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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Imaging netzhautgewebe kann einzellige Informationen liefern, die von den traditionellen biochemischen Methoden gesammelt werden kann nicht. Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung der Netzhaut Scheiben von Zebrafisch für die konfokale Bildgebung. Fluoreszierende genetisch codierten Sensoren oder indikatorfarbstoffen erlaubt Visualisierung von zahlreichen biologischen Prozessen in verschiedenen retinalen Zelltypen.

Zusammenfassung

Die Netzhaut ist ein komplexes Gewebe, die initiiert und die ersten Schritte der Vision integriert. Funktionsstörung des retinalen Zellen ist ein Markenzeichen von vielen blendenden Krankheiten, und zukünftige Therapien abhängen, wie verschiedene Retinal grundlegende Verständnis, dass Zellen normal zu funktionieren. Gewinnung solcher Informationen mit biochemischen Methoden hat schwierig erwiesen, da Beiträge von bestimmten Zelltypen in der Netzhaut Zellmilieu vermindert werden. Live retinale Bildgebung bieten einen Überblick über zahlreiche biologische Prozesse auf subzellulärer Ebene, dank einer wachsenden Zahl von genetisch codierte fluoreszierende Biosensoren. Jedoch wurde diese Technik bisher beschränkt, Kaulquappen und zebrafischlarven, die äußersten Netzhaut Schichten der isolierten Netzhaut oder niedriger Auflösung Bildgebung der Netzhaut mit lebenden Tieren. Hier präsentieren wir eine Methode zur Erzeugung von live ex Vivo retinalen Scheiben aus Erwachsenen Zebrafisch für live Imaging über konfokalen Mikroskopie. Dieses Präparat liefert Quere Scheiben mit allen Schichten der Netzhaut und die meisten Zelltypen sichtbar für die Durchführung von konfokalen bildgebender Untersuchungen mit Perfusion. Transgene Zebrafisch mit dem Ausdruck ihrer fluoreszierende Proteine oder Biosensoren in bestimmten retinalen Zelltypen oder Organellen sind einzellige Informationsextraktion aus eine intakte Netzhaut verwendet. Darüber hinaus können retinale Scheiben mit fluoreszierenden indikatorfarbstoffen, die Methode Vielseitigkeit hinzu geladen werden. Dieses Protokoll wurde entwickelt für imaging Ca2 + im Zebrafisch-Zapfen-Photorezeptoren, aber mit richtigen Marker könnte es um Ca2 + oder Metaboliten in Müller-Zellen, bipolar und horizontalen Zellen, Mikroglia, amakrinen Zellen oder Retinal Messen angepasst werden Ganglienzellen. Das retinale Pigmentepithel wird aus Scheiben entfernt, so ist diese Methode nicht geeignet für das Studium dieser Zelltyp. Mit etwas Übung ist es möglich, seriellen Scheiben von einem Tier für mehrere Experimente zu generieren. Diese anpassungsfähige Technik ist ein leistungsstarkes Tool für die Beantwortung vieler Fragen über retinale Zellbiologie, Ca2 +und Energie-Homöostase.

Einleitung

Der Zebrabärbling (Danio Rerio) hat in medizinischen und grundlegende wissenschaftliche Forschung1, aufgrund seiner geringen Größe, schnelle Entwicklung und vertebrate Organsysteme verbreitet werden. Die natürliche Transparenz des zebrafischlarven in Kombination mit bewährten Methoden für die Transgenese konnten detaillierte Visualisierung zellulärer Prozesse in ein lebendes Tier. Eine Reihe von genetisch codierte fluoreszierende Biosensoren haben spezifische Zebrafisch Zellen zur Erkennung von Ca2 + 2, Wasserstoffperoxid3, apoptotischen Aktivierung4 und ATP5ins Visier genommen.

In-Vivo Bildgebung von zebrafischlarven führte zum Durchbruch auf dem Gebiet der Neurowissenschaften, einschließlich der Zuordnung von Gehirn Schaltungen6 und Arzneimittelentwicklung für zentrale Nervensystem Erkrankungen7. Zebrafisch eignen sich gut für Vision Forschung, weil ihre Netzhaut sind mit laminarer Struktur und Neuron Typen der höheren Wirbeltiere, und sie zeigen robuste visuelle Verhalten8,9. Verschiedene Arten von retinalen Degenerationen analog zur menschlichen Krankheit wurden erfolgreich modelliert und im Zebrafisch10,11, einschließlich live Darstellung der einzelnen Fotorezeptoren degeneriert innerhalb einer Netzhaut-2untersucht, 12.

