Eine effiziente In-vitro- Umsetzung-Methode durch eine Transcriptionally geregelten Schönheit Schlafsystem verpackt in eine Integration defekt Lentivirale Vektor

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um stabile Integration eines Gens von Interesse des menschlichen Genoms durch das transcriptionally regulierte Dornröschen -System zu erreichen. Vorbereitung der Integration von defekten Lentivirale Vektoren, die in-vitro- Transduktion von menschlichen Zellen und molekulare Tests auf Zellen ausgestrahlt werden gemeldet.

Zusammenfassung

Das Transposon Sleeping Beauty (SB) ist ein nicht-viralen Integration System mit nachgewiesener Wirksamkeit für Gentransfer und funktionelle Genomik. Um die SB-Transposon-Maschinen zu optimieren, sind ein transcriptionally geregelten hyperaktiv Transposase (SB100X) und T2-basierte Transposon beschäftigt. In der Regel werden die Transposase und Transposons vorübergehend von Plasmid Transfektion und SB100X Ausdruck wird angetrieben von einem konstitutiven Promoter. Hier beschreiben wir eine effiziente Methode um die SB-Komponenten an menschliche Zellen zu liefern, resistent gegen verschiedene physikalische und chemische Transfektion Methoden, SB100X Ausdruck zu steuern und stabil integrieren ein Gen des Interesses (GOI) durch eine "Ausschneiden und einfügen" SB Mechanismus. Der Ausdruck der hyperaktive Transposase wird durch das Tet-ON-System, häufig verwendet, um die Genexpression seit 1992 kontrollieren streng kontrolliert. Das gen des Interesses wird von invertierte Wiederholungen (IR) der T2 Transposons flankiert. Beide SB-Komponenten werden bei der Integration verpackt defektive Lentivirale Vektoren vorübergehend in HEK293T Zellen hergestellt. Menschliche Zellen, Zell-Linien oder primäre Zellen aus menschlichen Gewebe sind in-vitro- vorübergehend mit viralen Vektoren ausgestrahlt. Nach Zugabe von Doxycyclin (Dox, Tetracyclin analog) in das Kulturmedium eine Feinabstimmung der Transposase Ausdruck wird gemessen und ergibt eine dauerhafte Integration der das gen des Interesses in das Genom der behandelten Zellen. Diese Methode ist effizient und für die Zell-Linie (z. B. HeLa-Zellen) und primäre Zellen (z. B. menschliche primären Keratinozyten) und stellt somit ein wertvolles Werkzeug für Gentechnik und therapeutischer Gentransfer.

Einleitung

Die hyperaktiven SB100X Transposase gekoppelt an das T2-basierte Transposon wurde bereits in präklinischen Gen Therapie Anwendungen^1,2,3, Genom Änderungen^4,5, verwendet und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) Neuprogrammierung^6,7. In der Regel werden die SB-Komponenten vorübergehend von Plasmid Transfektion und starken konstitutiven Promoter treibt den Ausdruck der Transposase. Dennoch, trotz der verbesserten neuen Methoden der Transfektion Lieferung von zwei-Komponenten-System bleibt eine Herausforderung für viele Anwendungen. So hat die Entwicklung einer neuen Übermittlungsprotokoll zunehmendes Interesse. Neben Transfektion Methoden für Plasmid⁸ und mRNA⁹virale Lieferung basierend auf adenoviralen^10,11, Adeno-assoziierten Viren (AAV)¹², Baculovirus¹³gammaretroviralen¹⁴ und Lentivirale Vektoren¹⁵ hat in der Vergangenheit vorgeschlagen worden. Vor allem muss das System der Wahl eine vorübergehende Lieferung der SB-Komponenten ohne Integration des viralen Vektors garantieren. Dennoch wirft die konstitutive Expression von Transposase Sicherheitsbedenken wegen des Risikos einer unkontrollierbaren rehopping der das Transposon.

Transcriptional Regelung des SB100X durch ein raffiniertes Tet-ON-System ist daher die erste Herausforderung. Modifizierte Tet eine geschlechtergerechte Förderer, erreicht durch Ersetzen des original entwickelten minimal Cytomegalovirus (CMV) Projektträgers mit dem minimalen Promotor (-81) des Gens Timidine Kinase (TK) von Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1)¹⁶, geklont stromaufwärts von der SB100X cDNA (pTetOTKSB100X). Die mutierten Reverse-Tetracyclin-Transaktivator rtTA2^s-M2¹⁷ drückt sich unter der Kontrolle von der starken konstitutiven Promoter (Phosphoglycerate Promotor, PGK) geklont in verschiedenen Plasmid (pCCL-PGKrtTA2^S-M2). Wenn das Kulturmedium hinzugefügt, Dox bindet die rtTA2^s-M2-Modulator und Leinen der Tet-Promoter komplexe oder daraus resultierenden in streng regulierten Induktion der SB100X Ausdruck¹⁸.

