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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Neue therapeutische Strategien in der kardialen regenerativen Medizin erfordern umfangreiche und detaillierte Studien in großen präklinischen Tiermodellen, bevor sie für den Einsatz beim Menschen betrachtet werden können. Hier zeigen wir eine perkutane Kontrast-Echokardiographie-geführte Intramyocardial-Injektionstechnik bei Kaninchen, die ist wertvoll für Hypothesentests die Wirksamkeit solcher neuartiger Therapien.

Zusammenfassung

Zell-und Gentherapie sind spannende und erfolgversprechende Strategien zur kardialen Regeneration im Rahmen der Herzinsuffizienz mit reduzierte Ejektionsfraktion (HFrEF). Bevor sie können für den Einsatz in Betracht gezogen und in den Menschen umgesetzt werden, müssen umfangreiche präklinische Studien in großen Tiermodellen, die Sicherheit, Wirksamkeit und Schicksal der Injectate (z.B. Stammzellen) einmal in das Myokard geliefert zu bewerten. Kleine Nager-Modelle bieten Vorteile (z. B.Preis-/Leistungsverhältnis, Hilfsbereitschaft für Genmanipulation); Allerdings übersetzen inhärente Einschränkungen dieser Modelle gegeben, die Ergebnisse in diesen selten in der Klinik. Umgekehrt haben große Tiermodellen wie Kaninchen, Vorteile (z.B. ähnliche kardiale Elektrophysiologie im Vergleich zu Menschen und andere Großtiere), Beibehaltung eine gute kostengünstige Balance. Hier zeigen wir, wie eine perkutane Kontrast Echokardiographie-geführte Intramyocardial (IMI) Injektionstechnik, ausführen, die minimal-invasive, sichere, gut verträglich und sehr wirksam bei der gezielten Bereitstellung von Injectates, einschließlich der Zellen ist, in mehreren Standorten innerhalb der Herzmuskel eines Kaninchen-Modells. Für die Umsetzung dieser Technik haben wir auch eine verbreitete klinische Echokardiographie-System genutzt. Nachdem man in der Praxis das Protokoll beschrieben hier, ein Forscher mit grundlegenden Ultraschall wissen werden kompetent bei der Erfüllung dieser vielseitige und minimal-invasive Technik für den Routineeinsatz in Experimenten, die darauf abzielen, Testen von Hypothesen von der Funktionen der kardialen regenerativen Therapeutika in der Kaninchen-Modell. Kompetenz erreicht, kann die ganze Prozedur innerhalb von 25 Minuten durchgeführt werden, nach dem Betäuben der Kaninchens.

Einleitung

Zell- und Gentherapie Therapien sind aufregend und immer Entwicklung von Strategien für die Regeneration/Reparatur der geschädigten Herzmuskel in HFrEF. Einige Studien haben die Wirksamkeit (z.B. Zelle Rückhalterate) von den verschiedenen Routen der Zelle Lieferung verglichen, die konsequent die Überlegenheit des IMI über intracoronary oder intravenös Routen1,2 unter Beweis gestellt haben , 3 , 4 , 5. so, ist es nicht verwunderlich, dass ein Großteil der Studien auf translationale Modelle der Stammzell-Therapie von der geschädigten Herzmuskel, liefern die Injectate über das IMI unter direktem Blick in einen offenen Brustkorb Verfahren6,7 durchgeführt . Dieser Ansatz hat jedoch einige Einschränkungen, einschließlich der invasiven Art des Verfahrens, die das Risiko von Peri prozedurale Sterblichkeit (oft unter-berichtet)8trägt. Darüber hinaus beseitigt ein IMI unter direkter Sicht nicht die Möglichkeit für die versehentliche Injektion in den linksventrikulären Hohlraum. In der klinischen Praxis könnte ein IMI während der offenen Brustkorb Operation eine geeignete Methode zur therapeutischen Zelle Lieferung, z.B., während koronare Bypasschirurgie Transplantat (CABG); jedoch kann dieser Ansatz nicht für Zelle Lieferung in globalen Kardiomyopathie nicht ischämischen Ursprungs (z. B.HFrEF sekundäre Anthracyclin-induzierten Kardiomyopathie (AICM)) geeignet.

