Messung der Genexpression in bombardierten Gerste Aleuronschicht Schichten mit erhöhter Durchsatz

Zusammenfassung

Eine verbesserte Protokoll ist für die Messung der transiente Genexpression von Reporter Konstrukte in Gerste Aleuronschicht Zellen nach Bombardement Teilchen vorgestellt. Die Kombination von automatisierten Getreide mahlen mit 96-Well-Platte Enzym-Assays bietet hohen Durchsatz für das Verfahren.

Zusammenfassung

Die Aleuronschicht Gerstenkörner ist ein wichtiges Modellsystem für Hormon-regulierten Genexpression in Pflanzen. In Aleuronschicht Zellen Gene benötigt zur Keimung oder frühe Sämling-Entwicklung werden aktiviert, indem Gibberellin (GA), während Gene zugeordnete Stressreaktionen durch Abscisic Säure (ABA) aktiviert werden. Die Mechanismen der GA und ABA Signalisierung können abgefragt werden, durch die Einführung von Reporter Genkonstrukte in Aleuronschicht Zellen über Teilchen-Bombardement, mit den daraus resultierenden transiente Expression mit Enzym-Assays gemessen. Eine verbesserte Protokoll wird berichtet, dass teilweise automatisiert und rationalisiert das Korn Homogenisierung Schritt und die Enzym-Assays, wodurch deutlich mehr Durchsatz als bestehende Methoden. Homogenisierung der Getreide Proben erfolgt über eine automatisierte Gewebe-Homogenisator und GUS (β-Glucuronidase) Assays werden mit Hilfe einer 96-Well-Platte-System durchgeführt. Repräsentative Ergebnisse über das Protokoll legen nahe, dass Phospholipase D Tätigkeit eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der HVA1 Genexpression von ABA, durch den Transkriptionsfaktor TaABF1 spielen kann.

Einleitung

Die Aleuronschicht Gerste ist eine gut etablierte Modellsystem für das Studium der Hormon-regulierten Genexpression in Pflanzen¹. Insbesondere werden eine Reihe von Genen, die für die Keimung oder frühe Sämling-Entwicklung durch Gibberellin (GA), aktiviert, während Gene zugeordnete Stressreaktionen durch Abscisic Säure (ABA) aktiviert werden. GA und ABA Signalwege sind miteinander verflochten, wie der Ausdruck einiger GA-aktivierten Gene von ABA und umgekehrt¹gehemmt wird.

Eine sinnvolle Strategie für Verständnis, dass die Rolle von bestimmten Akteuren bei der Signalisierung GA/ABA wurde die Einführung der Effektor Genkonstrukte über Teilchen-Bombardement, gefolgt von transienten Expression Reporter Konstrukte, mit denen den daraus resultierende Effekt auf nachgeschalteten Genexpression bestimmt werden. Die Verwendung von Reporter-Gene wie GUS (β-Glucuronidase) oder Luciferase ermöglicht die sensible und quantitative Messung der Genexpression speziell innerhalb der Zellen, die die Effektor-Konstrukt erhalten haben. Zum Beispiel festgestellt die Einführung eines Effektor-Konstrukts Codierung der Transkriptionsfaktor TaABF1^5,6 , dass ABA-induzierten Genen wie HVA1 von TaABF1, beim GA-induzierten Genen wie Amy32b induziert werden werden unterdrückt. Teilchen-Bombardement als experimentelle Strategie wurde von mehreren Labors untersuchen verschiedene Aspekte des GA/ABA Signalisierung verwendet. Diese Arbeit führte zur Identifizierung der Promotor Elemente wichtig für die Aktivierung des GA-induzierte² und ABA-induzierten Genen³und zur Entdeckung von Protein Kinasen⁴ und Transkription Faktoren⁵ , die Regeln der Expression dieser Gene.

Die vorhandenen Protokolle^2,3,4,5,6 für Teilchen-Bombardement und Folgebewertung von transiente Genexpression sind sehr arbeitsintensiv, wie jede Gruppe von bombardiert kaum Getreide wird von Hand in einem Mörser und Stößel homogenisiert und die Enzym-Assays werden individuell durchgeführt. Diese Handschrift berichtet eine verbesserte Protokoll, das teilweise automatisiert und rationalisiert die Homogenisierung Schritt und der GUS assays um deutlich mehr Durchsatz ermöglichen eine größere Anzahl von Behandlungen im gleichen Experiment getestet werden bei schönem und/oder die Aufnahme von mehr Wiederholungen für jede Behandlung mehr statistisch solide Ergebnisse zu erzielen. Repräsentative Ergebnisse sind für den Ausdruck von HVA1 und Amy32b Reporter Konstrukte, reguliert durch den Transkriptionsfaktor TaABF1 sowie GA, ABA und andere regulatorische Moleküle dargestellt.