Die zweite große Herausforderung ergibt sich aus der ineffizienten Transfektion von menschlichen Primärzellen durch verschiedene physikalische und chemische Methoden. Um effizient Transposase in menschlichen Zellen resistent gegen Transfektion, die SB100X und die rtTA2^sliefern-M2 Expressionskassetten sind verpackt in zwei Integration defekt Lentivirale Vektoren (IDLVs)¹⁹: IDLVTKSB und IDLVrtTA2^s- M2. Virale Vektoren werden vorübergehend als dritte Generation Vektoren in HEK293T Zellen²⁰ und mit dem Glykoprotein G von vesikulärer Stomatitis Virus (VSV-G), die ein breites Spektrum an Infektion verleiht pseudotyped produziert. Vektor-Partikel sind durch Ultrazentrifugation konzentriert und von HIV-1 Gag p24 Immunocapture titriert. Um Zelllinien und Primärzellen transduzieren, Vektor-Partikel sind komplexiert mit Polybrene und mit Zielzellen in das Vorhandensein oder Fehlen von Dox inkubiert werden. Drogen-abhängige Aktivierung der SB100X Ausdruck in Zellen ausgestrahlt wird durch quantitative RT-PCR (qRT-PCR)¹⁸gemessen.

Tet-regulierten SB100X Ausdruck nachgewiesen wird, folgt Umsetzung der indischen Regierung (z. B. grün fluoreszierendes Protein, GFP) in die Ziel-Zelle-Genom der molekularen Ereignisse deutlich von Bak und Mikkelsen²¹schematisiert. Eine dritte IDLV Vektor-Ausführung hat eine Expressionskassette für die indische Regierung zwischen der T2-Transposon-IRs (IDLVT2) geklont zu konstruiert und verpackt, wie oben erwähnt werden. Die drei IDLV Vektoren ist zu guter Letzt lässt sich effizient transduzieren menschliche Zellen (z. B. primären Keratinozyten) in Vitro und integrieren die indische Regierung im Beisein von Doxycyclin¹⁸.

Protokoll

(1) Plasmide eingesetzt

Hinweis: Plasmid pCCL-PGKrtTA2^S-M2 wurde freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Zappavigna (Universität von Modena und Reggio Emilia, Modena, Italien). Die pCMVSB100X Plasmid trägt die kodierende Sequenz des hyperaktiven Transposase und pT2/BH Transposon Plasmid wurden freundlicherweise von Prof. Z. Ivics (Paul-Ehrlich-Institut, Langen, Deutschland) und Prof. Z. Izvak (Max-Delbruck-Centrum für Molekularmedizin, Berlin, (Deutschland).

1. Folgen Sie für alle Klonen in Escherichia Coli (E. Coli) die Klonen Strategie der Wahl und Restriktionsenzym Verfahren oder PCR-Amplifikation des Fragments geklont werden.
   Hinweis: Tabelle 1 enthält eine Zusammenfassung aller Plasmide, die in diesem Protokoll eingesetzt. Eine Beschreibung und Referenzen für jedes Plasmid sind vorhanden.

(2) viralen Vektoren Produktion

Hinweis: Die virale Vektoren werden in ein Biohazard-Haube auf einer BSL2 Biosafety Aufhaltestufe nach institutionellen Regeln und Vorschriften produziert.