Es besteht kein Zweifel, dass ischämische Herzkrankheit (IHD) ist die häufigste Ursache von HFrEF (~ 66 %)9,10; nicht-ischämische Kardiomyopathie, einschließlich AICM, betrifft jedoch noch einen Großteil der Patienten mit HFrEF (33 %)9 . In der Tat führten die jüngsten Fortschritte in der klinischen Onkologie in mehr als 10 Millionen Überlebende des Krebses in den USA allein11, mit Schätzungen über eine ähnliche Zahl in Europa, mit eine allgemeine Tendenz in Richtung verbesserte Überleben von Krebspatienten12 ,13. So angesichts erkunden die Vorteile der neuartigen Therapien, wie z. B. Stammzell-Transplantation für nicht-ischämische Kardiomyopathie sowie die Erprobung einer effektiven und minimal-invasive Route der Stammzell-Lieferung von größter Bedeutung ist, der wachsenden Zahl von Patienten Kardiotoxizität Krebsmedikamente Sekundär betroffen.

Der Hinweis beinhaltet Hypothesentests Studien mit Stammzell-Therapie mit dem Ziel, Reparatur/Regeneration der geschädigten Herzmuskel häufig die Verwendung von kleinen Nagetieren (z.B., Mäuse und Ratten). Diese Modelle erfordern oft teure Hochfrequenz-Ultraschall-Systeme für die Beurteilung der myokardialen Funktion, in der Regel ausgestattet mit linear-Array-Sensoren, die damit verbundenen Einschränkungen (z.B. Nachhall)14haben. Jedoch haben andere Modelle wie Kaninchen, ein großes präklinisches Modell vertreten einige Vorteile für Hypothesentests Stammzelltherapien in HFrEF. Auf diese Weise beibehalten im Gegensatz zu Ratten und Mäuse, Kaninchen eine Ca+ 2 Transportsystem und zelluläre Elektrophysiologie, die ähnelt der Mensch und andere große Tiere (z.B.Hunde und Schweine)15,16,17 ,18,19. Ein weiterer Vorteil ist ihre Bereitschaft für die Herzultraschalluntersuchung Bildgebung mit relativ preiswert und überall erhältlich klinische Echokardiographie Systeme ausgestattet mit relativ hoher Frequenz Phase-Array-Sensoren, z.B., 12 MHz, wie die häufig verwendeten in der Neugeborenen- und Pädiatrische Kardiologie. Diese Systeme ermöglichen hervorragende echokardiographische Bildgebung mit State-Of-The-Art Technologie, und sie profitieren von der Überlegenheit der Harmonic imaging-20. Darüber hinaus umfangreiche Hypothesentests das Potenzial der kardialen regenerative Therapien (z.B. Stammzell-Therapie), ihre Sicherheit, Wirksamkeit, Cardiomyogenic Potenzial, sowie Bewertung von dem Schicksal der Injectate einmal geliefert, in der Myokard, ist zwingend erforderlich, bevor sie für den menschlichen Gebrauch betrachtet werden können, und sie erfordern den Einsatz von großen präklinischen Tiermodellen, wie der Hase17,19. Hier beschreiben wir eine minimal-invasive Technik zur Zelle Lieferung über perkutane Kontrast-Echokardiographie geführte IMI mit einem klinischen Echokardiographie-System sich an Stammzell-Transplantation-Therapie für nicht-ischämische Kardiomyopathie20 richtet . Wir beschreiben auch die Vorteile der Tusche (InI, auch bekannt als China Tinte) als ein Ultraschall Kontrast Agent und in Situ Tracer von der Injectate im Herzen von Kaninchen.

