Therapie, die Tests in einem Sphäroid-basierten 3D Kultur Zellmodell für Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Evolution ein Sphäroid-basierte, dreidimensionales in Vitro -Modell, das uns ermöglicht, den aktuellen Stand der experimentellen Therapie-Schemata für Kopf und Nacken Squamous Zelle Krebsgeschwür auf Zelllinien, testen, zur Bewertung der Therapie Empfänglichkeit und Resistenz auf primäre Zellen aus menschlichen Proben in der Zukunft.

Zusammenfassung

Aktuelle Behandlungsmöglichkeiten für Fortgeschrittene und wiederkehrende Kopf- und Nacken Squamous Zelle Krebsgeschwür (lokal) umschließen Strahlen- und Chemo-Bestrahlung Ansätze mit oder ohne Operation. Während Platin-basierten Chemotherapie-Regimen derzeit stellen den Gold Standard in Bezug auf die Wirksamkeit und sind in der überwiegenden Mehrzahl der Fälle, neue Chemotherapie-Regimen gegeben nämlich Immuntherapie entstehen. Die Response-Raten und Therapie Resistenzmechanismen für entweder Chemo-Therapie sind jedoch schwer zu prognostizieren und bleiben nur unzureichend verstanden. Breitere Variationen von Chemo- und Strahlentherapie Resistenzmechanismen sind bisher bekannt. Diese Studie beschreibt die Entwicklung eines standardisierten, Hochdurchsatz- in-vitro- Assays als zukünftige Werkzeug für personalisierte Tumor lokal Zelllinie Reaktion auf verschiedene Therapie-Schemata, und hoffentlich auf Primärzellen von einzelnen Patienten einzuschätzen Therapie. Der Test wurde entwickelt, um die qualitätsgesicherte Standardalgorithmus für lokal Patienten in unserem Center tertiäre Versorgung integriert wird; Dies wird jedoch Gegenstand zukünftiger Studien sein. Technischer Machbarkeit sieht vielversprechend aus für primäre Zellen vom Tumor Biopsien von tatsächlichen Patienten. Proben werden dann in das Labor übertragen. Biopsien werden mechanisch getrennt, gefolgt von enzymatischen Verdauung. Zellen werden dann in extrem niedrige Adhäsion Zelle Kultur Fläschchen kultiviert, die reproduzierbare, standardisierte und spontane Bildung von dreidimensionalen, Sphäroid-förmige Zelle Konglomerate zu fördern. Sphäroide sind dann bereit, Chemo-Bestrahlung Protokolle und Immuntherapie Protokolle nach Bedarf ausgesetzt werden. Die endgültige Zellengröße Lebensfähigkeit und Sphäroid sind Indikatoren für Therapie-Anfälligkeit und konnte daher in Betracht in Zukunft zu beurteilen, die Patienten wahrscheinlich therapieantwort gezogen werden. Dieses Modell könnte eine wertvolle, kostengünstige Instrument für personalisierte Therapie bei Kopf-Hals-Tumoren.

Einleitung

Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür (lokal) ist die sechsthäufigste Krebsart weltweit mit einer steigenden Inzidenz von Schleimhaut human Papilloma Virus (HPV) Infektion-assoziierten Pathogenese, neben den meisten Fällen verursacht durch übermäßigen Nikotin- und Alkoholkonsum Verbrauch ^1,2. Während kleinere Tumoren und vor invasiven Stadien in der Regel gut behandelbar mit chirurgische Exzision sind, in der Regel kombiniert mit zervikalen Lymphknoten Dissektion, bleibt die Behandlung für fortgeschrittenen und wiederkehrende lokal schwierig wegen aggressiven Tumorinvasion mit Metastasierung und Resistenz gegen Strahlung und Chemotherapie-Protokolle^3,4,5,6,7,8. Neuere Studien legen nahe, eine hohe Variabilität des zellulären Phänotyps und Sub-Charakterisierung von zirkulierenden und disseminierter Tumorzellen hat gerade erst begonnen,^9,10. Der frühere glaube eines festen, einheitlichen Tumors Masse musste in der Vergangenheit im Lichte der jüngsten Studien revidiert werden Jahre^11,12,13,14. Aktuelle Ansätze zur Tumor-Charakterisierung und Identifizierung der wichtigsten Mutationen konnten mehrere Gene identifizieren, die scheinen zu Therapieresistenz zugeordnet werden, sondern bleiben eine kostenintensive Ansatz. Kenntnisse des Genotyps ermöglicht darüber hinaus nicht notwendigerweise eine zuverlässige Vorhersage der Phänotyp und den Behandlungserfolg.