1. Kultur anhaftende HEK293T Zellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium ergänzt mit 10 % HyClone Serum, 100 U/mL Penicillin-Streptomycin und 2 mM Glutamin.
2. Tag 0: Bereiten Sie fünf 15 cm Platten/virale Vorbereitung und 5.5x10⁶ Samenzellen in 30 mL des Mediums.
3. Tag 1: Transfektion
   1. Bereiten Sie vor Beginn der Transfektion, 100 mL 2 X HEPES Puffer Kochsalzlösung (HBS):
      NaCl (5 M) 5,6 mL
      HEPES (1 M) 10,0 mL
      Na₂HPO₄ (0,5 M) 0,3 mL
      Steriles Wasser 84,1 mL
      Passen Sie auf pH 7.1 mit 37 % HCl.
      Hinweis: 2 X HBS kann bei 4 ° c aufbewahrt werden Ein genaue pH ist extrem wichtig für effiziente Transfektion. Der optimale pH-Bereich ist 7.10 um 7.12.
   2. Medium zu entfernen und Hinzufügen von 22,5 mL/Teller mit frischen mittlere 4 h vor Transfektion.
   3. Transfizieren Sie HEK293T Zellen mit Transfer-Plasmid, das Plasmid pMD.Lg/pRRE.D64VInt Verpackung und pMD2.G Umschlag-Codierung Plasmid pRSV-Rev (Tabelle 1) entsprechend den folgenden Betrag/Platte:
      Plasmid 25,00 µg zu übertragen
      pMD.Lg/pRRE.D64VInt 16.25 µg
      pMD2.G 8,75 µg
      pRSV-Rev 6,25 µg
      Hinweis: Plasmid DNA sind nach dem CsCl-Protokoll beschrieben durch Maniatis²² oder über ein Endotoxin-freie Plasmid-Reinigung-Kit bereit.
      1. 56,25 µg DNA (Mischung aus 4 Plasmide) in 1,125 mL sterilem Wasser Aufschwemmen und 125 µL 2,5 M CaCl₂ (Lösung A) hinzufügen.
      2. Eine sterile 15 mL konische Zentrifugenröhrchen (Lösung B) 1,250 mL 2 X HBS hinzufügen.
      3. Lösung hinzufügen (1,250 mL) nach B (1,250 mL) tropfenweise während sprudelt mit einer 1 oder 2 mL Pipette (Transfektion Lösung, Gesamtvolumen 2,500 mL).
      4. 20 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
      5. Mit einer Mikropipette P1000, verteilen Sie die Transfektion Lösung (2,500 mL) für die Zelle Monolage tropfenweise.
   4. Brüten Sie über Nacht in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO₂.
4. Tag 2: Entfernen Sie das Medium und 15 mL frisches Medium (siehe Punkt 2.1).
5. Tag 3: Sammeln und den Lentivirale Partikel-haltigen überstand zu konzentrieren.
   1. Sammeln Sie überstand (~ 70 mL) von allen (n = 5) transfizierten Zellplatten Filtern durch einen 0,45 µm PESS filtern und füllen 2 Polyallomer Röhren (1 Zoll x 3,5 Zoll) / virale Vorbereitung.
   2. Die Vektor-Partikel durch Ultrazentrifugation bei 106.000 x g 2,5 h bei 15 ° C mit Bremse zu konzentrieren.
   3. Sofort nach dem Absetzen der Ultrazentrifugation (um Wiederfreisetzung des Geschosses im Rohr zu vermeiden), vorsichtig gießen Überstand in einen Behälter mit 10 % Bleichmittel und unterbrechen die 2 kaum sichtbare Pellets in 100 µL 1 X PBS (+ 1 % BSA). Dies ist normal, da die Pellets klar und sehr klein ist. Verwenden Sie den konzentrierten Vektor frisch zubereitete oder Aliquote und speichern Sie virale Vorbereitungen bei-80 ° C.
      Vorsicht: Der Überstand enthält Lentivirale Partikel, die gründlich vor dem Ablegen im Biohazard Abfall gebleicht werden müssen.
6. Um die Vorbereitung von viralen Vektoren zu titrieren, verwenden Sie eine Gag von HIV-1-p24 Immunocapture Kit laut Protokoll des Herstellers.
   Hinweis: Um die Produktion von viralen Vektoren zu standardisieren, konnte Liposomen-basiertes Reagenzien eingesetzt werden. Der viralen Vektoren-Titer ist jedoch stark abhängig von der Transfektion Effizienz und Reinheit der Plasmid DNA.

(3) Transduktion von humanen Zelllinien (z. B. HeLa-Zellen)

Hinweis: HeLa-Zellen sind in Dulbeccos modifizierten Eagle Medium ergänzt mit 10 % fetalen Kälberserum, 100 U/mL Penicillin-Streptomycin und 2 mM Glutamin kultiviert. Tabelle 1 fasst alle Vektoren, die in diesem Protokoll eingesetzt. Eine Beschreibung für jeden Vektor. Transduktion von HeLa-Zellen ermöglicht die Überprüfung der transcriptional Regelung des SB Transposase in die beste Dosis Kombination der beiden IDLV Vektoren. Variation von IDLV Dosen kann beziehen sich auf Partikel Titration und Zelle Zieltyp Vektor.