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Protokoll

Die hier beschriebenen Experimente wurden von der Ethikkommission der Forschung der Universität Murcia, Spanien, genehmigt und wurden gemäß Richtlinie 2010/63/EG der Europäischen Kommission durchgeführt. Die beschriebenen Schritte wurden unter operativen Standardprotokolle, die nicht ausschließlich für die Zwecke der Dreharbeiten des dazugehörigen Videos zu diesem Papier durchgeführt wurden und wurden Teil des Plans der Arbeit durchgeführt.

1. Vorbereitung der Zellen und Säugetieren Expressionsvektor

Hinweis: Hier beschreiben wir kurz ein Protokoll für die Vorbereitung und Transfektion einer Zelllinie (menschliche embryonale Nieren 293 (HEK-293)); entsprechende Zelle bestimmte Protokolle für die Zelle Art von Interesse sollte jedoch optimierte (z.B.Stammzellen).

  1. Pflegen, HEK-293-Zellen im hohen Glukose Dulbecco modifizierten Adlers Medium (DMEM) mit 10 % fetalen Kälberserum (FCS), 1 % Natrium Pyruvat, 2 mM Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt und inkubiert bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO2 . Sobald Zellen Sub konfluierende, aufgeteilt in einem Verhältnis von 1:3 sind.
  2. Teilung der Zellen durch Absaugen von den Medien, dann waschen einmal mit sterilen Phosphat Kochsalzlösung (PBS gepufferte) zu starten, entfernen Sie überschüssige PBS und dann mit 2,5 mL 0,5 x Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) (5 min, 37 ° C) inkubieren.
    1. Fügen Sie ein Volumen von DMEM Medien (ergänzt wie oben beschrieben), die Reaktion zu stoppen, und lösen Sie dann die Zellen durch langsam und sanft nach oben und unten mit einem elektronischen Pipette absaugen.
  3. Übertragen Sie anschließend die Zellsuspension auf einen geeigneten Behälter (z.B. konische Zentrifugenröhrchen 15-50 mL). In einem Schwung Eimer (100 X g) zentrifugieren, überstand verwerfen und das Pellet zweimal mit sterilen PBS waschen.
  4. Das Pellet in frischen DMEM Medien und Samen nach einer entsprechenden Zelldichte (z.B. 1 x 106 Zellen in einem 75 cm2 Kolben) in frischem Kulturflaschen oder große Gerichte nach lokalen Laborpraxis aufzuwirbeln.
    1. Ersetzen Sie vorhandene Medien mit neuen Medien alle 2 Tage.
      Hinweis: Dem Expressionsvektor wurde von pIRES1hyg abgeleitet und entsprechend den Anweisungen des Herstellers als zuvor beschriebenen21verwendet. p(EGFP) IRES1hyg wurde durch subcloning EGFP cDNA als eine BamHI + NotI aus pEGFP-N1 in der BamHI einfügen + NotI pIRES1hyg21 verdautgeneriert.
  5. 1 Tag vor Transfection Zellen bei einer Dichte von 0,5 x 105 Zellen/cm2 in 12 oder 24-Well Gewebekultur Platten Samen HEK-293.
  6. Am Tag der Transfektion bereiten Sie DNA-Lipid Transfection Reagens komplexe in separate 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen (1 Röhre/Na).
    1. Starten Sie durch Zugabe von 250 µL reduzierte Serum Medium in jedem Röhrchen, und fügen Sie dann 4 µg DNA (mischen).
    2. Anschließend 250 µL aus hinzufügen eine vorbereitete Mischung aus 10 µL Lipid Transfection Reagens und 250 µL reduzierte Serum Medium, jede Röhre (wieder mischen).
    3. Schließlich gehen Transfektionen, indem HEK-293-Zellen mit DNA-Lipid Transfection Reagens komplexe für 4 h Inkubation und dann ersetzen mit DMEM Medium ergänzt wie beschrieben (Schritt 1.1), und ein weiteres 48 h. Perform Medikament Auswahl an stabilen inkubieren Transfectants mit 100 µg/mL Hygromycin B.
  7. HEK-293-Zellen mit Trypsin wie beschrieben (Schritt 1.2) zu lösen. Nach dem Waschen der Zellen in sterilen PBS, Aufschwemmen Sie in ein geeignetes Fahrzeug (z.B.10 % V/V InI mit PBS-Puffer), um eine endgültige Zellkonzentration von 5 x 106/mL zu erreichen.