Protokoll

1. Vorbereitung der Effektor und Reportergen konstruiert

1. Effektor-Konstrukte, die konstitutiven Promoter (z. B. Mais Ubiquitin, UBI) beschäftigen Laufwerk Ausdruck aus einem gewünschten offenen Leseraster zu bauen. Beispielsweise erstellen Sie ein Plasmid mit UBI::TaABF1 Antrieb stark konstitutive Ausdruck des TaABF1⁵.
2. Reporter-Konstrukte, die der Veranstalter enthalten, deren Aktivität gemessen werden, soll, zu bauen, platziert einen offenen Leserahmen, wie GUSvorgeschaltet. Beispielsweise erstellen Sie ein Plasmid mit HVA1::GUS zur Messung der Ausdruck aus der HVA1 Veranstalter^2,5.
3. Aufbau eines internen Kontrollsystems Konstrukt (z. B. UBI::Luciferase).
4. Mit einer Kieselsäure verbindlichen Spalte Protokoll (siehe Tabelle der Materialien), aller erforderlichen Genkonstrukte qualitativ hochwertige Plasmid vorbereiten. Mit UV-Spektroskopie (siehe Tabelle der Materialien), sorgfältig messen die Konzentration der einzelnen Plasmid-Vorbereitung.

2. Vorbereitung der Gerstenkörner für die Bombardierung

1. Richten Sie eine Tabellenkalkulation (siehe Abbildung 1 für ein Beispiel) unter Angabe der Plasmide, die bombardiert werden, die entsprechenden Hormonbehandlungen und andere relevante Informationen für jede Behandlung, die Teil des Experiments werden.
2. Ein Schneidebrett mit einer sterilen Rasierklinge abgeschnitten die Embryonen aus Körnern des Himalaya Gerste (40 für jede Behandlung in das Experiment einbezogen). Schließen Sie Körner aus, die verfärbten oder wesentlich kleiner als der Durchschnitt sind.
3. Legen Sie die embryoless Körner in einer 50 mL-Tube. 40 mL Wasser und Fels für 10 Minuten hinzufügen.
4. Gießen Sie das Wasser sorgfältig (um nicht zu verlieren Körner) und 40 mL 10 % Bleichmittel. Rock für 20 Minuten.
5. Gießen Sie das Bleichmittel und geben Sie 40 mL sterilem Wasser hinzu. Rock für 5 Minuten. Wiederholen Sie diese steriles Wasser waschen noch viermal.
6. 40 mL Imbibing Lösung (20 mM Natrium Succinat, 20 mM-Kalzium-Chlorid, pH 5,0) zugeben und 40 μl der Stammlösung Chloramphenicol (10 mg/mL).
7. Saugende Lösung (mit Chloramphenicol) aus der Tube in ein Vermiculit Platte übertragen (siehe Tabelle der Materialien). Übertragen Sie dann die Körner auf die Oberfläche des nassen Filterpapiers in Vermiculit Platte. Die Körner gleichmäßig verteilt. Gießen Sie in genügend saugende Lösung weiterhin die Körner teilweise (aber nicht vollständig) getaucht. Legen Sie den Deckel auf die Vermiculite-Platte.
8. Inkubieren Sie die embryoless Körner bei 24 ° C für ca. 48 h mit Leuchtstoffbeleuchtung. Fügen Sie zusätzliche Imbibing Lösung als notwendig.
9. Öffnen Sie eine 90 mm Kunststoff Petrischale und gießen Sie selbst und 20 mL in der umgekehrten Deckel 20 mL Imbibing Lösung in die Schüssel. Fügen Sie jeweils 20 μl von Chloramphenicol (10 mg/mL hinzu). Zwei Paare der feinen Spitze Zange durch Eintauchen in Alkohol zu sterilisieren.
10. Legen Sie ein paar der embryoless Körner in den Deckel der Petrischale. Entfernen Sie mit der Pinzette, vorsichtig (transparent) Samenschale aus jedem Korn. Beschädigen Sie beim Entfernen der Samenschale von der glatten Seite des Getreides nicht die darunter liegenden Zellen (Aleuronschicht). Übertragen Sie das geschälte Korn auf der Petrischale mit saugende Lösung.
11. Nach dem peeling die Samenschale aller Körner, kehren sie an die Vermiculite-Platte. 16-20 Stunden inkubieren Sie die geschälten embryoless Körner bei 24 ° C.
12. Nur vor die Körner für die Bombardierung, entfernen Sie Oberflächenfeuchtigkeit durch Schütteln sie zwischen Filterpapiere in einer Petrischale.

