdgenen in Insekt Zellen (sf9) für funktionelle Protein Assay

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Hitze Schock-induzierte Protein Expressionssystems (pDHsp/V5-His/sf9 Zellsystem), die verwendet werden können, mit dem Ausdruck Fremdeiweiße oder Bewertung der Anti-apoptotische Aktivität des potenziellen Fremdeiweiße und ihre abgeschnittenen amino Säuren in Insektenzellen.

Zusammenfassung

Das vorübergehende gen Ausdruck System ist eine der wichtigsten Technologien zur Ausführung von Protein Funktionsanalyse in Baculovirus in Vitro Zellkultursystem. Dieses System wurde entwickelt um ausdrückliche Fremdgene unter die Kontrolle des Baculoviral-Promotors in transiente Expression Plasmiden. Darüber hinaus kann dieses System auf eine funktionelle Assay des Baculovirus selbst oder Fremdeiweiße angewendet werden. Das am weitesten verbreitete und kommerziell verfügbar transiente gen Ausdruck System wird basierend auf der sofortigen-früh gen (IE) Veranstalter von Orgyia Pseudotsugata multicapsid Nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) entwickelt. Jedoch wurde eine Ebene geringe Expression von Fremdgenen in Insektenzellen beobachtet. Daher wurde eine transiente gen Expressionssystems gebaut, für die Verbesserung der Proteinexpression. In diesem System waren rekombinante Plasmide konstruiert, um die Zielsequenz unter der Kontrolle von Drosophila Hitze Schock 70 (Dhsp70) Promoter enthalten. Dieses Protokoll stellt die Anwendung von dieser Hitze Schock-basierte pDHsp/V5-HSI (V5 Epitop mit 6 Histidin) /Spodoptera Frugiperda Zelle (sf9 Zellen) System; Dieses System ist nicht nur für gen-Expression, sondern auch für die Bewertung der Anti-apoptotische Aktivität der Kandidat Proteine in Insektenzellen. Darüber hinaus ist dieses System kann entweder mit einem rekombinante Plasmid transfiziert werden oder Co transfiziert zwei potenziell funktional antagonistischen rekombinante Plasmide in Insektenzellen. Das Protokoll zeigt die Leistungsfähigkeit dieses Systems und bietet einen praktischen Fall diese Technik.

Einleitung

Zwei Eiweiß Expressionssysteme werden häufig für die Herstellung von Proteinen: intramolekulare Protein Expressionssysteme (Escherichia coli Gene Expressionssystem) und Eukaryote Expressionssysteme für Protein. Ein beliebtes Eukaryote Protein Ausdruck System ist das Baculovirus Ausdruck Vektor System (BEV)¹. Baculoviren dienten zuerst als weltweite biologische Bekämpfungsmittel von Land- und forstwirtschaftliche Schädlinge. In den letzten Jahrzehnten wurden Baculoviren als biotechnologische Werkzeuge für Protein Expressionsvektoren sowie entwickelt. Die Genome von Baculoviren bestehen aus kreisförmigen doppelsträngige DNA und umhüllten Nucleocapsids². Heute, mehr als 78 Baculovirus wurden Isolate sequenzierten³. Basierend auf den zeitlichen Kaskade von Baculoviral gen Ausdrücke in Wirtszellen Insekt, konnten die Gentranskription in vier zeitliche Kaskaden, einschließlich der sofortigen-früh, verzögert-frühe, späte und sehr späte Gene⁴eingestuft werden.

BEVSs wurden ausgewiesen, so dass die sehr späten gen Promotoren (d.h., Polyeder oder p10 Promotor) verwendet wurden, um die Zielgene fahren während der rekombinanten Baculovirus durch homologe Rekombination erzeugt wurde. Ausdruck von Fremdproteinen in Insektenzellen durch rekombinante Baculovirus ist ähnlich dem von Säugetieren Proteine in post-translationalen Modifikationen (geeignet für Glykoprotein Produktion). So wurde das Baculovirus verbreitete^5,6,7. Eine Einschränkung ist jedoch das Vorhandensein von verschiedenen N-Glykosylierung Wege in Insektenzellen⁷.