2. Vorbereitung des Kaninchens

Hinweis: Die Positionierung der Kaninchen und der Wandler für IMI ist nicht optimal, Morphologie und Funktion des Herzens des Tieres zu bewerten. Daher ist es ratsam, eine komplette echokardiographische Untersuchung20 vor der IMI (siehe unten) und zu späteren Zeitpunkten durchzuführen, wie durch das experimentelle Design definiert. Dies soll die Grundlinie anatomischen und funktionellen Eigenschaften des Herzens in das Tier zu bewerten, die eine Injektion erhalten, und auch die Auswirkungen des IMI in der Funktion des Herzens zu bewerten.

  1. Führen Sie diese Untersuchung in einer verblindeten Mode und nach den Leitlinien des Ausschusses für Echokardiographie des American College of Veterinary Internal Medicine und der amerikanischen Gesellschaft der Echokardiographie/europäischer Verband für Cardiovascular Imaging 22 , 23 , 24.
  2. Erhalten Sie eine gleichzeitige 1-Blei Elektrokardiogramm (EKG) Verfolgung während der gesamten echokardiographischen Studie.
  3. Die Kaninchen mit Ketamin zu betäuben 10 mg/kg, kombiniert mit Medetomidine 200 µg/kg, intramuskuläre Injektion (i.m.).
  4. Überprüfen Sie die Höhe der Anästhesie nach 10-20 min nach Verabreichung der Anästhesie.
  5. Mit einem Haarschneider Haare der Brust weit entfernen (z. B.unterhalb des Halses in die Sub xiphoid Region) (Abbildung 1A).
  6. Weitere Regionen von 1 – 2 cm2 in die Innenseite der rechten Vorderbein (Mediocubital Region) und beide Hinterbeine (Mediotibial Region) zu rasieren (Abbildung 1 b).
  7. Legen Sie selbstklebende EKG-Elektroden auf die rasierten Regionen der Gliedmaßen, den Herzrhythmus synchron während des Verfahrens (Abbildung 1) zu überwachen.
  8. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf eine Wärmedecke Dekubitus mit den Gliedmaßen ausgestreckt mit chirurgischen Klebeband befestigt, die Tabelle (Abbildung 1).
    1. Stellen Sie sicher, dass die Ohren nach hinten gebeugt werden hinter dem Kopf/Rücken des Kaninchens und an einer Stelle, die niedriger ist als die Vorderbeine, da dies hilft, um korrekte Positionierung des Thorax des Tieres während des Verfahrens zu erhalten.
  9. Lassen Sie das Tier spontan zu atmen, während Sauerstoff durch Gesichtsmaske während des gesamten Verfahrens (100 %, 2-3 L/min) zu verwalten.

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Abbildung 1: Vorbereitung des Kaninchens auf IMI. (A) Clip Haar vom Thorax; (B) Clip Haar von Gliedmaßen; (C) Elektroden anbringen und positionieren Sie die Kaninchen mit Beine ausgestreckt auf eine Wärmedecke. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