Während in Vivo Larven Zebrafisch-Bildgebung ein wertvolles Instrument ist, wird es schwieriger, wenn Fische wachsen und sich entwickeln Pigmentierung, und einige pharmakologischen Behandlungen können kein ganzes Tier zu durchdringen. Darüber hinaus ändern bestimmte zelluläre Prozesse mit Entwicklung und Alter, machen spätere Zeitpunkte für Verständnis-Funktion und das Fortschreiten der Krankheit bei erwachsenen Tieren. Biochemische Methoden wie Immunoblot, Quantitiative PCR, O2 Verbrauch und Metabolomic Analysen liefern wichtige Hinweise zur Biologie der Netzhaut als Ganzes, aber es ist schwer zu erkennen, Beiträge der einzelnen Zelltypen betroffen Erkrankung. Isolierte netzhautgewebe ex Vivo Imaging umgeht diese Probleme, und während imaging-flach montierten Netzhaut bietet einen Ausblick auf die äußere Netzhaut13, tiefere inneren Netzhaut Eigenschaften verdunkelt. Transversale Retinal Scheiben, wie die in festen immunhistochemische Analysen einen klaren Überblick über alle Schichten und Zelltypen ermöglichen bieten aber nur eine Momentaufnahme der dynamischen Prozesse in der normalen Funktion und Krankheit.

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Erzeugung von ex-Vivo quer retinalen Scheiben aus Erwachsenen Zebrafisch für die Bildgebung. Es ähnelt dem Verfahren zur Herstellung von Amphibien und Zebrafisch retinaler Scheiben für elektrophysiologische und morphologische Studien14,15, mit wichtigen Änderungen für Zeitraffer- ex Vivo mit confocal imaging Mikroskopie. Fluoreszenz Antworten von Biosensoren oder Farbstoffen in Scheiben werden in Echtzeit mit einem konfokalen Mikroskop überwacht, während liefern pharmakologische Wirkstoffe mit Perfusion. Während die Methode für die Photorezeptoren imaging entwickelt wurde, kann es, es zu benutzen, zur Visualisierung von Müller-Zellen, Bipolarzellen, horizontalen Zellen, amakrinen Zellen oder retinalen Ganglienzellen mit entsprechenden fluoreszierende Markierungen möglich sein. Darüber hinaus können die Scheiben mit Zelle durchlässig Fluoreszenzfarbstoffen Bericht Zellviabilität, vesikuläre Transport, mitochondriale Funktion oder Redox-Zustand geladen werden. Diese vielseitige Vorbereitung ermöglicht Visualisierung einer breiten Palette von subzellulären Prozessen in der Netzhaut, einschließlich Ca2 + Dynamik, Signaltransduktion und metabolischen Zustand.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden von der University of Washington institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Vorbereitung der Tiere und Ausrüstung

Hinweis: Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist ein dunkles Blatt von der Außenseite der Netzhaut deren Pigmentierung kann Netzhaut Funktionen zu verschleiern und schädigen das Gewebe beim konfokale Ex Vivoimaging umgebende Gewebe. Bei Dunkelheit wird die RPE Zebrafisch Weg von der Netzhaut zurückgezogen; Dunkelheit anzupassen Fisch, zukünftige Entfernung des RPE von der Netzhaut vor dem Aufschneiden und Bildgebung zu erleichtern.