Daher wurde eine neue Baculovirus Expressionssystems Expressionssystems transiente gen entwickelt. Dieses System drückt Fremdgene unter dem Laufwerk Baculoviral unmittelbaren frühen Förderer (dh-1 -Promotor) in Insektenzellen. Durch den Einsatz dieses Systems kann das Zielprotein sofort unter die Kontrolle des dh-1 Promotors ausgedrückt werden, während des Änderns des N-Glykosylierung Weges in Insektenzellen, wodurch bessere N-linked Oligosaccharide⁷. Darüber hinaus Baculoviral unmittelbaren frühen Gene sind von der Wirtszelle RNA-Polymerase II transkribiert und erfordern keine virale Faktoren für Aktivierung⁴. Daher können Fremdeiweiße in Insektenzellen innerhalb kurzer Zeit ausgedrückt werden. Bis heute ist die transiente ist gen Expressionssystems eine der wichtigsten Technologien zur Ausführung von Protein funktionelle Assays in Baculovirus in Vitro Zellkultursystem. Das System kann angewendet werden, um die Funktion des Baculovirus oder Fremdeiweiße zu analysieren. Eines der im Handel erhältlichen transiente gen Ausdruck Systeme basiert auf die unmittelbaren frühen gen (IE) Förderer von Orgyia Pseudotsugata multicapsid Nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 und OpIE1 Promotoren).

Im Untergeschoss der Expression von Fremdgenen in Insektenzellen war jedoch noch ein Problem, als Promotor-basierte transiente gen Expressionssystems OpIE verwendeten^8,9,10war. So wurde ein anderes Transienten gen Ausdruck System basierend auf der Projektträger der Drosophila Hitze Shock Protein 70 (hsp70) gen^8,9erstellt. Die Förderer der hsp70 arbeitet effizienter als Baculoviral IE Promotor, wenn durch einen Hitzeschock in Insektenzellen¹⁰. In diesem System wurden die Zielgene unter dem Laufwerk von Drosophila Hitze Schock 70 (Dhsp70) Promoter geäußert. Fremdgene können leicht in die transiente gen Ausdruck Plasmid von PCR-basierten Klonen Methoden geklont werden. Darüber hinaus kann die Kontrolle des Zeitpunkts für die Genexpression durch Hitze Schock Induktion durchgeführt werden.

In diesem Bericht, wir folgen dem Ansatz und drei verschiedenen Trunkierungen des Baculoviral-Gens (Inhibitor der Apoptose 3, iap3 von Lymantria Xylina MNPV) mittels Hitze Schock-basierte transiente Protein Expressionssystems und weiter gelten Sie diese exprimierten Proteine auf Anti-apoptotische Aktivitätsanalyse. Dieses System kann entweder schnell Fremdeiweiße ausdrücken oder zur Bewertung der Anti-apoptotische Proteinaktivität in sf9 Zellen, wobei er auch das Potenzial für andere Protein Aktivität Assays gelten weiter angewendet werden.