3. perkutane Kontrast-Echokardiographie-geführte IMI-Technik bei Kaninchen

  1. Reinigen und desinfizieren der Haut des Thorax mit einer Chlorhexidin-basierten Lösung.
    1. Verwenden Sie eine aseptische Technik während des gesamten Verfahrens nach aktuellen best Practice.
    2. Wann immer möglich, und wenn möglich, führen Sie eine vollständig steril Verfahren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, die Verwendung von sterilem Material wie Kleider, Handschuhe, chirurgische Wunde drapiert, sterilem Verbandsmaterial für die Tabelle, sowie ein steriler Ultraschall Wandler-Abdeckung und steril Ultraschallgel. Dies wird auf ein Minimum reduzieren das Risiko der Einschleppung von Krankheitserregern zum Empfangen von IMI Tier und ist gängige Praxis in der klinischen Einstellung (z.B., während Herzpunktion).
      Hinweis: Es wird empfohlen, immer im Einklang mit lokalen und nationalen Vorschriften von Tierversuchen für die lokalen Institution und Land der Praxis fortzufahren.
  2. Gelten Sie Ultraschallgel Übertragung, auf der Brust und/oder auf den Schallkopf und mit der Wandler Kordel um den Experimentator Hals, führen Sie einen schnellen Fenster Scan des Herzens, des Tieres, die oft hilfreich, Anatomie zu visualisieren und für das IMI zu planen ist.
  3. Legen Sie den Schallkopf manuell an der 4th-6th Intercostalneuralgie Raum, 2-3 cm von der Linie rechts Parasternal mit einem Einfallswinkel von ~ 90 ° in Bezug auf der rechten Seite der Brustwand (Abbildung 2A).
  4. Ändern Sie die Position des Wandlers im Verhältnis zu den Intercostalneuralgie Raum sowie seine Anteroposterior und dorsoventral Winkel um einen modifizierten kurze Achse Blick auf die Ebene der papillären Muskeln zu optimieren. In dieser Ansicht zu identifizieren, den rechten Ventrikel (RV), linken Ventrikel (LV), interventricular Septum (IVS), hinteren Wand (PW), sowie anterolateralen (AL) und Posteromedial (PM) papilläre Muskeln (Abbildung 2 b).
    1. Haben Sie ein weites Sichtfeld durch die Tiefe über das entsprechende Steuerelement auf dem System (z. B., Taste, Zifferblatt) deutlich zu erhöhen.
    2. Besonderes Augenmerk auf ein symmetrisches Bild in dieser Sicht als auch die entsprechende Differenzierung der endokardialen und epicardial Konturen zu erhalten, und passen Sie ggf. durch Bild-Optimierung-Steuerelemente (z.B.Gewinn).
  5. Sobald die optimale echokardiographische Ansicht (Abb. 2 b) vorliegt, halten Sie diese Stellung während der Rest des Verfahrens, während ein zweite Operator das IMI (siehe unten führt).
    1. Während Sie den Schallkopf zu halten, zu vermeiden, verschweigen die Wandler-Orientierung-Marke, die immer nach vorn, gegenüberstehen sollte damit die Ausrichtung mit der Nadel in den nachfolgenden Schritten (Abb. 2A, C).
  6. Positionieren Sie mit einer 24-G-Nadel befestigt eine 1 mL Spritze die Nadel in der Nähe der Haut des linken Hemithorax symmetrischen Spiegelung in Bezug auf den Schallkopf. Dann manuell ausrichten die Nadel mit dem Schallkopf Ausrichtung Zeichen in einem Winkel von ~ 90° (Abbildung 2), und die Nadel durch die Haut und in die Brusthöhle langsam vorwärts.
    Hinweis: Die perkutane Nadel Einfügung in dieser Position und Ausrichtung ermöglicht die Visualisierung der Nadel in der Ebene des Ultraschallstrahls (Abbildung 2D, E), so dass Echtzeit-Überwachung und, falls notwendig, Anpassung der die Position der Nadel im Verhältnis zu der Zielregion des Myokard (Abbildung 2 G, H).
  7. Mit der Spitze am Zielort, langsam liefern die Injectate (bis zu 0,25 mL Pro Injektionsstelle) innerhalb von 10-30 s (Abb. 2E), während langsam und vorsichtig zurückziehen der Nadelöhrs beim Einspritzen, erhöhen Sie den Umfang des Myokard behandelt.
    1. InI verwenden 10 % (V/V) verdünnt mit PBS-Puffer für Standardisierung der Technik und als eine in Situ -Tracer während Kompetenz, sowie Erwerb von bestätigen erfolgreiche Angriffe auf allen vier IMI-Standorten im Myokard durch grobe Pathologie und Histopathologie (siehe Vertreter-Ergebnisse). Kompetenz erreicht, konnte InI durch eine geeignete kommerzielle Ultraschall-Kontrastmittel ersetzt werden, falls gewünscht.
      Hinweis: Lieferung von 10 % (V/V) InI in PBS mit oder ohne Zellen in das Myokard Ergebnisse in Transmural Hyperechogenicity (d.h. Echo helles Aussehen) an die Ziel-Site der Einspritzung (Abbildung 2E, F) verdünnt. Vorübergehende Verlangsamung oder Beschleunigung der Herzfrequenz, vorzeitige ventrikuläre Kontraktionen (z.B., isoliert, Couplets und Triplets) zugeordnet werden häufig beobachtet, sogar vom ersten Kontakt der Nadel mit der Epicardium sowie während bzw. kurz nach IMI. Allerdings keine lebensbedrohlichen Arrhythmien werden entwickelt und akute Nebenwirkungen sind selten beobachtet mit bis zu 0,25 mL (1,25 x 106 Zellen) Injectate Pro Injektionsstelle IMI (siehe Vertreter Ergebnisse und Diskussion).
  8. Führen Sie subtile Veränderungen in der Einfallswinkel der Nadel wie nötig Injektionen von 0,25 mL für jede der vier Ziel-IMI-Sites abgeschlossen (drei im linken ventricular freien Wand (LVFW) und in der IVS).
  9. Bewerten Sie nach Abschluss der perkutanen Kontrast Echokardiographie-geführte IMI Verfahren Herzrhythmusstörungen (z. B.durch serielle ECG Spur bzw. 24 h Holter ECG) zu, und führen Sie serielle Fenster echokardiographische Scans um zu überprüfen, das Fehlen von Komplikationen, bis das Tier vollständig aus Anästhesie, und übertragen Sie nur dann zu einem Lichtzyklus Raum gewonnen wird.
    1. Hier verwenden wir 24 h Holter ECG, um die Auswirkungen von IMI mit InI auf Herzrhythmus für 24 h zu überwachen. Dazu verglichen wir eine Gruppe von 6 Kaninchen mit normalen Phänotyp (normale Gruppe) und eine Gruppe von 6 Kaninchen, die intravenösen Gabe von Doxorubicin (eine kardiotoxische Anthrazyklin Droge, häufig verwendet für die Behandlung von Krebs; erhalten DOX-Gruppe) in einer Dosis von 2 mg/kg/Woche für 8 Wochen und dann beide Kohorten erhielt IMI mit InI.