3. Vorbereitung der Plasmid-DNA für die Bombardierung

1. Beschriften Sie eine 1,5 mL-Tube für jede Behandlung, die in der Bombardierung Experiment aufgenommen werden. Hinzufügen jedes Rohr 2,5 µg von UBI::Luciferase interne Kontrolle Plasmid, 2,5 µg Plasmid ein GUS -Reporter und die gewünschte Menge (in der Regel 0,025 µg zu 2,5 µg) ein Effektor-Plasmid. Fügen Sie Wasser hinzu, um das Gesamtvolumen zu 5 µL zu bringen.
2. Bereiten Sie 1,6 µm gold-Microcarriers (siehe Tabelle der Materialien) Protokolle⁶veröffentlicht.
3. Fügen Sie für jede Behandlung 50 µL abgehängte Microcarriers in der 1,5 mL Tube mit Plasmid DNA hinzu. Mantel der Microcarriers mit Plasmid DNA gemäß des Herstellers Protokolle⁶.
4. Im letzten Schritt wenn Plasmid-beschichtete Microcarriers werden in 48 µL 100 % Ethanol, Pipettieren 8 μL der abgehängten Microcarriers auf jede der fünf Macrocarriers und sie an der Luft lassen trocknen.

(4) Teilchen-Bombardement von Embryoless Gerstenkörner

1. Richten Sie die Partikel Bombardement-Apparat (siehe Tabelle der Materialien)⁶.
2. Eine Berstscheibe 1550 Psi in den Sicherungsring Deckel aufgelegt und es auf dem Instrument.
3. Platzieren Sie ein Macrocarrier, enthält die gewünschte Plasmid-Kombination (zusammen mit einer Stopp-Bildschirm) in das Microcarrier Start Baugruppe. Fügen Sie die Assembly in den oberen Steckplatz der Bombardierung Kammer. Legen Sie den Abstand zwischen der Berstscheibe, Beibehaltung der GAP und der Macrocarrier Deckel im standard Abstand (6 mm), und legen Sie die anhalten-Screen-Unterstützung an der (standard) mittlere Position, so dass eine Macrocarrier-Reise-Entfernung von 11 mm (Abbildung 2A).
4. 8 embryoless Körner in einem engen radiale Muster (mit den dünneren enden nach innen zeigen) auf ein Filterpapier-Kreis, der sich flach auf den Deckel einer 90 mm Petrischale mit Klebeband ist zu vereinbaren (siehe Abb. 2 b).
5. Legen Sie die Schale mit den Körnern in die Bombardierung Kammer, in einem Abstand von 6 cm vor dem Bildschirm anhalten.
6. Evakuieren Sie die Bombardierung Kammer bis 95 kPa zu und dann bombardieren Sie die Probe.
7. Übertragen Sie nach der Veröffentlichung des Vakuums bombardiert Körner auf einer beschrifteten 60 mm Petrischale mit 4 mL Imbibing Lösung enthält 1 mg/ml Chloramphenicol.
8. Wiederholen Sie, bis alle die Bombardierungen durchgeführt wurden. 24 Stunden (auf einer schütteln Plattform bei 100 u/min) bei 24 ° C inkubieren.

(5) Extraktion von löslichen Proteinen aus bombardiert Körner

1. Mit Pinzette, einer 60 mm Petrischale 8 bombardierten Körner entnehmen und sie auf einem Papiertuch trocken tupfen. Teilen Sie die Körner in zwei beschriftete 2,0 mL Röhrchen (4 Körner pro Röhre) jeweils 800 μl Schleifen Puffer (100 mM Na-Phosphat pH 7,2, 5 mM DVB-t, 10 µg/mL Leupeptin, 20 % Glycerin) und eine 5 mm Edelstahl Perle. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle bombardiert Körner.
2. Setzen Sie die zwei Racks mit Wulst-Homogenisator (bis zu 48) 2,0 mL Röhrchen (siehe Tabelle der Materialien). Montieren Sie die Regale an den Homogenisator.
3. Schütteln Sie die Proben bei 30 Hz, für 3 Minuten.
4. Der Homogenisator entfernen Sie Homogenisatoren Racks und legen Sie sie auf dem Eis (5 min) die Proben wieder abkühlen lassen.
5. Montieren Sie die Regale zurück auf den Homogenisator - in der entgegengesetzten Richtung. Die Proben wieder bei 30 Hz 3 Minuten schütteln.
6. Wiederholen Sie die Regale auf Eis, kühlen Schritte 5,3 bis 5,5. Dies wird auf insgesamt 12 Minuten schütteln addieren.
7. Die Korn-Extrakte bei 16.000 x g bei 4 ° C für 10 Minuten zentrifugiert.
8. Sofort nach der Zentrifugation Dekantieren klares Überstände in einen zweiten Satz von Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie jedes Rohr eine schnelle Wirbel. Speichern Sie die Rohre auf dem Eis.
9. Erholen Sie nach der Übertragung des Überstands, die Stahlkügelchen aus den Pellets gewaschen und wiederverwendet werden können.