Protokoll

1. Vorbereitungen

1. Insekt Zellkultur
   1. 50 mL Zellkulturmedium vorzubereiten. Hierzu hinzufügen 500 µL von Antibiotika (Amphotericin B = 0,25 µg/mL, Penicillin = 100 Einheit/mL Streptomycin = 100 µg/mL) und 5 mL Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum in serumfreien Zellkulturmedium (ohne FBS oder Antibiotika).
      Hinweis: Hitze der fötalen Rinderserum bei 65 ° C für 30 min in einem Wasserbad vor Gebrauch.
   2. Pflegen von Spodoptera Frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), sf9 Insektenzellen. Ca. nehmen Sie 80 % der Zellen aus 25 cm² Zelle Kultur Kolben durch Schütteln der Flasche ab und prüfen Sie unter Lichtmikroskopie. Dann übertragen Sie 50 % der Zellsuspension auf einem neuen 25 cm² Zelle Kultur Kolben und lassen Sie die Zellen für 15 min bei Raumtemperatur zu befestigen. Ersetzen Sie das Medium mit 5 mL frischem Zellkulturmedium und wachsen in einem Inkubator bei 28 ° C. Durchgang Zellen alle 2 bis 3 Tage je nach das Zellwachstum.
2. Vorbereitung der Plasmide zur Zelle Transfektion
   1. Legen Sie die Ziel-DNA-Fragmente (z. B. Lymantria Xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 gen und ihre Löschung Konstrukte) in pDHsp/V5-HSI von PCR-basierten Klonen Methode¹¹. Überprüfen Sie das Wachstum der transformierten Kolonien durch Kolonie eingestellt PCR mittels PCR Master Mix (2 X) und die pDhsp-F2/Op-IE2R-Grundierung. Bestätigen Sie die Plasmid-Sequenzen durch kommerzielle Sequenzierservice.
      Hinweis: Tabelle 1 zeigt die Primer für PCR und die entsprechenden Konstrukte verwendet.
   2. Einzelne sequenzierte Bakterienkolonien Kultur, enthalten die genannten Plasmid-Konstruktionen (Schritt 1.2) in 200 mL LB mittlere mit ausgewählten Antibiotika (50 µg/mL).
   3. Entziehen Sie die kultivierten E. Coli mit MIDI-Plasmid-Kit nach Herstellerangaben Anweisungen¹²Plasmide.
3. Bereiten Sie Beschichtung Medium durch das Mischen von 1,5 mL Zellkulturmedium und 8,5 mL serumfreien Zellkulturmedium vor.
4. Bereiten Sie Zellkulturmedium Actinomycin D (ActD) durch Zugabe von 1,5 µL des ActD-Lager (1 mg/mL) in 10 mL Zellkulturmedium (Endkonzentration = 150 ng/mL). Shop bei 4 ° C.

(2) vorübergehende Proteinexpression

1. Zelle, die Aussaat
   1. Ernten Sie sf9 Zellen durch Schütteln Kultur Kolben zu, zu stürzen Sie und fallen Sie die Zellsuspension auf 50 mL-Tube und übertragen Sie 10 µL einer P10-Pipette auf Hemocytometer. Zählen Sie die Anzahl von Zellen unter einem Lichtmikroskop.
   2. Platte 3 × 10⁵ sf9 Zellen in jedem Bohrloch in einer 24-Well-Platte für 15 min bei Raumtemperatur. Ersetzen Sie das Medium mit 0,5 mL Medium Plattieren.
2. Transfektion von Plasmiden
   1. Verdünnte Zelle Transfection Reagens: verdünnen 8 µL Zelle Transfection Reagens in 100 µL serumfreien Zellkulturmedium und Mischen von vortexen für 1 s.
   2. Fügen Sie 2 µg Plasmid DNA (pDHsp70-Ac-P35/V5-HSI oder pDHsp70-Ly-IAP3/V5-HSI oder pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-HSI oder pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-HSI) in 100 µL serumfreien Zellkulturmedium und Mix durch Vortexen für 1 s (Abbildung 2).
   3. Kombinieren Sie die verdünnte Plasmid-DNA und verdünnte Zelle Transfection Reagens (210 µL), und 1 S. Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur durch Vortexen mischen.
   4. 210 µL DNA Transfection Reagens Mischung tropfenweise auf die Zellen durch eine Pipette P1000 hinzufügen. Inkubation bei 28 ° C für 5 h.
   5. Ersetzen Sie die Beschichtung Medium mit 0,5 mL Zellkulturmedium mit einer Pipette P1000. Versiegeln Sie die 24-Well-Platte mit Klebeband und inkubieren Sie die Zellen bei 28 ° C 16 h.
3. Heat shock transfizierten Zellen: Legen Sie die Platte in einem 42 ° C-Wasserbad (schwimmt auf der Wasseroberfläche). Für 30 min erhitzen und die 24-Well-Platte in den Inkubator 28 ° C zurück.
4. Nachweis von Protein-expression
   1. Waschen Sie nach 1 h oder 5 h Hitzeschock die Zellen mit 0,5 mL 1 X PBS-Puffer kurz dreimal.
      Hinweis: Verdünnen Sie 10 x PBS-Puffer auf 1 x PBS-Puffer durch Zugabe von 1 mL 10 X PBS-Puffer auf 9 mL sterilisiert DdH₂O
   2. Lösen Sie die Zellen mit 40 µL 1 x SDS laden Farbstoff durch Pipettieren rauf und runter.
      Hinweis: Verdünnen Sie 4 x SDS laden Farbstoff durch Mischen von 30 µL 1 x PBS-Puffer und 10 µL 4 x SDS-Probenpuffer.
   3. Erhitzen Sie die Proteinproben bei 98 ° C für 10 min in einem Heizblock, spin-down für 1 min und setzen auf Eis für Western-Blot-Test.
   4. Western-blot assay
      Folgen Sie das Verfahren der Western-Blot-Test von Eslami und Lujan¹³. SDS-PAGE Gelen¹⁴ausgeführt: ein Gel, Coomassie blaue Färbung (Laden-Steuerung zu überprüfen, ob die Menge der Proteinproben geladen in jedem gut in Betrag entspricht) unterzogen und der anderen ausgesetzt, Western blot Assay nach Eslami und Lujan¹³ .
   5. V5-Tags Fusionsproteine mit Kaninchen Anti-V5 Antikörper (5 mg/mL) (Verdünnung 1: 5000 in TBST Puffer arbeiten Konzentration 1 µg/mL) und Ziege Anti-Kaninchen IgG-Meerrettich Peroxidase (HRP) Konjugat (0,8 mg/mL) (1: 10000 Verdünnung in TBST Puffer arbeiten zu erkennen Konzentration 0,08 µg/mL).
      Hinweis: Passen Sie den Prozentsatz der Polyacrylamid auf 17,5 % Wenn das Protein Molekulargewicht zu < 17 kDa.