1. Tag 0: 2 x 10⁵ Samenzellen in 3 mL Medium für jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Bereiten Sie 4 Brunnen.
2. Tag 1: Transduktion von HeLa-Zellen.
   1. Für jede Bedingung verdünnen Lentivirale Vektoren zu einem Endvolumen von 1 mL Medium (siehe Hinweis oben) in Anwesenheit von 10 μL des Polybrene (Endkonzentration 8 μg/mL):
      Verdünnung für gut #1: ausgestrahlt Zellen (Negativkontrolle) zu verspotten.
      Verdünnung für gut #2: IDLVTKSB-Vektor (2.600 ng von p24).
      Verdünnung für Brunnen #3, #4: IDLVTKSB-Vektor (2.600 ng von p24) + IDLVrtTA2^s-M2-Vektor (9.600 ng von p24).
   2. Entfernen Sie das Medium aus jedem Brunnen wo HeLa-Zellen am Tag 0 überzogen waren und fügen Sie Lentivirale Vektor Verdünnungen hinzu, die entsprechend gut.
   3. Spinoculate 6-Well-Platte bei 754 X g für 45 min bei 20-25 ° C, und übertragen Sie dann die 6-Well-Platte in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO₂.
   4. Nach 6 h 1 μM gut #4 Fügen Sie Doxycyclin hinzu und ersetzen Sie die mittlere mit Vektoren durch frisches Medium in alle Wells. Legen Sie die Platte in eine Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C für 48 h.
3. Tag 3: Vorbereitung der Zelle Pellet für RNA-Extraktion.
   1. Vor dem Abnehmen der Zellen, bereiten Sie eine Trypsin Funktionslösung (1 X):
      2,5 % Trypsin (10 X) 5,0 mL
      500 mM EDTA (Endkonzentration = 5 mM) 0,5 mL
      1 x mL PBS 44,5
   2. Warmen Trypsin funktionierende Lösung bei 37 ° C vor dem Gebrauch. Trypsin funktionierende Lösung bei 4 ° c lagern
   3. Entfernen Sie Medium zu und waschen Sie Zellen mit 1 X PBS. Hinzufügen von 0,5 mL vorgewärmten 37 ° C Trypsin Arbeitslösung in jede Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C für 7 min. (in einer Zelle Kultur Inkubator).
   4. Nach der Inkubation hinzufügen 0,5 mL Serum-haltige Mittel in jede Vertiefung, Trypsin und sammeln Zellen in ein Zentrifugenröhrchen zu inaktivieren. Spülen Sie gut einmal mit 3 mL 1 X PBS und Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 5 min bei 240 X g.
   5. Zellen mit 5 mL 1 X PBS, Zentrifuge für 5 min bei 240 X g waschen und überstand verwerfen. Benutzen Sie frisch gesammelten Zelle Pellets oder lagern Sie bei-80 ° C. Extrahieren von Gesamt-RNS von Pellets, semi-quantitativen RT-PCR durchzuführen (siehe Schritt 6).

(4) Transduktion von menschlichen Primärzellen (z. B. Keratinozyten)

Hinweis: Menschliche primären Keratinozyten sind auf letal bestrahlten 3 t 3-J2 Zellen (Feeder Layer)²³, eine Art Geschenk von Yan Barrandon (EPFL, Lausanne, Schweiz) ausgesät.