6. Messung der Luciferase Aktivität aus Korn-Extrakten

1. Für jedes Rohr von Korn-Extrakt, untersucht werden, bereiten ein 12 x 75 mm Test Glasrohr mit 200 μL der Luciferase Assay Mischung (45 mM Tris Sulfat pH 7,7, 15 mM MgCl₂, 20 mM DVB-t, 1,5 mM EDTA, 1 mM Luciferin, 1 mM ATP).
2. Der erste Test Tube 100 μL der ersten Getreide-Extrakt hinzufügen. Vortex: schnell, gut mischen. Sofort setzen Sie das Rohr in die Rohrhalter die Luminometer und schließen Sie die Tür. Wenn die Messung abgeschlossen ist, entfernen Sie das Rohr aus Luminometer – ließ die Tür offen für die Platzierung der nächsten Röhre.
3. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Proben gemessen wurden.

7. Messung des GUS-Aktivität aus Korn-Extrakten

1. Geben Sie 200 μL der GUS Testpuffer (50 mM Na-Phosphat pH 7,2, 2,5 mM 4-Methylumbelliferyl - D-Glucuronid, 10 mM DTT, 2 mM EDTA, 10 µg/mL Leupeptin, 20 % Methanol, 0,02 % Natriumazid) in jeweils einer 96-well-Platte.
2. Platz 50 μL jeder Korn-Extrakt in das entsprechende gut. Mischen Sie mit der Spitze nach dem hinzufügen. Dichten Sie oben mit Film Abdichtung ab.
3. 20 Stunden inkubieren Sie der 96-well-Platte bei 37 ° C im Dunkeln.
4. Die 96-well-Platte bei 4.000 x g bei 4 ° C für 10 Minuten Zentrifugieren und auf Eis legen.
5. Geben Sie 250 μl 0,2 M Na₂CO₃ in jeder schwarz 96-well-Platte.
6. Hinzufügen von 6,25 μL jeder zentrifugiert GUS-Assay-Mischung in das entsprechende gut (mit 0,2 M Na₂CO₃) des schwarzen 96 gut Platte. Mischen Sie mit der Spitze nach dem hinzufügen. Gehören Sie Brunnen mit 6,25 μL von 10 μm, 40 μm und 100 μm 4-Methylumbelliferone als Standards.
7. Die schwarze Platte in eine Platte Fluorometer und lesen Sie die Fluoreszenz des Methylumbelliferone zu. Nehmen Sie die Messwerte bei einer Erregung Wellenlänge von 360 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm. Die Gewinn des Instruments so eingestellt, dass ein gut mit 6,25 μL 40 μM 4-Methylumbelliferone und 250 μl 0,2 M Na₂CO₃ eine Lesung von 1000 Fluoreszenz Einheiten gibt.

8. die Datenanalyse

1. Geben Sie die Werte für die Luciferase und GUS Assays in eine Tabellenkalkulation. Ausschließen von der Betrachtung einer Probe mit einer Luciferase-Lesung von weniger als 20.000 relative Lumineszenz Einheiten s^-1, da dies zeigt, dass die Genkonstrukte nicht erfolgreich auf die Aleuronschicht Zellen geliefert wurden.
2. Für jedes erfolgreich bombardiert Korn Extrakt (als Vertreter einer Gruppe von vier embryoless Körner), den normalisierten GUS Ausdruck aus den GUS und Luciferase Rohdaten wie folgt zu berechnen: normalisiert GUS = [(Ausdruck der GUS - GUS leer) x (2.000.000)] / (Luciferase Ausdruck – Luciferase leer).
   Hinweis: Dies normalisiert sich die Menge der GUS-Aktivität, was in einem Bombardement beobachtet haben würde, die eine Luciferase-Lesung von 2.000.000 gab.
3. Bericht der relativen Ebene der Ausdruck eines bestimmten Reporter-Konstrukts in Anwesenheit von Effektor Konstrukte oder Hormonbehandlungen von im Vergleich zu der Ebene des Ausdrucks in der Abwesenheit von Effektoren oder Hormone getestet.