Es wurden einige Fortschritte bei der Verbesserung der allgemeinen und krankheitsfreien Überleben für die fortgeschrittenen und wiederkehrende Krankheit. Für Nikotin - sowie Virus-assoziierten Karzinomen beilegen aktuelle Behandlungsoptionen neben Chirurgie aggressive Strahlung und Platin-basierten Chemotherapie-Regimen. Es wurden Auswirkungen auf die verschiedenen Response-Raten zwischen HPV-negativen und positiven Karzinom; aber dies ist noch nicht führen zu einer Veränderung im allgemeinen Therapierichtlinien. Resistenz gegen Strahlung und Chemotherapie ist ein weit verbreitetes Phänomen in allen Tumorstadien und existiert für Platin-basierten Chemotherapie sowie zielgerichtete Therapie (Anti-EGFR; epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor) und vor kurzem neue Checkpoint Hemmung¹⁵. Unwirksame Strahlen- und Chemotherapie kommen zu einem hohen Preis von erheblichen geduldigen Morbidität bei Dysphagie, Mukositis, Mundtrockenheit und Risiko der Abnahme der Nieren- oder kardiale Funktion unter anderem. Vorhersage der Reaktion vor der Therapie scheint die Entscheidung des allgemeinen Therapiekonzept für jeden einzelnen Patienten das entscheidende Ziel, verhindern unnötige Behandlungskonzepte, Nebenwirkungen und Kosten.

Wir versuchten, ein Modell des einzelnen Patienten Behandlung Anfälligkeit gegenüber aktuellen standard Chemo-Bestrahlung zu testen, der in der regulären und qualitätskontrollierten onkologischen Behandlung Algorithmus von einem technischen Stand Punkt integriert werden konnte. Ferne Ziel war es, das Modell ohne verwenden stark verändert und im Alter von Zelllinien, wie schlecht sie tatsächlichen menschlichen Tumorzellen ohne ihre Variabilität vertreten und Heterogenität wie wir jetzt, während der Einrichtung des Protokolls Wissen in verschiedenen Zelllinien erfolgte. Um nur von im Handel erhältlichen Zelllinien unabhängig zu sein, erzielten wir kürzlich erfolgreich eine mittlere Zell-Linie namens "PiCa" aus primären lokal Zellen aus menschlichen Tumor Proben mit konservierten zellulären Marker auf seine Oberflächen und begrenzte Passagen ¹⁶. this PiCa-Zell-Linie soll dazu dienen als Vorbereitung für die Entwicklung des Modells auf die Straße, dann später nach Prozessen mit frischem menschlichen Krebszellen vom Tumor Biopsien. Es hat sich gezeigt, dass Zellen in dreidimensionale Zelle Kulturen unterschiedlich reagieren und mehr in-Vivo-gerne Verwaltung von Krebs-Medikamente als die wachsende Monolagen^{17,18,19,20 ,21}, vor allem auf Erhaltung der wandernden und Sub Differenzierung Eigenschaften von bestimmten Zelle Teilmengen^22,23,24. Hier beschreiben wir das Protokoll ein Sphäroid-basierte, dreidimensionales Modell von intermediate Zelllinien und primären menschlichen Plattenepithelkarzinom Zellen und Möglichkeiten wie ein solches Modell in Krebsbehandlung von Kopf-Hals-Chirurgen und Onkologen ( integrieren Abbildung 1).

