Geführte Protokoll für fäkale mikrobielle Charakterisierung von 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt ein detaillierte standardisierte Protokoll von Hochdurchsatz-16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung. Das Protokoll stellt eine integrierte, uniformierte Machbare und preiswerte Protokoll Kotprobe Sammlung durch Datenanalysen ab. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse einer großen Anzahl von Proben mit strengen Standards und mehrere Steuerelemente.

Zusammenfassung

Der menschliche Darm Microbiome spielt eine zentrale Rolle beim Schutz der Zellen vor Verletzungen, bei der Verarbeitung von Energie und Nährstoffen und bei der Förderung der Immunität. Abweichungen von was als eine gesunde Mikrobiota Komposition (Dysbiose gilt) können lebenswichtige Funktionen führt zu pathologischen Bedingungen beeinträchtigen. Bisherigen und laufenden Forschung Bemühungen haben auf die Charakterisierung der Zusammenhänge zwischen mikrobiellen Zusammensetzung und menschliche Gesundheit und Krankheit.

Fortschritte in der Sequenzierung von Hochdurchsatz-Technologien ermöglichen Charakterisierung der mikrobiellen Zusammensetzung Darm. Diese Methoden umfassen 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung und Schrotflinte Sequenzierung. 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung wird verwendet, um taxonomische Zusammensetzung Profil während Schrotflinte Sequenzierung zusätzliche Informationen über Gene Vorhersagen und funktionellen Annotation bietet. In einer gezielte Sequenzierung Methode der 16 s rRNA Gens Variable Region von Vorteil ist die wesentlich geringeren Kosten im Vergleich zu Schrotflinte Sequenzierung. Sequenzunterschiede in der 16 s rRNA-Gen dienen als mikrobieller Fingerabdruck zur Identifikation und Quantifizierung von verschiedenen Taxa innerhalb einer einzelnen Probe.

Große internationale Anstrengungen haben Standards für die 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung eingetragen. Mehrere Studien berichten jedoch eine Sourceschaltung der Variation von Batch-Effekt verursacht. Zur Minimierung dieser Effekt, uniformierten Protokolle für die Probenentnahme, müssen Verarbeitung und Sequenzierung umgesetzt werden. Dieses Protokoll schlägt die Integration von allgemein verwendeten Protokolle ab Kotprobe Sammlung auf Datenanalysen. Dieses Protokoll beinhaltet einen stützenfreie, direkt-PCR Ansatz, der gleichzeitige Handling und DNA-Extraktion einer großen Zahl von Stuhlproben, zusammen mit PCR Verstärkung der V4 Region ermöglicht. Darüber hinaus wird das Protokoll beschreibt die Analyse Pipeline und liefert ein Skript mit der neuesten Version des QIIME (QIIME-2-Version 2017.7.0 und DADA2). Dieses schrittweise Protokoll zielt darauf ab, die Interessenten bei der Einleitung der Verwendungdes der 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung in einer robusten, reproduktive, einfach zu bedienen, detaillierte Weise zu führen.

Einleitung

Konzentrierte Anstrengungen wurden unternommen, Microbiome Vielfalt und Fülle, als ein weiterer Aspekt für den Fang von Unterschiede und Ähnlichkeiten zwischen den Individuen in gesunden und pathologischen Bedingungen besser zu verstehen. Alter^2,3, Geographie⁴, Lebensstil^5,6, und Krankheit⁵ zeigten sich die Zusammensetzung der Darm Microbiome zugeordnet werden, aber viele Bedingungen und Populationen wurden noch nicht vollständig gekennzeichnet. Vor kurzem wurde berichtet, dass das Mikrobiom für therapeutische Anwendungen^7,8,9geändert werden kann. Daher ist zusätzliche Einblicke in die Beziehung zwischen verschiedenen physiologischen Bedingungen und der mikrobiellen Zusammensetzung der erste Schritt zur Optimierung der potenzielle zukünftige Änderungen.