1. Wachsen Sie Schweizer 3 t 3-J2 Mauszellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium mit 10 % Spender Rinderserum, 50 U/mL Penicillin-Streptomycin und 4 mM Glutamin (3 t 3 Medium) ergänzt.
2. Wachsen Sie Keratinozyten auf letal bestrahlten 3 t 3-J2 Zellen in cFAD Mittel, eine Dulbecco geändert Eagle Medium und Hams F12 Medien Mischung (3:1) mit fötalen Rinderserum (10 %), Penicillin-Streptomycin (1 %), Glutamin (2 %), Insulin (5 µg/mL), Adenin (vernickelt 0,18 mM), Hydrocortison (0,4 µg/mL), Cholera-Toxin (0,1 nM), und Trijodthyronins (2 nM).
3. Tag 0: 3 x 10 Samen⁵ bestrahlt tödlich 3 t 3-J2 Zellen, zuvor verdünnt in 3 t 3 Medium, eine Endkonzentration von 1 X 10⁵ Zellen/mL, in jede Vertiefung des 6-Well-Platte. Bereiten Sie 9 Brunnen.
4. Tag 1: Transduktion von primären Keratinozyten
   Hinweis: Transduktion von Keratinozyten erlaubt Quantifizierung der transcriptional Regelung des SB Transposase in die beste Dosis Kombination der beiden IDLV Vektoren (durch qRT-PCR) und die Integration von GOI (GFP) in den Zielzellen (Cytofluorimetric überprüfen -Analyse).
   1. Vor dem Abnehmen der Zellen, bereiten Sie die Trypsin-Arbeitslösung:
      0,5 % Trypsin-EDTA (10 X) 5,0 mL
      500mM EDTA (Endkonzentration = 5 mM) 0,5 mL
      1 x mL PBS 44,5
   2. Warmen Trypsin funktionierende Lösung bei 37 ° C vor dem Gebrauch. Trypsin funktionierende Lösung bei 4 ° c lagern
   3. Zum Lösen von subconfluent Keratinozyten in Kultur Medium zu entfernen, Zellen mit 1 X PBS waschen und 1 mL vorgewärmten Trypsin Arbeitslösung in jede Vertiefung. Inkubation bei 37 ° C für 15 min in der Zelle-Kultur-Inkubator.
   4. Nach der Inkubation der Zellen eines Brunnens Aufschwemmen gründlich und übertragen die Zellsuspension auf eine Zentrifugenröhrchen mit 2 mL Serum-haltigen Medium (wenn viele Zellen noch hängen, für eine zusätzliche Minuten bei 37 ° C inkubieren). Spülen Sie gut einmal mit 3 mL 1 x PBS oder frisches Medium und Zentrifugenröhrchen mit der Zellsuspension fügen Sie die Spüllösung hinzu.
   5. Für 5 min bei 580 X g Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
   6. Zellen mit 5 mL 1 X PBS, Zentrifuge für 5 min bei 580 X g waschen und entsorgen des Überstands.
   7. Verdünnen Sie in einem 15-mL-Polypropylen-Rohr 1.6x10⁵ Keratinozyten in 1 mL cFAD Medium, eine Verdünnung für jede Bedingung.
   8. Verdünnen Sie Lentivirale Vektoren in 1 mL cFAD Medium in Anwesenheit von 20 μl des Polybrene (Endkonzentration von 8 µg/mL bei einem Endvolumen von 2 mL):
      Verdünnungen für Brunnen #1, #2, #3: ausgestrahlt Zellen (negative Kontrolle ohne Vektoren) zu verspotten.
      Verdünnungen für Brunnen #4, #5: IDLVTKSB-Vektor (13.000 ng von p24) + IDLVrtTA2^s-M2-Vektor (48.000 ng von p24).
      Verdünnungen für Brunnen #6, #7, #8, #9: IDLVTKSB Vektor (13.000 ng von p24) + IDLVrtTA2^s-M2-Vektor (48.000 ng von p24) + IDLVT2-Vektor (9.160 ng von p24).
   9. Transduzieren Sie Zellen in Suspension durch Zugabe von jeder Lentivirale Vektor-Verdünnung (1 mL) zu den entsprechenden Keratinozyten Suspension (1.6x10⁵ Keratinozyten in 1 mL).
   10. Entfernen Sie das Medium aus 3 t 3-J2 letal bestrahlten Zellen ausgesät am Tag 0 und Platte ausgestrahlt Keratinozyten (1.6x10⁵ Keratinozyten in 2 mL) auf sie. Nach transducing eine gut fahren Sie mit dem nächsten.
   11. Bei 25 ° C für 30 min inkubieren Sie, und übertragen Sie dann die Zellen auf 37 ° C in der Zelle-Kultur-Brutkasten für 6 h.
       Hinweis: Nicht Spinoculate primären Keratinozyten, Rentabilität und Verbreitung stark beeinflusst werden.
   12. Fügen Sie nach 6 h 1 mL cFAD Medium in jede Vertiefung. Fügen Sie 1 μM Doxycyclin (Endkonzentration) in Brunnen #5, #8 und #9. Rückkehr von Zellen auf 37 ° C.
5. Tag 2: Ersetzen Sie cFAD Medium mit 3 mL KC Medium mit 10 ng/mL EGF.
6. Tag 3: Trypsinize und waschen Sie Zellen aus Brunnen #1, #4 und #5 wie beschrieben vor (siehe 4.4.1, 4.4.6). Einfrieren der Zelle Pellets bei-80 ° C, total RNA zur qRT-PCR-Analyse zu extrahieren (siehe Schritt 7).
7. Trypsinize Zellen aus gut #2, #6 und #8 wie 4.4.1 zu 4.4.5 beschrieben und Cytofluorimetric Analysen für die GFP Expression durchführen (siehe Schritt 5).
8. Halten Sie die Kultur von Brunnen #3, #7 und #9 für mindestens 3-4 Verdoppelungen, ausreichen, um un-integrierte IDLVT2-Vektor (5 Tage für menschliche primären Keratinozyten auf Feeder Schicht überzogen) verdünnen.
9. 6. Tag: Ca. 5 Tage post Transduktion, trypsinize Zellen (siehe Schritte 4.4.1 zu 4.4.5) aus Brunnen #3, #7 und #9 Cytofluorimetric Analyse für die GFP Expression durchführen (siehe Schritt 5).
   Hinweis: Experiment Timing und Transduktion Effizienz sind stark beeinflusst, nach Primärzelle und Variabilität der gesammelten Proben.