Protokoll

Alle Studien, die in dieser Handschrift, nämlich die Verwendung von menschlichen Tumor Proben dargestellt sind unter und in Zustimmung mit früheren Entscheidungen von Universität Medizin der Universität Mainz/Munich Medical Center Ethikkommission geschützt. Patienten erhielten Einwilligung gemäß nationalen gesetzlichen Bestimmungen, die Zustimmung zur wissenschaftlichen Nutzung der überschüssigen biologisches Material, das im Laufe ihrer Behandlung abgerufen wurde. Forschung wurde in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationale und internationale Richtlinien für menschliches Wohlergehen durchgeführt.

1. nehmen eine Tumor-Biopsie von Kopf und Heck Squamous Zelle Krebsgeschwür

1. Allgemein (Propofol und/oder Sevofluran, Muskel entspannende Agent) oder lokale Infiltration (2 % Ultracaine, Adrenalin) ausführen / surface (Xylocain) Anästhesie im OP-Saal oder HNO Untersuchungsstuhl. Visualisieren Sie die Tumor-Masse in mündlichen Hohlraum/Rachen/Kehlkopf/andere Teile des oberen Verdauungs- und Atemwege Trakt mit normalen Betrieb Instrumente und ggf. unter die Lupe genommen.
2. Nehmen Sie eine frische Tumor-Biopsie von der Peripherie der Krebsartigen Läsion mit stumpfen oder Spitzen Instrumenten. Vermeiden Sie das Zentrum der Läsion durch reichlich Nekrose in diesem Bereich. Setzen Sie die erhaltenen Gewebe in einen sterilen Behälter mit isotonische Natriumchlorid-Lösung.
3. Nach der Biopsie durchführen Blutstillung nach Bedarf, zB., mit einem bipolaren oder monopolaren Koagulation Gerät neben dem Einsatz von vasokonstriktorische Substanzen.
4. Bringen Sie die Tumor-Biopsie für Zellexperimente Kultur direkt mit dem angrenzenden Labor-Trakt verwendet werden soll. Senden Sie anderen Tumor Biopsien an der Pathologe wie üblich um Krebs auszuschließen.
5. Stellen Sie sicher, dass ein Labortechniker bereit, die Probe direkt zu verarbeiten ist.

2. Verarbeitung der Tumor-Probe

1. Die Tumor-Probe auf eine geeignete und sterile Oberfläche legen und gründlich mit einem sterilen Einweg-Skalpell in möglichst wenig Stücke schneiden.
   Achtung: Achten Sie darauf, der Status der Infektions- und Blut übertragbare Krankheiten ist gut dokumentiert und der Techniker ist in der Aufmerksamkeit der Institutionen standard Protokolle zu verhindern, dass Nadel-Stick oder schneiden Verletzungen mit potenziell Biohazard Patientenmaterial und die Protokolle, nach Verletzungen zu folgen.
2. Nach ausreichende mechanische Trennung der primäre Gewebe, das Gewebe in ein Fläschchen mit Collagenase genommen ich / II und 1 h bei 37 ° c inkubieren Durch ein Sieb durch ein 70 µm Falcon Zelle Sieb und waschen Sie die Suspension mit Hanks' Balanced Salzlösung (HBSS).
3. Legen Sie nach der erfolgreichen Trennung und anschließende waschen die Aussetzung mit 1 – 2 × 10⁶ Zellen in einem T75 Zellkulturflaschen (75 cm²), Sub-Konfluenz bei 5 % CO₂ und Temperatur von 37 ° c zu wachsen Dieser Schritt kann bis zu 10 Tage dauern.
   1. Verwenden Sie spezielle Keratinozyten Kulturmedium bestehend aus den folgenden: 125 mL Dulbecco modifizierten Adler Medium (DMEM), 250 mL von Keratinozyten ergänzt Medium (ergänzt Medium bestehend aus 500 mL Keratinozyten SF Medium, 15 mg bovine Hypophyse Auszug (BPE), 2,5 mL Penicillin/Streptomycin, 150 ng rekombinanten menschlichen epithelialen Wachstumsfaktor (EGF), 516 µL von 300 mM CaCl₂, Lager Mix im Voraus vorbereitet werden), 125 mL F12 Nährstoff-Mix, 10 mg BPE (0,75 mL), 75 ng rekombinanten menschlichen EGF (2 µL) , 3,75 mL 200 mm L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid (Tabelle der Materialien).