Die traditionelle mikrobielle Kultur-Methoden sind durch niedrige Erträge^10,11begrenzt und sind konzipiert als einen binären Zustand, wo ein Bakterium ist entweder, im Darm zu präsentieren, oder nicht. Hochdurchsatz-DNA-basierte Sequenzierung hat mikrobielle Ökologie, ermöglichen die Erfassung aller Mitglieder der mikrobiellen Gemeinschaft revolutioniert. Länge und Qualität bleiben erhebliche Hindernisse für genaue Taxonomie Zuordnung¹²lesen Sequenz jedoch. Darüber hinaus können Batch-Effekte, Hochdurchsatz-basierte Experimente leiden an denen Messungen von nicht-biologischen oder nichtwissenschaftlichen Variablen¹³betroffen sind. In den letzten Jahren haben mehrere Programme eingerichtet, um der menschlichen Mikrobiom, einschließlich der amerikanischen Darm-Projekt, die Vereinigten Staaten (US) Human Microbiome Project und das Vereinigte Königreich (UK) MetaHIT Projekt zu studieren. Diese Initiativen haben Unmengen an Daten generiert, die nicht aufgrund mangelnder Konsistenz in ihren Ansätzen leicht vergleichbar sind. Eine Vielzahl von internationalen Projekten wie International Human Microbiome Consortium, das Projekt International Human Microbiome Standards und der National Institute of Standards and Technology (NIST) versucht, einige dieser Probleme^14-Adresse , und entwickelt Standards für Microbiome Messungen, die das Erreichen der reproduktiven Ergebnisse ermöglichen sollte. Hier beschriebene ist ein integriertes Protokoll mehrere allgemein verwendeten Methoden^15,16 für die 16 s rRNA Hochdurchsatz-Sequenzierung (16 s-Seq) ab Kotprobe Sammlung durch Datenanalysen. Das Protokoll beschreibt einen stützenfreien PCR-Ansatz, ursprünglich für direkte Extraktion von pflanzlichen DNA¹⁶, ermöglichen das gleichzeitige Handling einer großen Zahl von fäkalen Proben in relativ kurzer Zeit mit hoher Qualität verstärkt DNA für eine gezielte Sequenzierung der mikrobiellen Variable V4 Region auf einer gemeinsamen Plattform der Sequenzierung. Dieses Protokoll soll Wissenschaftler, die Verwendung der 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung gewissermaßen robuste, reproduktive, einfach zu bedienen, ausführliche Einleitung mit wichtigen Kontrollen führen. Eine geführte und detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokoll kann Batch-Effekt minimieren und so wird mehr vergleichbare Ergebnisse der Sequenzierung zwischen Labors zulassen.

Protokoll

Ethische, Genehmigung für die Studie wurde von der lokalen Forschungsethikkommission Sheba gewährt und alle Methoden wurden gemäß den einschlägigen Richtlinien und Verordnungen durchgeführt. Das Protokoll erhalten eine Zustimmung des Patienten-Ausnahme von der lokalen ethischen Review Board, seit der Fäkalien, die verwendet wurden wurden bereits vorgelegt der Mikrobiologie-Kern im Rahmen des klinischen Aufarbeitung und ohne erkennbare Patienteninformationen als Alter, Geschlecht und mikrobielle Ergebnisse. Geschrieben, wurde die Einwilligung von gesunden Probanden und der Institutional Review Board bewilligt. Einige dieser Proben wurden bereits in einer vorherigen Analyse¹aufgenommen.

1. Probe Handhabung

1. Sammeln eine ca. 5 mm² Abstrich (etwa die Größe von einem Radiergummi) aus einer frischen Kotprobe mit einem sterilen Tupfer in einem Test tube (siehe Tabelle der Materialien). Speichern Sie alle Tupfer mit Stuhlproben bei-80 ° C innerhalb von 24 h. Die fäkale Tupfer können es bleiben, bis die Weiterverarbeitung.

(2) DNA-Extraktion

1. Die Extraktion und Verdünnung Lösungen bei Raumtemperatur auftauen (siehe Tabelle der Materialien).
2. Übertragung der fäkale Tupfer in eine leere 2 mL Sammlung Rohr (siehe Tabelle der Materialien). Passen Sie die Tupfer Stick Größe durch Schneiden sie mit einer sauberen Schere Rohr Verschluss mit minimalen Cross-Kontamination zu ermöglichen. Jede Sammlung-Röhrchen mit der fäkalen Tupfer und Vortex mischen fügen Sie 250 μL der Extraktionslösung hinzu.
3. Die Proben für 10 min in ein kochendes Wasserbad erwärmen (95-100° C). Jede Probe und Vortex mischen fügen Sie 250 μL der Verdünnung der Lösung hinzu.
4. Lagern Sie die 2 mL Röhrchen mit der extrahierten DNA und den Tupfer bei 4 ° c

(3) PCR und Bibliothek-Vorbereitung

Arbeiten Sie für Schritt 3.1 und 3.2 in einer PCR-Workstation, die sauber, bietet Vorlage und Amplifikate Umgebung.