  1. Übertragen Sie Fisch auf einen Laich Tank mit Fischwasser, und dann wickeln Sie die laichbeckens mit dunklen Stoff oder legen Sie sie in einem dunklen Schrank.
    1. Dunkelheit anzupassen Zebrafisch für mindestens 1 h vor der Euthanasie in der Nähe von vollständige Trennung von der RPE der Netzhaut zu ermöglichen. 30 min dunkel Anpassung ist ausreichen, um die meisten RPE zu beseitigen, obwohl Teile davon eingefügten zwischen Photorezeptoren bleiben können.
  2. Schmelzen ~ 15 mL Petroleum jelly in einen 50-mL-Becherglas auf einer heißen Platte und ziehen Sie 3 mL der Flüssigkeit in eine Spritze 3 mL Slip Spitze. Invertieren Sie Spritze zu, legen Sie in einem Reagenzglas Gestell und lassen Sie Vaseline abkühlen.
  3. Machen Sie eine wiederverwendbare Slice Kammer auf einen Objektträger schlicht 7 X 2,5 cm.
    1. Mit klaren Nagellack, Farbe schmale Linien erstellen Sie ein 3 X 2,5 cm Rechteck in der Mitte der Folie, trocknen lassen Sie, und fügen Sie eine weitere Schicht des Nagellacks zu den Linien.
  4. Bereiten Sie Image Leitern auf Deckel rutscht Scheiben während der Bildgebung zu halten. Die Scheiben werden die "Sprossen" der Leiter bilden.
    1. Machen Sie für statische Bildgebung oder Injektion Experimente mit minimalen Lösung fließen Vaseline Leitern bestehend aus zwei flachen breiten parallelen Streifen Vaseline auf 18 mm quadratisch Glas Deckel rutscht. Verwenden Sie die Spritze zwei abgeflacht anwenden ~ 1 cm langen Schlieren gekühlten Vaseline 0,5 cm Abstand auf das Deckglas.
  5. Die Gewebe-Schneidemaschine bereit.
    1. Reinigen Sie eine zweischneidiges Rasierklinge mit Ethanol und lassen Sie es an der Luft trocknen. Schneiden Sie es in Viertel mit der Schere, zuerst längs in zwei Hälften dann über jede Klinge.
    2. Die Slice Kammer auf der Bühne des Gewebes Slicers, zentrieren Sie ihn horizontal auf der Bühne und markieren Sie eine Längsseite mit permanent-Marker für die Ausrichtung.
    3. Laden Sie einen Abschnitt der Klinge auf den Gewebe-Hobel-Arm, sicherzustellen Sie, dass die Klinge flach und mittig auf der Folie liegt, ohne Sie zu berühren den Nagellack, dann ziehen Sie vorsichtig an der Klinge-Apparat. Niedriger die Klinge-Arm durch Einstellknopf ¼ drehen, legen Sie dann ein Stück Filterpapier in der Mitte der bildgebenden Kammer und Test schneiden. Wenn das Papier nicht vollständig durch Schneiden, remount die Klinge.
  6. Mit der Spritze, platzieren Sie einen einzigen kleinen Punkt gekühlten Vaseline in einer 10 cm Petrischale ~ 1,5 cm rechts von der Mitte. Drücken Sie eine bildgebende Leiter hinein mit Pinzette mit der Vaseline nach oben. Eine weitere kleine Vaseline Punkt ~ 1 cm vom Rand der bildgebenden Kammer Einlass.
  7. Passen Sie die Vaseline-Spritze mit einer Nadel 20g und Entdeckeln Sie es. Halten Sie die Nadel auf die Spritze und verwenden Sie, um zwei 1 cm lange, dünne parallele Streifen Vaseline längs in der Mitte der Kammer aufschneiden. Raum der Streifen ~ 1 cm auseinander.
  8. Machen Sie eine wiederverwendbare Draht-Auge-Loop-Werkzeug durch das Einwickeln von der Mittelpunktes des einen ~ 4 cm Segment von 30 g wolframdraht um ein paar Zangen einmal fest geschlossen. Passen Sie den Durchmesser der Schleife durch den Draht nach oben oder unten die Zange schieben, bis es in der Regel etwas größer als ein Zebrafisch-Auge ist ~ 2-3 mm. Drehen Sie die Drahtenden und bis zum Ende von einem 6 cm Holzstab mit Labor Klebeband zu sichern.
  9. Ringer Lösung vorzubereiten.
    1. Tauen Sie 50 X Ergänzung Stammlösung (Tabelle 1 auf) und fügen Sie ihn frisch zu HEPES gepufferten, nicht-Bikarbonat Ringer-Lösung (Tabelle 2) am Morgen des Experiments; verdünnen Sie 200 µL der Stammlösung Ergänzung in jedem 10 mL Ringer Lösung in einem konischen Zentrifugenröhrchen oder sterilen Glasflasche. Bereiten Sie für statische Bildgebung Experimente mindestens 30 mL Ringer Lösung pro Versuch. Das Volumen der Ringer Lösung für die Perfusion Experimente benötigt hängt von der Durchflussmenge und total Experiment Zeit.
    2. Überprüfen Sie, dass der pH-Wert der Lösung ergänzt ist 7.4 mit einem digitalen pH-Sonde oder pH-Papier, und passen Sie entsprechend mit verdünnen NaOH oder HCl.
    3. Mit Sauerstoff ergänzt Ringer-Lösung auf dem Eis von sprudelnden mit 100 % Sauerstoffgas für mindestens 5 min mit einem standard medizinischer Sauerstofftank und Regler mit einem Schlauch versehen, oder optional Gasarmatur Bubbler für Perfusion verwendet. Speichern Sie sauerstoffreiches Ringer-Lösung auf Eis in einem versiegelten konische Zentrifugenröhrchen oder sterilen Glasflasche in der Nähe der Dissektion Mikroskop; Verwenden Sie diese Lösung für Dissektion, imaging, und Farbstoffe oder pharmakologische Wirkstoffe zu verdünnen.
    4. Wenn andere Lösungen im Experiment, wie Na+verwendet werden-gratis-Ringer Lösung (Tabelle 3), wiederholen Sie die Schritte 1.9.1.-1.9.3.
  10. Petrischalen, Pinzetten, Mikro-Scheren und andere Werkzeuge in der Nähe der Dissektion Mikroskop zu sammeln, und Zebrafisch Euthanasie ein Fisch Wasser Eisbad vorbereiten.