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Abbildung 2 . Perkutane Kontrast-Echokardiographie-geführte Intramyocardial-Injektion bei Kaninchen. (A) Platzierung der Wandler in der rechten Hemithorax in einem Winkel von ~ 90 °. (B) repräsentatives Bild einer Parasternal kurze Achse Ansicht (PSSX) des Herzens auf der Ebene der papillären Muskeln bei Kaninchen. (C) Ausrichtung der Nadel in einem Winkel von ~ 90 ° im Verhältnis zu den Wandler Orientierung Mark. (D) Lage der Nadel an der Ziel-Site in einer PSSX Ansicht des Herzens (beachten Sie, dass die Nadel leicht in der Ebene des Ultraschallstrahls visualisiert wird). (E und F) Demonstration der Hyperechogenicity an die Ziel-Site nach Intramyocardial Einspritzung mit Tusche (Pfeilspitzen markieren die Transmural-Hyperechogenicity). (G) zufällige Position der Nadel in der LV-Kammer (Pfeilspitzen markieren die Nadel-Welle). (H) Neupositionierung der Nadel, um die LV freie Wand (Pfeilspitzen markieren die Nadel-Welle). RV = rechte Herzkammer; LV = linke Herzkammer; IVS = interventricular Septum; PW = hinteren Wand; AL = anterolateralen papillären Muskel; PM = Posteromedial papillären Muskel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