1. Beschriften Sie die Primer (Tabelle 1) entsprechend ihren Barcode. Verdünnen Sie jede Grundierung in doppelt destilliertem Wasser (DDW) zu einer 50 μM Konzentration und speichern bei-20 ° C.
2. Verwenden Sie eine 96-Well-Platte für PCR-Reaktionen. Jede Platte kann 32 verschiedene Proben enthalten, die von 32 verschiedenen Index Primer versehen sind. Tauen Sie der forward Primer und die 32 reverse Primer bei Raumtemperatur auf und verdünnen sie bis 5 μM.
3. 100 Reaktionen (Endvolumen in jede Vertiefung werden 20 µl) bereiten Sie PCR Reaktionsmischungen durch das Mischen von 100 μL von 5 μM Forward Primer, 1 mL 2 X PCR Master Mix und 400 μl DDW vor. Legen Sie 15 μl dieser PCR Mischung in jede Vertiefung (insgesamt 96 Wells). 3 verschiedene Brunnen (32 verschiedene Grundierungen in Triplicates bietet insgesamt 96 Wells) fügen Sie 1 μL jeder 5 μM Reverse indizierten Grundierung hinzu.
4. In einem Pre-PCR eigene Zone, was bedeutet einen sauberen Werkbank, die Vorlage und Amplifikate frei, ist hinzufügen 4 μL jeder extrahierten DNA-Probe Reaktionsgemischen (jede extrahierte DNA-Probe ist in dreifacher Ausfertigung verstärkt — 32 Proben pro 96-Well-Platte).
5. Führen PCR mit den folgenden Einstellungen: erste Denaturierung von 94 ° C für 3 min; gefolgt von 35 Zyklen der Denaturierung bei 94 ° C für 1 min, bei 55 ° C für 1 min und Erweiterung bei 72 ° C für 1 min Glühen; und eine letzte Verlängerung bei 72 ° C für 10 Minuten.
6. Kombinieren Sie auf einer anderen Bank, die als ein Post-PCR-eigene Zone definiert wird jeweils dreifacher PCR-Reaktion in einem Einzelband-Rohr (60 μl pro Probe).
7. Zur Beurteilung der Qualität der PCR Amplifikate laufen Sie 4 μL jeder kombiniert PCR-Reaktion auf eine Interkalation Bromid-gefärbten 1 % Agarose-Gel. Unter UV-Wellenlänge von 260 nm, die positive Amplifikate erscheint in einem erwarteten Bandgröße von 375-425 bp. Nur diese Amplifikate werden in den nachfolgenden Schritten berücksichtigt.
   Hinweis: Jede Probe wird in dreifacher Ausfertigung, Bedeutung verstärkt, dass jede Probe in 3 verschiedenen PCR-Reaktionen verstärkt wird. Nicht skalieren.

(4) Bibliothek Quantifizierung und Reinigung

1. Um einen Pool äquimolaren Konzentration aller PCR Proben zu erhalten, zu quantifizieren jedes Amplifikate durch eine doppelte stranded DNA (DsDNA quantifizieren Reagenz) fluoreszierendes Nukleinsäure Fleck (siehe Tabelle der Materialien), geeignet für die gleichzeitige Quantifizierung eines großen Höhe der Proben.
   Hinweis: Da der Größenbereich der Amplifikate zweideutig ist, dient die tatsächliche Höhe in Nanogramm eine äquimolaren Konzentration zu laden.
2. Kombinieren Sie 500 ng jeder Probe in ein einziges, sterilen Röhrchen. Vortex mischen.
3. Führen Sie 200 μL der gepoolten Bibliothek auf einer Interkalation Bromid-gefärbten 1 % Agarosegel. Extrahieren Sie die 375-425-bp-Bands aus dem Gel mit einem Gel Extraction Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien) und die gepoolte Bibliothek in 80 μl DDW eluieren.
   Hinweis: Die gepoolte Bibliothek Größe ausgewählt, um unspezifische Amplifikationsprodukte vom Host DNA reduzieren sollte.
4. Messen Sie die endgültige Bibliothek Konzentration mit Hilfe eines hochsensiblen DsDNA Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu erkennen (siehe Tabelle der Materialien). Messen Sie die genaue Bibliotheksgröße mit einem hochsensiblen Trennung und Analyse-Kit für DNA-Bibliotheken nach den Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien).