3. Anti-apoptotische Aktivität assay

1. Gen-induzierte Zellapoptose: wiederholen Sie die vorgenannten Ablauf von 2.1 bis 2.3. Co transfizieren 1 µg der pDHsp/D-Rpr/FLAG-HSI Plasmid DNA (mit Apoptose-Induktor gen) mit 1 µg Plasmid DNA [pDHsp70/V5-HSI Vektor (Negativkontrolle), pDHsp70-Ac-P35/V5-HSI (Positivkontrolle), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-HSI, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-HSI oder pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-HSI, bzw..]. 5 h nach dem Hitze-Schock-Behandlung Verhalten der Zelle Lebensfähigkeit Assay (Abbildung 2).
2. Chemisch induzierte Zellapoptose: wiederholen Sie die vorgenannten Ablauf von 2.1 bis 2.3. Im Schritt 2.1.2 Platte 1 x 10⁶ sf9 Zellen in jedem Brunnen in einem 6-Well-Platte. Transfizieren 4 µg Plasmid DNA [pDHsp70/V5-HSI Vektor (Negativkontrolle), pDHsp70-Ac-P35/V5-HSI (Positivkontrolle), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-HSI, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-HSI oder pDHsp70-Ly-IAP3-RING/V5-HSI, bzw..]. 5 h nach dem Hitzeschock behandeln Sie sf9 Zellen mit 2 mL ActD Zellkulturmedium für 16 h zu und führen Sie die Zelle Lebensfähigkeit Assay (Abbildung 2).
   Hinweis: Mindestvolumen Deckung ein Brunnen des 6-Well-Platte beträgt 1 mL.
3. Durchführen Sie die oben genannten Anti-apoptotische Aktivität Assay Experimente, einschließlich 3.1 und 3.2 in Triplicates.