2. Vorbereitung retinale Scheiben (siehe Abbildung 1)

  1. Arbeiten unter roten Umgebungslicht minimiert Licht Anpassung (die den RPE-Stick der Netzhaut mehr fest stellen können), einschläfern Zebrafisch durch Eintauchen in das Eisbad bis Touch-Reaktion verloren geht, in der Regel 1-2 min. übertragen Sie den Fisch auf einer Petrischale und einem Skalpell zu verwenden Zervikal verrücken, aber die Fische nicht zu enthaupten.
  2. Verwenden Sie die Drahtschlinge um Bindegewebe um ein Auge zu lösen, und ziehen Sie dann das Auge nach vorne vorsichtig mit der Schleife in einer Hand. Schneiden Sie mit Mikro-Schere in der anderen Hand den weißen Sehnerv unter dem Auge, kümmert sich nicht um die Rückseite des Auges zu schneiden.
  3. Übertragen Sie das Auge mit Pinzette zu einer Petrischale von kalten Ringer-Lösung auf dem Eis zu, und wiederholen Sie für das zweite Auge. Halten Sie die Augen in der Dunkelheit oder unter Rotlicht, bis die RPE von der Netzhaut entfernt wird.
  4. Die Augenmuscheln unter dem low-Power-Dissektion-Mikroskop in einem Tropfen kalten Ringer-Lösung auf einem einfachen Objektträger in einer Petrischale zu sezieren.
    1. Durchbohren die Hornhaut mit einer feinen Pinzette, dann entfernen Sie vorsichtig die Stücke von klaren, spröden Hornhaut und silbrig Sklera mit Zange oder Schere. Entfernen und entsorgen Sie die Linse und ein Großteil der Sklera (siehe Abbildung 1A), und die isolierte Augenmuschel minimal zu behandeln.
    2. Fettstücke, kleine Stückchen Lederhaut und schwarzen RPE können bleiben an die Augenmuschel und später von der Netzhaut entfernt. Wenn die Netzhaut von der RPE im Schritt 2.4.1 trennt, fahren Sie mit den gleichen Schritten mit besondere Vorsicht walten lassen, nicht zu die zarten isolierende Netzhaut beschädigen.
    3. Positionieren Sie Augenmuschel offenen Seite nach unten (RPE oben) auf der Folie und schneiden Sie in Drittel oder Viertel mit einer frischen Kante Rasierklinge in einer Bewegung (siehe Abbildung 1 b). Teile des Gewebes, die stark gekrümmt sind zu verwerfen.
  5. Flache Halterung Netzhaut auf Filterpapier.
    1. Befeuchten Sie ein Stück Filterpapier mit Ringer Lösung und legen Sie sie auf der Folie neben der Augenmuschel-Stücken. Verwenden Sie flache Zange beim Umgang mit der intakten nassen Filterpapiers um zu vermeiden Punktierung es. Fügen Sie kalt Ringer-Lösung auf dem Filterpapier und Gewebe ausgedehnt.
    2. Ziehen Sie mit der Zange in jeder Hand sorgfältig das Filterpapier unterhalb jedes Augenmuschel mit dem RPE und Photorezeptoren nach oben, d. h. mit der Rückseite des Auges nach oben. Die Augenmuschel-Stücke in einer Linie entlang der Mittellinie des Filterpapiers zu positionieren (siehe Abbildung 1). Handhaben Sie die Augenmuschel Stücke vorsichtig mit einer feinen Pinzette nur in der Nähe einer Kante oder Ecke.
    3. Um Netzhaut an das Filterpapier halten zu helfen, legen Sie das nasse Filterpapier auf einem trockenen Papiertuch für 3 s, Docht Feuchtigkeit nach unten, aber nicht das Gewebe trocken werden zu lassen. Wiederholen Sie, bis die Augenmuschel Stücke flach auf dem Filterpapier liegen. Sanfte Saugwirkung auf der Unterseite des Filterpapiers angewendet hilft die Netzhaut zu glätten, aber dieser Schritt ist nicht unbedingt erforderlich.
  6. Wenn schwarze Blätter des RPE auf die Augenmuschel Stücke bleiben, verwenden feine Pinzette vorsichtig schälen es entfernt ausgehend von einer Ecke (siehe Abbildung 1), während das Gewebe in einem Tropfen Ringer Lösung sitzt. Die Netzhaut das Filterpapier, Wiederholung den Feuchtigkeitstransport Schritt 2.5.3 abheben sollte. Die Netzhaut kann aufgrund ungebleicht visuelle Pigmente Rosa erscheinen.