4. buchen Sie IMI-Analysen

  1. Führen Sie histopathologische Analyse von Gewebeproben Herz von Kaninchen.
    1. Beheben Sie Gewebe für 24 h in 10 % Formaldehyd, gefolgt von Dehydrierung mit zunehmendem Ethanol-Konzentrationen wie folgt:
      • 1 X 70 % (60 min)
      • 1 X in 95 % ethanol/5% Methanol (60 min)
      • 1 X 100 % (60 min)
      • 1 X 100 % (90 min)
      • 1 X 100 % (120 min)
      Hinweis: Alle oben genannten Inkubationen sind bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt. Dann zweimal mit 100 % Xylol (1 h, RT) ersetzen, und schliesslich in Paraffin in zwei Schritten (60 min, 58 ° C)25einbetten.
    2. Durchführen Sie 4-5 µm Gewebeschnitte mit einem Mikrotom25. Montieren Sie Abschnitte auf Folien.
    3. Führen Sie die Färbung mit Hämatoxylin-Eosin und Masson trichrome Methoden25,26,27.
  2. Führen Sie in Gewebeschnitten von transplantierten Herzen Immunohistochemistry um EGFP(+) HEK-293-Zellen (z. B.mit der Avidin-Biotin-Komplex (ABC) Methode), kurz zu erkennen:
    1. De-Wachs 4-5 µm Dicke Herz Abschnitte in 100 % Xylol (10 min bei RT). Rehydrieren Sie Gewebe durch Waschen mit abnehmender Ethanol Konzentration Lösungen (2 X 100 % (2 min); 2 X 95 % (2 min); 1 X 70 % (2 min); 1 X 50 % (2 min); 1 X 30 % (2 min); 1 X ddH2O (2 min)) bei RT
    2. Durchführen Sie Hemmung der endogenen Peroxidase durch Abdecken der Abschnitte mit 100 µL 3 % H2O2 verdünnt in Methanol (vorbereitet mit 5 mL 30 %-Stammlösung von H2O2und Hinzufügen von Methanol auf ein Gesamtvolumen von 50 mL) ( 30 min, RT inkubieren), und dann waschen durch Untertauchen mit Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS; pH 7.6).
    3. Führen Sie Antigen Demaskierung durch enzymatische Behandlung durch Abdecken der Abschnitte mit 100 µL 0.1 % Pronase (vorbereitet mit 0,01 g Pronase verdünnt in 10 mL TBS) (12 min, RT inkubieren), dann waschen Sie mit TBS (5 min, RT).
    4. Brüten in blocking-Lösung (normalem Ziegenserum bei 10 % in TBS) mit 100 µL pro Folie (30 min, RT), und waschen Sie mit TBS (5 min, RT).
    5. Inkubieren mit Huhn Anti-grün fluoreszierendes Protein (GFP) als primären Antikörper (1: 500 in TBS) (1 h, 30 ° C), und waschen Sie mit TBS (5 min, RT).
    6. Inkubieren mit Sekundärantikörper biotinylierte Ziege-Anti-Huhn IgG (1: 250 in TBS) (1 h, 30 ° C), und dann waschen mit TBS (5 min, RT).
    7. Inkubieren mit Avidin-Biotin-Komplex (20 min, 30 ° C), und dann beschriften mit 3,30-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride (DAB) (RT, 5-10 min).
    8. Schließlich durch Waschen in steigenden Ethanol-Konzentrationen (1 X 30 % (2 min); 1 X 50 % (2 min); 1 X 70 % (2 min); 2 X 95 % (2 min); 2 X 100 % (2 min)) bei RT, Abschnitte der Gegenfärbung mit Hämatoxylin-Eosin Methode25Entwässern Sie, und befestigen Sie dann die Abdeckung Folien. Enthalten Sie positiv, negativ sowie Isotype Steuerelemente.
      Hinweis: Das kurze Protokoll beschriebenen dient nicht für allgemeine Immunohistochemistry Gebrauch; Optimierung für das Gewebe der Zinsen und Bedingungen ist notwendig.