(3) Aussaat die Zellen in ultra-geringe Haftung Zellplatten Kultur

1. Zelle Wachstum des Tumors unter dem Mikroskop zu bestätigen. Zählen der Zellen in der Kultur (primäre oder Zellkultur) und Samen 5.000 Primärtumor oder 1.000-2.000 Zellen der mittleren Zelllinie / andere Zellinie in 200-300 µL der Medien (Schritt 3.2.) in eine extrem niedrige Adhäsion Platte mit konkaven, Runde Böden (96-Well).
2. Kultur der Zellen um 5 % CO₂ bei 37 ° C und in gleichen Teilen DMEM und Atemwege Epithelzelle Medium (BEGM), fetale Rinderserum 10 %, 1 % Penicillin/Streptomycin, 1 % Natrium Pyruvat, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 % L-Glutamin (Schritt 2.3.). Zell-Linien verwendet werden, reicht Medien auf der Grundlage von DMEM.
   1. Führen Sie Medien Änderungen jeden zweiten Tag. Achten Sie nicht auf das Sphäroid mit der Pipette während Medien Änderungen Aspirieren. Kultur der Sphäroide bis das Niveau des Wachstums, wie beschrieben in 3.3 (ca. 7-10 Tage) erreicht ist.
3. Bestätigen Sie spontane Sphäroid Bildung unter dem Mikroskop durch dreidimensionale, Sphäroid-förmige Zelle Konglomerate suchen. Der Brunnen mit unregelmäßigen und/oder mehrere Sphäroid Bildung von weiteren Untersuchung ausschließen.
   Hinweis: Sphäroide sollte mit dem bloßen Auge sichtbar sein, Erleichterung der Weiterverarbeitung und Medien Änderungen wie unten beschrieben.

(4) freilegen Sphäroide zu multimodalen Standard- oder experimentelle Tumortherapie

1. Wählen Sie eine gewünschte Therapie Therapie. Ausreichend große Kontrollgruppen, die Vergleiche von Behandlungen zu unbehandelten Sphäroide oder Sphäroide empfangen nur teilweise Therapie-Schemata, z.B.zu entwerfen. Bestrahlung allein. Die Größe der Kontrollgruppen hängt vom experimentellen Gruppe Entwurf und nicht allgemein definiert werden.
2. Tauschen Sie die Medien Medien mit Zusätzen, Bedeutung Medien mit Chemotherapeutika und/oder monoklonalen Antikörpern bei gewünschten Konzentrationen. Fügen Sie Cisplatin in den Konzentrationen von 2,5/5/10 µM oder 5-Fluoruracil (5FU) auf 30 µM.
   Hinweis: Für Hochdurchsatz Experimenten oder große Gruppe Größen/große Anzahl von Gruppen, eine eine automatisierte Pipettierroboter können wie wir sind weiter in den Experimenten zu etablieren.
3. Alternativ Strahlen Sie Kultur Zellplatten mit Sphäroide bei 2 Gy mit einer geeigneten Strahlung-Anlage.
   Achtung: Respektiere die Institution Protokolle zur Vermeidung von schädlichen Strahlenbelastung der Mitarbeiter. Arbeiten Sie nur mit ausgewiesenen und geschulte Techniker nach Strahlung-Datenschutz-Richtlinien. Falls gewünscht, fügen Sie Chemotherapeutika wie unter 4.2 beschrieben. danach.
4. Inkubieren Sie die Zellen für 24 h im zuvor beschriebenen Kulturbedingungen (37 ° C, Schritt 3.2).
5. Nach der Inkubation weiter die Zellkultur für mindestens 6 Tage mit Medien Änderungen jeden zweiten Tag.