  7. Wiederholen Sie die Netzhaut Dissektion und Wohnung Schritte in 2.4-2.6 für das zweite Auge, Montage, auf Wunsch die ersten Wohnung montiert Netzhaut mitten im kalten Ringer-Lösung zu halten. Um das slicing Verfahren zu optimieren, können Stücke der beiden netzhäute auf einem Filterpapier gelegt werden. Sobald die RPE entfernt wurde, kann das Protokoll unter normalem Raumlicht durchgeführt werden, wenn Experimente Dunkelheit erfordern.
  8. Legen Sie das Filterpapier auf einer Folie und schneiden Sie es in ein Rechteck mit einer einzelnen Kante Rasierklinge, verlassen ~ 0,5 cm Filterpapier auf beiden Seiten der Linie der Netzhaut. Bewegen Sie das Filterpapier in die vorbereiteten slicing Kammer, schieben Sie die lange Filterpapier Kanten in die dünne Vaseline-Linien mit Pinzette und Tauchen Sie die Netzhaut in 3 bis 4 Tropfen des kalten Ringer-Lösung.
    Hinweis: Einige Farbstoffe, wie z. B. lipophile Farbstoffe sind in diesem Stadium vor dem Schneiden am besten in flache Halterungen geladen. Diese können geladen, böse entfernt mit einem Tuch und gewaschen in der slicing Kammer. Zum Beispiel C12 558/568 BODIPY Flecken intensiv retinalen Zelle Membranen und Photorezeptor außensegmenten (siehe Abbildung 4A) beladenen bei ~ 5 µg/mL für 15 min bei Raumtemperatur (in der Regel 23-27 ° C), gefolgt von einem Waschen in überschüssige Ringer-Lösung .
  9. Übertragen Sie Slice Kammer auf der Gewebe-Hobel-Bühne, positionieren Sie die lange Kante entlang der markierten Linie und sichern Sie die Kammer enden mit Labor-Band auf die Bühne. Schneiden Sie an einem Ende beginnend, Netzhaut und Filterpapier mit festen, sanften Druck auf das slicing Arm. Prüfung, die erste Schicht vollständig geschnitten wurde dann mithilfe der Mikrometer geschnitten ~ 400 µm Scheiben.
  10. Montieren Sie die Image-Leiter.
    1. Ort der slicing Kammer mit in Scheiben geschnittenen retinalen Abschnitten in der Petrischale aus Schritt neben der Abbildung 1.7 ladder (siehe Abbildung 1E). Füllen Sie die Schale mit kalten Ringer-Lösung um seinen Inhalt zu versenken.
    2. Mit Hilfe einer Pinzette und Scheiben unter Wasser zu halten, sanft Streifen Filterpapier und Netzhaut zum Übertragen der Leiter durch Verschieben der Petrischale von links nach rechts Achten Sie darauf, keine Netzhaut direkt berühren. Die Scheiben Drehen 90° und die Filterpapier Kanten in Vaseline zu begraben.
    3. Fein retinale Scheiben in der Ladder mit der Pinzette so positionieren, dass Netzhaut Schichten deutlich sichtbar unter dem Mikroskop Dissektion sind (siehe Abbildung 1). Scheiben an jedem Ende der Leiter stellen Sie sicher, dass das Gewebe nach innen in Richtung der anderen Scheiben, Bewegung des Gewebes während der Injektion oder Strömung zu minimieren gegenübersteht. Entsorgen Sie Netzhaut Scheiben, die nicht gut sind das Filterpapier eingehalten werden (siehe Abb. 2A).
  11. Auf Wunsch laden Farbstoffe in retinalen Scheiben in diesem Stadium und Waschen in überschüssige Ringer-Lösung vor der Bildgebung.
    Hinweis: Propidium Jodid (PI) und Hoechst 33342 robust Fleck Kerne von Toten und alle Zellen, bzw. (siehe Abb. 2 b), wenn mit retinalen Scheiben bei 5 µg/mL für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Tetramethylrhodamine (TMRM) reichert sich im aktiv atmenden Mitochondrien in der Netzhaut bei inkubiert auf 1 nM für 30 min bei Raumtemperatur.
  12. Während die Scheiben Färbung sind, bereiten Sie das bildgebende Kammer und Injektion Apparat. Verwenden Sie die Spritze zum Spülen Sie des Schlauch mit Ringer Lösung und spülen Bläschen, befestigen das offene Ende des Schlauches mit dem bildgebenden Kammer Einlass und schließen Sie den Absperrhahn. Ziehen Sie die Spritze und füllen Sie es mit Reagent(s) für die Injektion, dann bringen Sie ihn auf das Rohr.
  13. Pinzette verwenden, um das Deckglas mit retinalen Scheiben der bildgebenden Kammer drücken das Deckglas in den Punkt Vaseline in der Nähe die einlaufkante der bildgebenden Kammer übertragen (siehe Abbildung 1 H). Füllen Sie die bildgebende Kammer mit Ringer Lösung um Scheiben zu decken.