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Ergebnisse

Perkutane Kontrast Echokardiographie-geführte IMI mit InI:

Mit dem Protokoll beschriebenen, und sobald die optimale Positionierung der Spitze der Nadel durch Echokardiographie und die Injektion initiiert bestätigt wurde, Transmural Hyperechogenicity bei der Lieferung von InI beobachtet wurde (10 % V/V mit PBS-Puffer) (Abb. 2E) , auch so kurz nach der IMI in der Zielregion (

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Diskussion

Das primäre Ziel war es, eine minimal-invasive Technik zu entwickeln, die für die Lieferung von Stammzellen in das Myokard Kaninchen (eine groß dimensionierte präklinischen Tiermodell)17,18, verwendet werden könnten, während die Verwendung von nutzen eine relativ kostengünstig imaging-System leicht zugänglich in vielen klinischen und Forschungszentren. Hier zeigen wir, dass mit einem klinischen Echokardiographie-System und unterstützt durch InI, ein weit...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren danken Sheila Monfort, Brenda Martínez, Carlos Micó, Alberto Muñoz und Manuel Molina für exzellente Unterstützung bei der Sammlung von Daten und Carlos Bueno für die Bereitstellung der EGFP(+) HEK-293-Zellen. Diese Arbeit wurde teilweise durch unterstützt: Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, Región de Murcia, Spanien (JT) (Anzahl zu gewähren: 11935/PI/09); Red de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, VI PN de ich + D + I 2008-2011 (keine zu gewähren. RD12/0019/0001) (JMM), kofinanziert mit Mittel aus den Strukturfonds der Europäischen Union (FEDER) (JMM); und der University of Reading, Vereinigtes Königreich (AG, GB) (zentrale Finanzierung). Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
HD11 XE Ultrasound SystemPhilips10670267Echocardiography system.
S12-4PhilipsB01YgG4-12 MHz phase array transducer
Ultrasound Transmision Gel (Aquasone)Parket laboratories IncN 01-08
Vasovet 24GBraunREF 381212 over-the-needle catheter
Omnifix-F 1 ml syringeBraun9161406V
Imalgene (Ketamine)MerialRN 9767Veterinary prescription is necessary
Domtor (Medetomidine)EsteveCN 570686.3Veterinary prescription is necessary
Heating Pad
Faber-Castel TG1Faber-Castel16 33 99India (China) Ink
Holter SyneflashEla medicalSF0003044S24 h Holter ECG system.
Electrodes Blue Sensor®Ambu (NUMED)VLC-00-SHolter ECG electrodes.
MicrotomeLeica BiosystemsRM2155
MicroscopeOlimpusCO11
ABC Vector EliteVector LaboratoriesPK-6200Avidin Biotin Complex Kit.
Chicken anti-GFP antibodyInvitrogenA10262Primary antibody.
Biotinylated goat-anti-chicken IgG AntibodyVector LaboratoriesBA-9010Secondary Antibody.
3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)DAKO (Agilent)S3000
Fluorescence MicroscopeCarl Zeiss
MicroImaging		Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECGElamedicalSyneflash SF0003044S
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Fisher Scientific11965084
10% fetal calf serum (FCS)Fisher Scientific11573397
0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Fisher Scientific25300054
Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent)Fisher Scientific11668019
Reduced serum medium (Opti-MEM)Fisher Scientific31985070
Hygromycin BCalbiochem (MERCK)400051
Xylene (histological)Fisher ScientificX3S-4
Hydrogen Peroxide Solution (H2O2)SigmaH1009
PronaseFisher Scientific53-702-250KU

Referenzen

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