(5) Sequenzierung

1. Verdünnen die gepoolte Bibliothek bis 19:00 mit Zusatz von 20 % Steuerelementbibliothek (siehe Tabelle der Materialien), nach der Sequenzierung Maschine Protokoll.
2. Für die Sequenzierung lesen Verwendung kundenspezifisch angefertigt, Grundierungen, die komplementär zu den V4 Verstärkung Zündkapseln sind (siehe Tabelle 1).
3. Verwendung einer dritten benutzerdefinierten gestaltete Sequenzierung Grundierung, die den Barcode in einer zusätzlichen liest (siehe Tabelle 1) und erzeugt gepaart Ende liest 175 Basen Länge in jeder Richtung, entsprechend den Vorgaben des Herstellers.
4. Laufen Sie die Sequenzierung Maschine und erhalten Sie FASTQ Dateien nach Protokoll des Herstellers.

6. Datenverarbeitung

1. Zusammen nähen Sie und verarbeiten Sie die überlappenden gepaart-End FASTQ Dateien in einer Daten-Kuration-Pipeline in QIIME 2 Version 2017.7.0¹⁷umgesetzt. Demultiplex liest nach Probe bestimmten Barcodes.
2. Verwenden Sie DADA2¹⁸ für Qualitätskontrolle und Sequenz-Variante (SVs)-Erkennung. Kürzen Sie liest am 13 Basen aus dem 3'-Ende und 15 Stützpunkte von 5'-Ende, verwerfen liest mit mehr als 2 erwartete Fehler. Erkennen und Entfernen der Chimären verwenden die Konsensmethode — Chimären sind in Proben einzeln erkannt und Sequenzen gefunden Chimären in Sekundenbruchteilen genügend Proben werden entfernt.
3. SVs taxonomische Klassifikation mit eine Naive Bayes ausgestattet-Sichter durchführen, ausgebildet am August 2013 99 % Identität Greengenes Datenbank-⁶, für 175 lange Lese- und der vorwärts/rückwärts-Primer eingestellt.
4. Verdünnen Sie alle Proben zu Tiefe von 2.146 Sequenzen.
5. Nutzen Sie ungewichteten UniFrac für Messung der β-Vielfalt (zwischen Probe Vielfalt^19,20) auf die verdünnten Proben, um eine Probe-Größe-Effekt zu vermeiden.
6. Verwenden Sie die daraus resultierenden Distanzmatrix um eine Analyse der wichtigsten Koordinaten (HKoA) durchzuführen.
   Hinweis: Die Datenverarbeitung Skript und Mapping-Dateien dienen als ergänzendes Material (ergänzende Material 1 und 2).

Ergebnisse

Eine schematische Darstellung des Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt.

Wir haben prospektiv Stuhlproben von hospitalisierten Patienten mit vermuteten infektiösen Durchfall gesammelt. Diese Proben wurden klinische Mikrobiologielabor am Sheba Medical Center zwischen Februar und Mai 2015 vorgelegt wie zuvor beschrieben¹war. Stuhlproben wurden herkömmliche mikrobiologische...

Diskussion

16 s rRNA-Amplifikate und Metagenomik Shotgun Sequencing haben Popularität in klinischer Mikrobiologie Anwendungen^21,22,23gewonnen. Diese Techniken sind vorteilhaft in ihre erhöhte Fähigkeit, kultivierbare und nicht-kultivierbare Taxa, die Bereitstellung von Daten über die relative Häufigkeit der pathogenen Inokulum und ihre Fähigkeit, genauer gesagt eine infektiöse Biofilm zu identifizieren zu erfassen Fingerabdruck-²⁴. Die Fortsch...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primers	Integrated DNA Technologies (IDT)
Extraction solution	Sigma-Aldrich	E7526
Dilution solution	Sigma-Aldrich	D5688
Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit	KAPABIOSYSTEMS	KK2601	PCR Master mix
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kit	Invitrogen	P7589	dsDNA quantify reagent
MinElute Gel extraction kit	Qiagen	28606
Agarose	Amresco	0710-250G
Ultra Pure Water Dnase and Rnase Free	Biological Industries	01-866-1A
Qubit dsDNA HS assay kit	Molecular probes	Q32854	dsDNA detecting kit
High Sensitivity D1000	Agilent Technologies	Screen Tape 5067-5582	separation and analysis
Screen Tape Assay	Agilent Technologies	Reagents 5067-5583	for DNA libraries
PhiX Control v3	Illumina	15017666	control library
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle)	Illumina	MS-102-2003
Ethidium Bromide	Amresco	E406-10mL-TAM
2 mL collection tubes	SARSTEDT	72.695.400	Safe Seal collection tubes
Plastic stick swab in PP test tube	STERILE INTERIOR	23117
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
PCR Machine	Applied Biosystems	2720 Thermal Cycler
Sequncing Machine	Illumina	Miseq
PCR workstation	Biosan	UV-cleaner
scissors
vortexer	Scientific Industries	Vortex-Genie 2