(3) Bildgebung retinalen Scheiben

  1. Legen Sie die gefüllte bildgebende Kammer mit der angeschlossenen injektionsapparat auf der Bühne eine aufrechte confocal Mikroskop, ausgestattet mit einem 20 oder 40 X Objektiv eintauchen. Imaging Saal mit Bühne Clips zu sichern.
  2. Senken Sie das Tauchbecken Objektiv über die Leiter, und konzentrieren Sie sich auf eine Scheibe an einem Ende der Leiter unter Dämmerlicht Trans beleuchtet. Prüfen Sie jede Scheibe für transversale Ausrichtung, Vorhandensein von Photorezeptor außensegmenten und sichere Haftung auf dem Filterpapier.
  3. Wählen Sie die beste Scheibe für Time Lapse Bildgebung und konfigurieren Sie die Mikroskop-Software für die Bildaufnahme Zeit verfallen. Tabelle 4 zeigt typische bildgebende Einstellungen für verschiedene fluoreszierenden Marker und Farbstoffe.
    Hinweis: Die Rate der Bildaufnahme variiert je nach das Mikroskop, fluoreszierende Marker(s) und biologischer Prozess untersucht. Beispielsweise verwenden Sie 800 x 800 Pixelauflösung, 2 µs/Pixel-Scan-Geschwindigkeit und einer 10-s-Frame-Rate für imaging-Kalzium-Dynamik in Photorezeptoren mit GCaMP3 und einen roten Farbstoff.
    1. Falls vorhanden, verwenden Sie die Software körperliche Sehenswürdigkeiten in dem Segment (Photorezeptor außensegmenten Zellkörper, Kerne) um mögliche Neuorientierung während der Zeitspanne zu helfen zu verfolgen. Auch die Software zur Echtzeit-Fluoreszenz über die Scheibe Überwachung eingerichtet.
  4. BEGIN Bildgebung und Monitor Grundlinie Fluoreszenz. Bei der Fluoreszenz in der Scheibe (in der Regel innerhalb von 2-5 min) stabilisiert, fahren Sie mit dem Experiment. Öffnen Sie für die Injektion die Spritze Absperrhahn, dann langsam drücken Sie und ziehen Sie zurück auf den Kolben, zweimal um Hilfe mischen.
    Hinweis: zum Beispiel Abschaffung mitochondriale Funktion durch die Injektion einer konzentrierten Lösung von Protonophore CCCP, eine Endkonzentration von 1 µM in der bildgebenden Kammer zu erreichen. Dies führt zu einer robusten Ca2 + platzen in Photorezeptor Zytosol von GCaMP berichtet, dann eine stetige Abnahme mitochondriale Membranpotential von TMRM gemeldet.
  5. Eng überwachen Sie Scheiben für Drift während des Experiments und verwenden Sie die Software, um Mikro-Anpassungen nach physischen Sehenswürdigkeiten machen. In der Regel treiben in Z-Richtung beim Einspritzen oder Perfusion ist < 5 µm.