(5) Cytofluorimetric Analyse der primären Keratinozyten ausgestrahlt

Hinweis: Ein Durchflusszytometer konfiguriert mit einem blauen Laser (488 nm), ein roter Laser (633 nm) und Filter für die Erkennung der GFP und APC Fluoreszenz eingesetzt wird (siehe Materialtabelle).

1. Um die Keratinozyten aus 3 t 3-J2 Feeder Layer diskriminieren, Label ausgestrahlt Keratinozyten freistehend an Tag 3 und Tag 6 (siehe Schritte 4,7 und 4,9) mit Maus monoklonalen APC-konjugierten Anti-Feeder-Antikörper.
   1. Bereiten Sie 4 mL Puffer für jede Probe Beizen:
      5 % FBS 200 ΜL
      500 mM EDTA (Endkonzentration = 2,5 mM) 20 μL
      PBS 1 x 3780 μL
   2. Waschen Sie freistehende Zellen mit 1 mL Puffer Färbung. Für 5 min bei 580 X g Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
   3. Aufschwemmen Sie in einem Rohr für Flow Cytometry Erwerb 5 x 10⁴ Zellen in 100 μL der Färbung Puffer und fügen Sie 2 μL des Antikörpers Anti-Feeder (01:50). Gut mischen und 30 min auf Eis im Dunkeln inkubieren.
   4. Waschen Sie nach 30 min mit 2 mL Puffer Färbung. Für 5 min bei 580 X g Zentrifugieren und den Überstand verwerfen. In 200 μl der Färbung Puffer aufzuwirbeln.
   5. Erwerben Sie APC und GFP-Signale durch Cytofluorimetric Analyse¹⁸. Die GFP⁺ Zelle Bruchteil der APC^– -Zell-Population zeigt ausgestrahlt Keratinozyten.
      Hinweis: Falls gewünscht, beheben die gefärbte Probe vor Durchflusszytometrie mit 2 % Paraformaldehyd in PBS 1 X und Store bei 4 ° C im Dunkeln bis der Flucht.
2. Flow Cytometry Daten analysieren, indem Sie das Verhältnis zwischen dem Anteil der GFP⁺PlottenZellen an den Endpunkt (5 Tage) und der Prozentsatz der GFP⁺Zellen 2 Tage post Transduktion, normiert auf Restniveau von den IDLVT2 ausgestrahlt Zellen.

(6) semi-quantitativen RT-PCR

Hinweis: Verwenden Sie ein PCR-Thermocycler.