5. Bewertung der Sphäroid Umfang und Ausmaß der Zellproliferation für Assay auslesen

1. Messen Sie die Sphäroid Größe flächenmäßig nach digitale Fotodokumentation am 6. Tag (Tag 10, 16. Tag) mit einer Grafik-Software (Parameter 1).
2. Entfernen Sie nach der Zentrifugation bei 520 X g 2,5 min der Platte des Überstands. Waschen Sie die Zellen mit ausreichender Menge 1 x PBS und Zentrifuge, die die Platte wieder wie beschrieben, gefolgt von der Überstand (PBS) entfernen.
3. Jedes Fläschchen erlauben die Sphäroide auflösen fügen Sie 100 µL der enzymatischen Zelle Ablösung Lösung hinzu. Inkubieren Sie die Platte für 8 min bei 37 ° c
4. Überprüfen Sie für die erfolgreiche Auflösung des sphäroids unter die Lupe genommen. 100 µL DMEM hinzufügen. Zentrifugieren der Platte bei 520 X g 2,5 min. Entfernen des Überstands und Zellen in 100 µL DMEM auszusetzen.
5. Führen Sie einen handelsüblichen farbmetrischen Verbreitung-Assay im Beispiel WST-8 Assay auf jedes Fläschchen gemäß des Herstellers Anweisungen²⁵. Der Test in einem Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) Reader (Parameter 2) ausgelesen.

Ergebnisse

Wir konnten reproduzierbar Sphäroide aus einzelnen Zellsuspensionen, zuerst aus verschiedenen Zelllinien, die proprietäre PiCa-Zelllinie, später aus primären menschlichen Krebszellen, die aus frischen Tumor Biopsien abgeleitet, wie in Hagemann Et al. beschrieben einschließlich generieren . ²⁶. wir werteten zwei bewährte Methoden für Sphäroid Generation; die zwei sind die so genannten hängenden Tropfen (HD) und der extrem niedrige Adhäsion (ULA) M...

Diskussion

Wir waren in der Lage, ein Protokoll, um reproduzierbare Sphäroide aus Zellsuspensionen, für beide Zelllinien und in Vorversuchen, primären menschlichen Tumorzellen zu generieren. Wir zunächst zwei zuvor beschriebene Methoden bewertet und identifiziert die ULA-Methode, eine Methode wo Kultur Platten mit ultraniedriger Klebeflächen verwendet werden, um für die Generation der einheitlichen dreidimensionalen Sphäroide die sicherer und zuverlässiger ist. Durch die Kombination von zwei separate Methoden für Assay aus...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM)	Biochrom, Berlin, Germany	F 0425
Fetal bovine serum	Gibco Life Technologies, Paisley, UK	10500-064
penicillin/streptomycin	Biochrom, Berlin, Germany	A2212
sodium pyruvate	Biochrom, Berlin, Germany	L0473
non-essential amino acids	Biochrom, Berlin, Germany	K0293
L-Glutamine	Biochrom, Berlin, Germany	K0293
Liberase	Roche Life Sciences, Basel, Switzerland	5401127001
GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform	InSphero, Schlieren, Switzerland	PB-CS 06-001
GravityTRAP plate	InSphero, Schlieren, Switzerland	PB-CS-01-001
Ultra-low attachment (ULA) culture plates	Corning, Corning, NY, USA	4520
airway epithelial cell growth medium	Promocell, Heidelberg, Germany	C-21060
amphotericin B	Biochrom, Berlin, Germany	A 2612
airway epithelial cell growth medium supplement mix	Promocell, Heidelberg, Germany	C39165
WST-8 test	Promocell, Heidelberg, Germany	PC PK-CA705-CK04
Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL	Invitrogen	#17005-034
Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg	Invitrogen	#37000015
Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg	Invitrogen	#37000015
DMEM High Glucose	Invitrogen	#21068-028
Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin	Invitrogen	#15140-122
F12 Nutrient Mix	Invitrogen	#21765-029
Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl)	Invitrogen	#35050087
HBSS (Ca, Mg)	Life Technologies	#14025-092	(no phenol red)
1x TrypLE Expres Enzyme	Invitrogen	#12604-013	(no phenol red)
Accutase (enzymatic cell detachment solution)	Innovative cell technologies	Cat# AT104
70 µm Falcon cell strainer	BD Biosciences, USA	#352350