(4) imaging retinale Scheiben während der Perfusion Experimente, wo Lösungen verändert oder kontinuierlich floss

Hinweis: Retinal Imaging Scheiben während der Perfusion Experimente, wo sind die Lösungen verändert oder kontinuierlich floss Setup für statische Bildgebung oder Injektion Experimente mit den folgenden Änderungen ähnelt.

  1. Statt Vaseline Leitern im Schritt 1.4 beschrieben verwenden Sie stabilere Wachs Leitern retinale Scheiben während Lösung Strömung stabil zu halten.
    1. Legen Sie zwei kleine parallele Zylinder unflavored dental Wachs ~ 0,5 cm auseinander auf einem deckgläschen. Verwenden Sie auf einer flachen Oberfläche einen Daumen um jeden Zylinder nach unten und außen an den parallel Rand des Deckglases drücken. Erzielen beide abgeflachten Zylinder horizontal mit einem deckgläschen #1 (siehe Abbildung 1E, rechts) dann eine dünne Schicht Vaseline zwischen den Wachsstreifen mit einem Spatel zu schmieren.
    2. Bei der Montage der bildgebenden Leiter im Schritt 2.10.2 Drücken Sie die in Scheiben geschnittenen Filterpapier Kanten in die Wachs-Scores mit feinen Pinzette (Abbildung 1).
  2. Um Durchblutung im Schritt 2.12 einzurichten, füllen Sie die Spritze Stauseen mit preoxygenated Lösungen oder verwenden Sie optional Gasarmatur, um Lösungen in jedem Behälter mit Sauerstoff. Spülen Sie alle Schläuche mit Ringer Lösung, sicherzustellen Sie, dass alle Linien fließen, wenn geöffnet und große Luftblasen zu entfernen.
  3. Vor dem Befüllen der bildgebenden Kammer im Schritt 2.13, verwenden Sie die Spritze, um ein weiterer Punkt der Vaseline über jeder exponierte Ecke das Deckglas zu verhindern, dass seitlich gleiten, während der Fluss zu legen.
  4. Wenn die bildgebende Kammer ist gefüllt und auf dem Mikroskoptisch montiert, schalten Sie die Absauganlage und verbinden Sie den Sauger Schlauch. Testen Sie den Fluss der Ringer Lösung und nutzen die Micropositioner, den Sauger Schlauch über den Abfluss Kammer zu verorten, so dass geringe Mengen an Flüssigkeit abgesaugt, bevor die Kammer überläuft (in der Regel ~ 1 mm über der Oberfläche der Lösung für eine Durchflussmenge von 2 mL/min). Aufzubewahren Sie Ringer Lösung fließen bei der Auswahl der Scheiben in Schritt 3.4.
  5. Um das Experiment in Schritt 3.4 für Perfusion durchzuführen, schalten Sie Fluss der Lösungen durch die Schließung der Absperrhahn der ersten Lösung beim Öffnen, die die zweite Lösung.
    1. Zum Beispiel um extrazellulären Na+ aus der bildgebenden Kammer zu verbrauchen, verwenden zwei Spritze Reservoirs gefüllt mit Ringer Lösung oder Na+-Lösung (Tabelle 3). Ringer Lösung zur Grundlinie zu etablieren, dann wechseln Sie zu Na+fließen-Lösung. Dies führt zu großen cytosolischen Ca2 + in Photorezeptor außensegmenten erhöht und Zellkörper (siehe Abbildung 4).
  6. Überwachen Sie für Schwerkraft-gefütterten Perfusion Systeme die Lösung in jedem Behälter so ist der Volumenstrom konstant während der Bildgebung. Stauseen abzurunden Sie, bei Bedarf mit Sauerstoff angereichertes Lösungen oder pflegen Sie kontinuierliche Sauerstoff sprudelt mit Gasarmatur.

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Ergebnisse

Stabile Positionierung und transversale Ausrichtung der Scheiben sind Schlüssel für erfolgreiche Bildbearbeitung mit Injektion oder Perfusion pharmakologischer Substanzen. Sorgfältig prüfen Sie und positionieren Sie Scheiben vor konfokale Bildgebung zu, wie notwendig, um sicherzustellen, dass alle Schichten der Netzhaut sind sichtbar (Abbildung 2A, Teil Ii). Wenn eine Scheibe gedreht wird leicht nach vorne (Abb. 2A, Slice-Iii...