Ergebnisse

Die hier beschriebene Technik kann verwendet werden, jeder Test Genkonstrukt in Aleuronschicht Zellen der Gerstenkörner einzuführen. Dann kann die Ebene des Ausdrucks aus dem Test-gen bequem gemessen (Abbildung 2). Die höheren Durchsatz Protokoll hier beschriebenen stark erhöht die Effizienz der Samen Schleifen und Enzym-Assay-Schritte. Diese Methode wurde zur Beurteilung der Fähigkeit der Transkription Faktor TaABF1^5,<...

Diskussion

Die Einführung der Effektor gen konstruiert über Teilchen-Bombardement, gefolgt von transienten Expression Reporter Konstrukte ist eine sinnvolle Strategie für die Rolle von bestimmten Akteuren in GA/ABA Signalisierung und das daraus resultierende Hormon reguliert gen sezieren Ausdruck.
Allerdings sind die vorhandenen Protokolle für solche Experimente in Gerste Aleuronschicht Zellen^2,3,4,5

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
GeneElute HP plasmid Maxiprep kit	Sigma	NA0310-1KT
UV-vis spectrophotometer	Nanodrop	ND-1000
Himalaya barley grains	/	/	A variety of hulless barley (store in the dark at 4° C)
sodium succinate	Sigma	S2378	Reagent for Imbibing Solution
calcium chloride (dihydrate)	Fisher	C79-500	Reagent for Imbibing Solution
Imbibing Solution	home made	/	20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use.
chloramphenicol	Sigma	C0378	Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol.
vermiculite	Fisher	NC0430369	Used for vermiculite plates.
filter paper circles (90 mm)	Whatman	1001 090	Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation
Vermiculite Plates	home made	/	Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave.
forceps (fine pointed)	Fisher	13-812-42	Used for removing seed coat from barley grains.
forceps (ultra fine point)	Fisher	12-000-122	Used for removing seed coat from barley grains.
gold microcarriers (1.6 μm)	BioRad	1652264
macrocarriers	BioRad	1652335
calcium chloride (dihydrate)	Fisher	C79-500	Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
spermidine	Sigma	S0266	Prepare a 100 mM stock solution and store 500 μL aliquots at -20° C (use within 2 months).
rupture discs (1550 psi)	BioRad	1652331
stopping screens	BioRad	1652336
macrocarrier holders	BioRad	1652322
Biolistic particle delivery system	BioRad	PDS-1000/He
sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma	S9638	Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
sodium phosphate dibasic	Sigma	S9763	Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2
1M sodium phosphate pH 7.2	home made	/	Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2.
dithiothrietol (DTT)	Sigma	43819	Dissolve in water to 1 M. Store at -20° in 1 mL aliquots.
leupeptin	Sigma	L2884	Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20° C.
glycerol	Sigma	G5516	Prepare a 50% solution in water.
Grinding Buffer	home made	/	Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 μL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL.
stainlesss steel beads (5 mm)	Qiagen	69989
2.0 mL tubes	Eppendorf	22363352	This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer.
bead homogenizer (TissueLyser)	Qiagen	85210
12mm x 75 mm glass test tubes	Fisher
luciferin	Goldbio	LUCK-100	Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20° C.
ATP	Sigma	A7699	Prepare a 100 mM stock solution and store 250 μL aliquots at -20° C.
Tris base	Sigma	T1503	Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
sulfuric acid	Sigma	258105	Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.
1M Tris sulfate pH 7.7	home made	/	Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid.
magnesium chloride	Sigma	M9397	Dissolve in water to 2 M.
Luciferase Assay Buffer (LAB)	home made	/	Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 μL of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 μL of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL.
Luciferase Assay Mixture	home made	/	Combine 15 mL of LAB, 800 μL of 25 mM luciferin, 200 μL of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays.
luminometer (Sirius)	Berthold	/
4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG)	Goldbio	MUG1	Dissolve in DMSO to 100 mM.
sodium azide	Sigma	S8032	Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20° C.
96 well plates (standard)	Fisher	12565501
GUS assay buffer	home made	/	Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 μL of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 μL of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL.
TempPlate sealing film	USA Scientific	2921-1000
96 well plates (black)	Costar	3916
sodium carbonate	Sigma	S7795	Prepare a 200 mM solution in water.
4-methylumbelliferone	Sigma	M1381	Prepare a 100 μM solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20° C.
microplate fluouresence reader	Bio-Tek	FLX-800