1. Extrahieren Sie Gesamt RNA aus ausgestrahlt oder Zellen mit einer RNA-Reinigung-Kit laut Protokoll des Herstellers zu kontrollieren.
   Hinweis: Gesamt-RNS kann bei-80 ° c aufbewahrt werden
2. Synthetisieren cDNA in einer 20 µL Reaktion mit 100 ng Gesamt-RNS und ein Reverse-Transkriptase-Kit, laut Protokoll des Herstellers.
   Hinweis: cDNA kann bei-20 ° c aufbewahrt werden
3. Design Primer spezifisch für SB100X, rtTA2^s-M2 und GAPDH (ein Zimmermädchen-gen).
   Vorgeschlagene Designs:
   SB nach vorne Grundierung: 5'-GCCACTCAGCAAGGAAGAAG-3 "
   SB reverse Primer: 5'-GTGTTGGAAGACCCATTTGC-3 "
   rtTAM2 forward Primer: 5'- GACGACAAGGAAACTCGCTC-3 "
   rtTAM2 reverse Primer: 5'-TTACCCGGGAGCATGTCAA-3 "
   GAPDH forward Primer: 5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3 "
   GAPDH reverse Primer: 5'–CCACCACCCTGTTGCTGTAG–3'
4. Führen Sie PCR in eine endgültige Reaktionsvolumen von 50 µL. Vor allem in jedem PCR-Röhrchen montieren Sie die folgende Reaktion:
   cDNA (Verdünnung 1:5) (aus Schritt 6.2) 1,00 µL
   Grundierung (10 µM bestand) weiterleiten 1,00 µL
   Reverse Primer (10 µM bestand) 1,00 µL
   dNTPs (10 µM bestand) 1,00 µL
   Puffer (+ MgCl₂) (10 X verfügbar) 5,00 µL
   Taq Polymerase (5 U/µL bestand) 0,25 µL
   Steriles Wasser 40,75 µL
5. Verwenden Sie das folgende Programm der Thermocycler: 1 Zyklus bei 95 ° C für 5 min dann fortfahren mit 95 ° C für 30 s, 58 ° C für 30 s und 72 ° C für 30 s für 34 Zyklen für SB100X, 32 Zyklen für rtTA2^s-M2 , und 25 Zyklen für GAPDH.
6. Bereiten Sie 1 % Agarose-Gel. Lösen Sie 1 g Agarose in 100 mL TBE 1 x (10 X bestand in sterilem Wasser verdünnt), in einem Becher oder einer Flasche. Schmelzen Sie in der Mikrowelle, wirbeln jede Minute bis die Agarose komplett aufgelöst ist. Lassen Sie die geschmolzene Agarose abkühlen, bis es etwa 50 ° C erreicht, und fügen Sie 5 µL Interkalation Bromid (10 mg/mL Brühe). Gießen Sie geschmolzene Agarose in einem montierten Gel Tablett mit einem Kamm für Gelgießen.
7. Laden Sie Proben (10 µL) auf das Agarosegel und durchführen Sie Elektrophorese.
8. Falls gewünscht, Gel Bild zu erwerben und densitometrische Analysen auf den Bändern PCR durchführen.

(7) Quantitative RT-PCR (qRT-PCR)

Hinweis: Ein kommerzieller Sequence Detection System wird eingesetzt. PCR-Primer und 6-Carboxyfluorescein (FAM) Sonde für Glyceraldehyde-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) sind im Handel erworben.

1. Für Retro-Transkription siehe Punkt 6.2.
2. Verwenden Sie Software, um design-Primer und Sonde für SB100X bestimmten.
   Vorgeschlagenen Entwurf:
   SB.2 forward Primer: 5'-GAAGAAGCCACTGCTCCAAAA-3 ",
   SB.2 reverse Primer: 5'-CCCCATGTGCAGTTGCAA-3 "
   Sonde SB FAM: 5'-CATAAGAAAGCCAGACTACGG-3 "
3. Real-Time PCR in 96-Well-Platten mit einer PCR-Master-Mix und Grundierungen + Sonde mischen, in eine endgültige Reaktionsvolumen von 25 µL. Beachten Sie insbesondere die folgende Reaktion für jedes gut:
   cDNA (01:10 Verdünnung in sterilem Wasser) 1,00 µL
   2 x Master Mix 12,50 µL
   Primer + 20 X Sonde mischen 1,25 µL
   Steriles Wasser 10,25 µL
   Hinweis: Führen Sie alle Reaktionen in dreifacher Ausfertigung. Um Pipettieren Fehler zu vermeiden, bereiten Sie eine Mischung für mindestens n + 3 Reaktionen (ohne cDNA). Aliquoten mit einer Mehrkanal-Pipette.
4. Real-Time PCR mit dem folgenden Programm ausführen: 1 Zyklus bei 95 ° C für 10 min, dann 40 Zyklen von 95 ° C für 15 s und 60 ° C für 1 min und Halt bei 4 ° C.
5. Analysieren Sie qRT-PCR-Daten durch die Normalisierung des relativen Ausdrucks (RQ-Wert) des SB100X auf das Niveau von GAPDH der gleichen DNA Probe von 2^–ΔΔCT Quantifizierung, mit typischen Daten-Analyse-Software.

Ergebnisse

Mit dem Verfahren präsentiert hier drei IDLV Vektoren tragen die regulierten SB-Komponenten (SB100X, rtTA2^S-M2 und T2-GFP Transposon) wurden verpackt und verwendet, um effizient und straff regulieren das SB-System in den menschlichen Zellen. Abbildung 1A zeigt ein Schema für in-vitro- Transduktion von HeLa-Zellen, die durchgeführt wurde, die transkriptionelle Regulierung der SB Transposase mit die beste Dosis Kombination der beiden IDLV...