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Diskussion

Ex-Vivo Bildgebung frische Zebrafisch retinalen Scheiben erweist sich ein vielseitiges Werkzeug für das Studium Photorezeptor Biologie20,21,22und ist einzigartig, da es ermöglicht Analyse einzelner Zellen in eine Reife, voll differenzierte Netzhaut. Mit etwas Übung ist es möglich, mehrere Experimente mit Gewebe von Fischen, auch mit seriellen Scheiben aus dem gleichen Teil der Netzhaut. Zusätzlich zu den Herausford...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir danken Ralph Nelson und Daniel Possin für durchdachte Beratung bei der Entwicklung dieses Protokoll, und Eva Ma Ashley und George Gail Stanton zur Erzeugung von stabilen transgenen Zebrafisch-Linien. Die Arbeit wurde unterstützt durch NSF GRFP 2013158531, M.G., NIH NEI 5T32EY007031, W.C. und M.G. und EY026020, j.h. und S.B.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
zebrafishUniveristy of Washington South Lake Union Aquatics Facilitystocks maintained in-house as stable transgenic lines
petroleum jellyFisher Scientific19-090-843for petroleum jelly syringe
3-mL slip tip syringeFisher Scientific14-823-436for petroleum jelly syringe
20g 3.8 cm slip tip needleFisher Scientific14-826-5Bfor petroleum jelly syringe
plain 7 cm X 2.5 cm microscope slideFisher Scientific12-550-A3for eyecup dissection, slicing chamber
Seche Vite clear nail polishAmazonB00150LT40for slicing chamber
18 mm X 18 mm #1 glass coverslipsFisher Scientific12-542Afor imaging ladders
unflavored dental waxAmazonB01K8WNL5Afor imaging ladders
double edge razor bladesStoelting51427for tissue slicing
tissue slicer with digital micrometerStoelting51415for tissue slicing
filter paper - white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore sizeEMD MilliporeHAWG01300filter paper for mounting retinas
10 cm petri dishFisher ScientificFB0875712for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly
15 cm plain-tipped wood applicator stickFisher Scientific23-400-112for wire eye loop tool
30g (0.25 mm diameter) tungsten wireFisher ScientificAA10408G6for wire eye loop tool
D-glucoseSigma AldrichG8270component of supplement stock solution
sodium L-lactateSigma AldrichL7022component of supplement stock solution
sodium pyruvateSigma AldrichP2256component of supplement stock solution
L-glutamineSigma AldrichG3126component of supplement stock solution
 L-glutathione, reducedSigma AldrichG4251component of supplement stock solution
L-ascorbic acidSigma AldrichA5960component of supplement stock solution
NaClSigma AldrichS7653component of Ringer's solution
KClSigma AldrichP9333component of Ringer's solution
CaCl2 · 2H2OSigma AldrichC3881component of Ringer's solution
NaH2PO4Sigma AldrichS8282component of Ringer's solution
MgCl2 · 6H2OSigma AldrichM0250component of Ringer's solution
HEPESSigma AldrichH3375component of Ringer's solution
Tris baseFisher ScientificBP152component of Na+-free Ringer's solution
6 N HClFisher Scientific02-003-063component of Na+-free Ringer's solution
KH2PO4Sigma AldrichP5655component of Na+-free Ringer's solution
50 mL conical centrifuge tubeDenville ScientificC1062-Pcontainer for Ringer's solution
Vannas scissors - 8 cm, angled 5 mm bladesWorld Precision Instruments501790micro-scissors for eyecup dissection
Swiss tweezers - #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tipsWorld Precision Instruments504510fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation
single edge razor bladesFisher Scientific12-640for eyecup dissection and trimming filter paper
EMD Millipore filter forcepsFisher ScientificXX6200006Pflat forceps for handling wet filter paper
C12 558/568 BODIPYFisher ScientificD3835stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature
propidium iodide (PI)Fisher ScientificP3566stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Hoechst 33342Fisher Scientific62249stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)Fisher ScientificT668stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature
tissue perfusion chamberCell MicroControlsBT-1-18/BT-1-18BV [-SY]imaging chamber for injection or perfusion
2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG)Fisher ScientificN13195fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia
Olympus laser scanning confocal microscopeOlympusFV1000confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution
Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP)Sigma AldrichC2759experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM
miniature aspirator positionerCell MicroControlsFL-1for perfusion
perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holderWarner Instrumentsvariousfor perfusion

Referenzen

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  2. Ma, E., et al. Loss of Pde6 reduces cell body Ca2+ transients within photoreceptors. Cell Death Dis. 4 (9), e797(2013).
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