(4) Zelle Lebensfähigkeit assay

1. Waschen Sie die behandelten Zellen durch Zugabe von 1 mL 1 X PBS-Puffer für 1 min 3 Mal. Die Zellen durch Pipettieren 1 mL 1 X PBS-Puffer mit 0,04 % Trypan blau Aufschwemmen und Flecken für 3 min bei Raumtemperatur. Übertragen Sie die Zellsuspension in einem 1,5 mL Reaktionscup.
   Hinweis: Verdünnen Sie 0,4 % Trypan blau Lösung durch Mischen von 9 mL 1 X PBS-Puffer und 1 mL 0,4 % Trypan blau Lösung.
2. Übertragen Sie 10 µL Trypan blau gefärbten Zellsuspension auf der Hemocytometer mit einer Pipette P10 und zählen Sie die tragfähigen intakten Zellen unter einem Lichtmikroskop.
3. Statistische Analyse
   1. Berechnen Sie die aufgezeichneten Daten und präsentieren Sie als Mittel ± S.D. für alle zählt.
   2. Analysieren Sie die Daten mit Microsoft Excel die Studenten zwei-tailed t-Test durch. Definieren Sie statistisch signifikante Daten als P-Wert < 0,05.

Ergebnisse

Die volle Länge und andere zwei Trunkierungen (BIR und RING-Domänen) von Ly-IAP3 von LyxyMNPV wurden in sf9 Zellen überexprimiert basierend auf der Hitze Schock-basierte pDHsp/V5-HSI /Spodoptera Frugiperda Zelle (sf9 Zellsystem). Die pDHsp/V5-HSI enthaltenen Drosophila Hitze Schock Protein Förderer, die nachgeschalteten Genexpression bei einer Temperatur von 42 ° C Zustand antreibt, mithilfe von zellulären transcriptional Faktoren und die Übersetzung System (

Diskussion

Das Konzept der Hitze Schock-basierte pDHsp/V5-His/sf9 Zellsystem wurde erstmals von Clem Et Al. 1994⁸beschrieben. Vergleich der Baculoviral gen Promotor (IE1) und Drosophila hsp70 zeigte, dass hsp70 hatte eine höhere Effizienz in Mücke Zellen¹⁰. Darüber hinaus konnte das Timing der Proteinexpression aufgrund der Hitze-Schock-Induktion, genau nach Hitze-Schock-Behandlung kontrolliert werden. Dieses System galt dann für Protein funktio...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic, 100X	Gibco	15240-062	for insect cell culture
Certified Foetal Bovine Serum	Bioind	04-001-1A
Sf-900 II SFM	Thermo Fisher	10902096	serum-free cell culture medium
Sf9 cells	ATCC	CRL-1711
25cm2 cell culture flask	Nunc, Thermo Fisher	156340
Inverted light microscopy	WHITED	WHITED WI-400
RBC HIT Competent Cell	Bioman	RH618-J80	Escherichia coli (DH5α)
L.B. Broth (Miller)	Bioman	LBL407
Agar, Bacteriological Grade	Bioman	AGR001
Zeocin	Invitrogen	ant-zn-1	selection antibiotic
PCR Master Mix (2X)	ThermoFisher	K0171
Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free)	Geneaid	PIE25
Actinomycin D	SIGMA	A9415
Corning 50 mL centrifuge tubes	SIGMA	CLS430829-500EA	50 mL tubes
Hemocytometer	Gizmo Supply Co	B-CNT-SLDE-V2
24-Well Multidish	Nunc, Thermo Fisher	142475	24-well plate
Cellfectin II Reagent	Thermo Fisher	10362100	cell transfectin reagent
PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4	Thermo Fisher	AM9624
4×SDS Loading Dye	Bioman	P1001
Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes)	Merck Milipore	IPVH00010	PVDF membranes
Mini Trans-Blot Cell system	BIO-RED	1703930	Blotting device
Ponceau S solution	SIGMA	6226-79-5
Anti-V5	SIGMA	V8137	rabbit anti-V5 antibody
Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP)	Jackson	111-035-003
Tween 20	Merck	817072
6-Well Multidish	Nunc, Thermo Fisher	145380
0.4 % trypan blue solution	AMRESCO	K940-100ML
P10 pipetman	Gilson	F144802
P1000 pipetman	Gilson	F123602
Tape	Symbio	PPS7	24 well tape ( 19 mm×36 M)