Diskussion

Hier beschreiben wir eine allgemein zugängliche Methodik ein GOI stabil in das Genom der Zielzellen von Dornröschenzu integrieren-Umsetzung vermittelt. Obwohl das SB-System entwickelt wurde, um ein nonviral Verfahren für die Bearbeitung von Genom zu schaffen, ist die effiziente Bereitstellung der Integration Maschinen (Transposase und T2 Transposon) obligatorisch. Daher wurde eine virale Lieferung von SB-Komponenten um das SB-System auf kaum transfectable Primärzellen verwenden, in den letzten Jahren

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine	Lonza	BE12-614F	Cell culture medium.
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03	Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production.
Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml	Lonza	DE17-602E	Reagents for cell culture medium.
L-Glutamine 200mM	Lonza	BE17-605E	Reagent for cell culture medium.
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Reagent for HBS 2X preparation.
HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline	Lonza	BE17-737E	Reagent for HBS 2X preparation.
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5%	Merck	106580	Reagent for HBS 2X preparation.
Hydrochloric acid - ACS reagent 37% (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Reagent for HBS 2X preparation.
Sterile water for injection	Fresenius Kabi	-	Reagent for HBS 2X preparation.
0.45 µm PESS filter	Whatman	10462100	Filters used to remove cell debris from viral supernatant.
Polyallomer Beckman tubes	Beckman Coulter	326823	Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation.
PBS-1X w/o Ca, Mg	Lonza	BE17-516F	Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	(Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension.
HIV-1 Gag p24 immunocapture kit	Perkin Elmer	NEK50001KT	Kit for IDLV particle titration.
Polybrene	Sigma-Aldrich	107689	Reagent to enhance transduction efficiency.
Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg	GIBCO	BE17-160E	Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted).
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)	100938B	AnalaR BDH	Reagent for trypsin working solution preparation.
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X)	GIBCO	15400-054	Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted).
Donor Bovine Serum, New Zealand Origin	GIBCO	16030-074	Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer).
Ham’s F12 media	GIBCO	21765	Medium for keratinocytes.
Fetal bovine serum	Lonza	DE14-801F	Serum for HeLa cell culture medium.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin	GIBCO	10099-141	Serum for human primary keratinocyte culture medium.
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I5500	Reagents for keratinocyte growth.
Adenine	VWR	1152-25	Reagents for keratinocyte growth.
Hydrocortisone	VWR	3867-1	Reagents for keratinocyte growth.
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Reagents for keratinocyte growth.
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T5516	Reagents for keratinocyte growth.
Human EGF	Austral Biological	GF-010-9	Reagents for keratinocyte growth.
Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody	Miltenyi Biotech	130-096-099	To label feeder layer.
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	RNA purification kit.
SuperScript III Reverse Transcriptase	Life Technologies	18080051	Reverse transcriptase kit.
Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP)	Sigma-Aldrich	D7295	Reagent for semi-quantitative PCR.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	(any)	-	Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR.
GoTaq G2 Hot Start Polymerase	Promega	M740B	Taq polymerase.
Agarose, for molecular biology	Sigma-Aldrich	A9539	Reagent for agarose gel electrophoresis.
UltraPure TBE Buffer, 10X	Invitrogen	15581028	Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	Reagent for agarose gel electrophoresis.
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D-9891	drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystem	4304437	TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe.
15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile	Falcon Corning	352096	Tubes for cell collection and vector dilution preparation.
150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile	Falcon Corning	353025	Cell culture dish for viral production.
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile	Falcon Corning	353046	Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086	Tubes for dilution preparation.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL	Eppendorf	0030 120.094	Tubes for dilution preparation.
0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free	(any)	-	Tubes for semi-quantitative PCR.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL	Applied Biosystem	4346906	96-well for qRT-PCR.
5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap	BD Falcon	352052	Tubes for flow cytometry acquisition.
Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes)	(any)	-	Pipettes for sterile tissue culture applications.
Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes)	(any)	-	Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications.
pH meter	(any)	-	Equipment for measurement of HBS 2X pH.
PCR Thermal cycler	(any)	-	Equipment for semi-quantitative PCR.
Agarose gel electrophoresis equipment	(any)	-	Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2	BD	-	Flow cytometer.
7900HT Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystem	7900HT	Equipment for qRT-PCR.
Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets.	(any)	-	Centrifuge for cell culture processing and spinoculation.
Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor	Beckman Coulter	-	Ultracentrifuge for lentiviral particle production.
Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid).
Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction.