Herstellung und Reinigung des Baculovirus für Gentherapie Anwendung

Zusammenfassung

In diesem Protokoll wird Baculovirus von Transiente Transfektion von Baculovirus Plasmid in Sf9 Zellen produziert und verstärkt in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR. Der Überstand wird durch Heparin Affinitätschromatographie gereinigt und weiter durch Ultrazentrifugation konzentriert. Dieses Protokoll eignet sich für die Herstellung und Reinigung des Baculovirus für Gen-Therapie Anwendung.

Zusammenfassung

Baculovirus wurde traditionell für die Produktion von rekombinanten Proteinen und Impfstoff eingesetzt worden. Allerdings ist vor kurzem Baculovirus als vielversprechende Vektor für Gen-Therapie-Anwendung entstehen. Hier entsteht Baculovirus durch Transiente Transfektion von Baculovirus Plasmid DNA (Bacmid) in einer haftfesten Kultur Sf9 Zellen. Baculovirus wird anschließend in Sf9 Zellen in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR erweitert, bis das gewünschte Volumen erreicht ist. Es wird dann von der Kultur überstand mit Heparin Affinitätschromatographie gereinigt. Virus Überstand wird auf die Heparin-Spalte die Baculovirus Partikel im überstand aufgrund der Affinität von Heparin bindet, denn Baculovirus Glykoprotein umhüllen geladen. Die Spalte wird gewaschen, mit einem Puffer um Verunreinigungen zu entfernen und Baculovirus ist aus der Spalte mit einem hohem Salzgehalt Puffer eluiert. Das Eluat wird verdünnt, um eine isotonische Salzkonzentration und Baculovirus Partikel sind weitere Verwendung Ultrazentrifugation konzentriert. Mit dieser Methode können Baculovirus bis zu 500-fold mit einer 25 % Erholung der infektiöse Partikel konzentriert werden. Obwohl das hier beschriebene Protokoll die Herstellung und Reinigung von der Baculovirus aus Kulturen bis zu 1 L zeigt, die Methode kann in ein geschlossenes System SUSPENSIONSKULTUR, klinische Grade Vektor für Gen-Therapie-Anwendung zu produzieren Aufstockung werden.

Einleitung

Baculovirus dient in erster Linie für die Produktion von rekombinanten Proteinen und Impfstoffe in Lepidopteran Spodoptera Fugiperda (Sf) 9 Insektenzellen mittels rekombinanter Autographa Californica multicapsid nuklearen Polyhedrosis Virus (AcMNPV) ^{1 , 2 , 3 , 4}. vor kurzem, es erweist sich als eine vielversprechende Vektor für Gen-Therapie Anwendung⁵. Es ist bekannt, dass eine breite Host und Gewebe Tropismus, Ruhestrom und wuchernde Zellen infiziert ist apathogen und integriert nicht in die Host-Chromosom^4,5,6. Darüber hinaus können Baculovirus in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR hergestellt werden, die ist skalierbar und geschlossenes System für zukünftige klinische Produktion¹Verarbeitung ermöglicht.

Die Reinheit des Baculovirus Partikel ist wichtig zur Erreichung effektiven Transduktion bei gleichzeitiger Minimierung der Zytotoxizität^7,8,9. Baculovirus können durch Ultrazentrifugation oder tangential-Flow Filtration (TFF) mit geringen Auswirkungen auf seine Infektiosität konzentriert werden. Diese Verfahren nicht nur konzentrieren Viruspartikel aber auch zelltrümmer und Proteine aus Sf9 können induzieren Entzündungen oder eine Immunantwort bei Kultur, die giftige in Vitro (persönliche Beobachtung) kann in Vivo. Um dies zu vermeiden, vor allem, wenn mit Virus Aktien konzentriert, muss infektiöse Baculovirus gereinigt und von kontaminierenden Partikel getrennt werden.

Verschiedene Methoden wurden für die Reinigung und Konzentration der Baculovirus Vektoren^10,11,12berichtet. Von den verfügbaren Ansätzen ermöglicht Heparin Affinitätschromatographie Einzelschritt hohem Niveau der Reinigung mit der niedrigen Konzentration der kontaminierende Proteine¹². Die Methode basiert auf der Identifikation des Heparan Sulfat als Rezeptor für Baculovirus^13,14. Nach dem Laden Sf9 Zelle überstand auf die Spalte und die Bindung des Baculovirus, waschbar die Spalte mit physiologischen (Isotone) Puffer ungebunden oder lose gebundenen verunreinigende Partikel zu entfernen. Da die Bindung an Heparin umkehrbar ist, können Baculovirus Partikel mit einem hohen Salz Puffer eluiert die physiologischen (Isotone) Salzkonzentration zu verhindern, dass die Inaktivierung durch osmotischen Schock¹²sofort verdünnt wird. Darüber hinaus kann die Produktion von Baculovirus sowie Erfassung auf und Elution von der Chromatographiesäule erfolgen über ein geschlossenes System-Prozess, der mit aktuellen gute Herstellungspraxis (cGMP) kompatibel ist.

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Herstellung, Reinigung und Konzentration von infektiösen Baculovirus mittels Affinitätschromatographie und Zentrifugieren. Kurz, wir produzieren Baculovirus durch Transfektion von Sf9 Zellen mit einem Baculovirus Plasmid DNA in adhärenten Kultur und die infektiöse Baculovirus in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR weiter ausbauen. Wir reinigen mit Heparin Affinitätschromatographie Baculovirus und mit Ultrazentrifugation als letzten Schritt hoch den Vektor für Gen-Therapie-Anwendung konzentrieren.

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Protokoll

Siehe Abbildung 1 zur Veranschaulichung einer Zusammenfassung des Protokolls.

1. Reinigung des Baculovirus Plasmid DNA

1. Bakterienkultur mit Baculoviral Plasmid DNA (Bacmid)¹⁴ in 200 mL LB-Brühe mit Antibiotika zu wachsen; Kanamycin (50 µg/mL), Tetracyclin (10 µg/mL) und Gentamycin (7 µg/mL), 16 h bei 37 ° C auf einem Orbitalschüttler Einstellung bei 300 Umdrehungen pro Minute.
2. Reinigen der Bacmid DNA aus der Bakterienkultur mit standard alkalische Lyse Protokoll¹⁵, und lösen sich die Bacmid in TE-Puffer.

2. Herstellung von Baculovirus

1. Kultur Sf9 Zellen in einem Orbitalschüttler Inkubator bei 135 min und 28 ° C in einem Polycarbonat Erlenmeyerkolben mit serumfreien Insekt Kulturmedium^1,2,3.
   Hinweis: Wenn Sf9 Zellen aus gefrorenen bestand aufgetaut sind, erlauben Sie mindestens zwei Wochen für die Zellen zu erholen und geben die exponentielle Wachstumsphase.
2. Zählen Sie die Sf9 Zellen geerntet exponentiellen Wachstumsphase mit einer Hemocytometer nach der Färbung mit Trypan blau. 1 x 10⁶ tragfähige Sf9 Samenzellen pro Bohrloch in einer 6-Well Gewebekultur imprägnierte Platte in 2 mL Medium. Lassen Sie die Zelle für 1 h bei 28 ° C im Brutschrank befestigen.
3. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium mit 1 mL Serum-freie unsupplemented Grace Insekt Kulturmedium.
4. Transfizieren Sie die Bacmid DNA in die Sf9 Zellen mit Insekt Zelle Transfection Reagens.
   1. Mix 8 µL Insekt Zelle Transfection Reagens mit 100 µL Graces Insekt Medium.
   2. 2 µg DNA Bacmid in 100 µL unsupplemented Insekt Medium verdünnen und mischen durch aufschütteln.
   3. Die verdünnte DNA mit der verdünnten Insekt Zelle Transfection Reagens zu kombinieren, und vorsichtig mischen. 15 bis 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   4. Fügen Sie die DNA-Lipid-Mischung tropfenweise auf die Zellen. Inkubation bei 28 ° C im Brutschrank für ca. 5 h.
5. Entfernen Sie die Transfektion Mischung aus den Zellen zu und waschen Sie die Zellen mit 2 mL PBS.
6. Fügen Sie 2 mL Insekt Kulturmedium und Kultur bei 28 ° C im Brutschrank ohne die Medien weiter.
   Hinweis: Wenn die Bacmid ein fluoreszierendes Protein enthält, kann seinen Ausdruck in Zellen 48 h nach Transfektion erkannt werden. Baculovirus ist von transfizierten Sf9 Zellen produziert und abgesondert in das Kulturmedium, das anschließend die untransfected Zellen infiziert. Die gesamten Zellpopulation mit Baculovirus in 5 Tagen infiziert und zeigt Anzeichen einer Virusinfektion, auch genannt zytopathischen Effekt. Dazu gehören erhöhte Zelle Durchmesser, Vakuolen/Granulat im Zytoplasma, Einstellung des Zellwachstums und tot oder lysierten Zellen in Zellkultur vorhanden sind. Allerdings, wenn die Transfektion oder Infektion Effizienz nicht optimal ist, kann die Kultur keinen offensichtlichen zytopathischen Effekt zeigen. Zytopathischen Effekts kann mit einem inversen Phase Mikroskop bei 200-400 X Vergrößerung dargestellt werden. Baculovirus infizierte Zelle kann durch Färbung mit Anti-gp64 Antikörper¹¹nachgewiesen werden.
7. Ernten Sie Baculovirus überstand 5 Tage nach Transfektion und Label als P₁ Virus bestand.
8. Speichern Sie das Baculovirus überstand, ist lichtempfindlich, in der Dunkelheit mit 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS. Bei 4 ° C für die kurzfristige (bis zu 90 Tagen) oder bei-80 ° C langfristig zu speichern.
9. 6 × 10⁶ Sf9 Samenzellen in einer 10 cm Gewebekultur imprägnierte Platte in 10 mL Insekt Kulturmedium. Fügen Sie 1 mL der ursprünglichen Baculovirus überstand (P₁) zu den Zellen.
10. Baculovirus überstand (P₂) am 5^ten Tag nach der Infektion zu ernten.
11. Samen 50 mL Sf9 Zellen (3 x 10⁶ Zellen/mL) in SUSPENSIONSKULTUR im Insekt Nährmedium in einem 250-mL-Polycarbonat Erlenmeyerkolben und Stelle die Flasche in einem Orbitalschüttler Inkubator. Die Zellen 2 mL P₂ Lager hinzu und schütteln bei 135 u/min unter Beibehaltung einer konstanten Temperatur von 28 ° C.
    Hinweis: Drei oder vier Tage nach der Infektion zeigen die gesamte Sf9 Zellpopulation zytopathischen Effekt, die ein für hohe Titer Baculovirus Produktion Indiz.
12. Baculovirus Überstände sequentiell zu verstärken, bis die gewünschte Lautstärke (P₃, P₄,...) entsteht durch die Erhöhung von 10 bis 50-fold Volumen der Zellkultur in jede nachfolgende Infektion.
    Hinweis: P₃ ist die 3^rd Runde der Infektion in die 500 mL bis 1 L Sf9 Zellkultur mit 10 bis 20 mL P₂ Baculovirus überstand infiziert werden kann; P₄ ist die 4^th Runde der Infektion in die 5 bis 10 L Sf9 Zellkultur mit 100 bis 200 mL P₃ Baculovirus überstand usw. infiziert werden kann. In der Regel sind bei 3 × 10⁶ Zellen/mL in serumfreien Insekt Kulturmedien Sf9 Zellen ausgesät.
13. Zentrifugieren Sie das Baculovirus Überstand bei 1.000 x g für 30 min bei 4 ° C zu entfernen zelltrümmer und behandeln das Baculovirus überstand mit 50 Einheiten/mL Nuklease (250 Einheiten/µL Lager) für 2 h bei 37 ° C, die genomische DNA und RNA zu verdauen. Filtern Sie die Überstände durch einen 0,45-μm-Filteranlage.

3. Vorbereitung des Systems der Chromatographie

1. Bereiten Sie des Chromatographie-Systems durch nacheinander die Probe und Puffer Linien jeweils mit sterilem Wasser, 1 N Natriumhydroxid, Wasser spülen vor und waschen Sie Puffer (20 mM Natriumphosphat Puffer mit 150 mM Natrium-Chlorid, pH 7,0) mit einer linearen Durchflussrate von 50 mL/min.
2. Bereiten Sie eine Heparin 50 µm Spalte (10 × 10 cm, 7,9 mL Spalte Volumen (CV)), indem sequenziell ausgeführt Spalte Reinigung Puffer (5 CV steril 20 mM Natriumphosphat Puffer mit 2 M Natrium-Chlorid, pH 7,0) und 5 CV Waschpuffer mit einer linearen Durchflussrate von 7 mL/min.

4. Reinigung des Baculovirus Vektor

1. Die Chromatographie-System wie folgt einrichten:
   1. Anhand des Beispiels laden Einlassöffnung für laden das Baculovirus überstand.
   2. Verwenden Sie die Puffer Einlassstutzen A1 für das Laden der Waschpuffer. Bereiten Sie eine Flasche mit mindestens 500 mL Waschpuffer und platzieren Sie die Waschanlage Puffer in die Flasche.
   3. Verwenden Sie die Puffer Einlassstutzen A2 für Ladepuffer Elution (20 mM Natriumphosphat mit 1,5 M Natrium-Chlorid, pH 8,0). Bereiten Sie eine Flasche mit mindestens 500 mL Elution Buffer und platzieren Sie die Elution Buffer Zeile in die Flasche.
   4. Legen Sie mehrere 50 mL konische Röhrchen in Fraktionssammler die Spalte Pass-Through-Baculovirus überstand zu sammeln, die Waschpuffer und der eluierten Baculovirus.
2. Equilibrate der Heparin-Spalte mit fünf 7,9 mL Spalte Volumen (CVs) von Waschpuffer (40 mL) mit einer linearen Durchflussrate von 7,0 mL/min.
3. 250 mL Baculovirus überstand auf die Heparin-Säule mit der Probe-Pumpe (Probe Einlassstutzen) Chromatographie-Systems bei einer linearen Durchflussrate von 2,0 mL/min zu laden.
4. 10 CVs (80 mL) der Waschpuffer durch Heparin-Spalte mit einer linearen Durchflussrate von 2,0 mL/min bis die ultravioletten (UV) Absorption Kurve laufen (280 nm) zu Grundlinie zurückgekehrt und wird stabil.
5. Eluieren Sie Baculovirus Partikel aus der 7,9 mL Heparin Spalte mit 5 CVs (40 mL) der Elution Puffer bei einer linearen Durchflussrate von 4,0 mL/min Uhr für ein scharfes Elution Peak von Protein auf dem Chromatogramm, wenn die Baculovirus-Teilchen aus der Spalte "Heparin" distanzieren.
6. Post-Elution sofort verdünnen den eluierten Baculovirus überstand 10-fach mit 20 mM-Natrium-Phosphat-Puffer im Wasser um Inaktivierung von Baculovirus Partikel aus osmotischen Schock bei der anschließende Zentrifugation zu verhindern.
7. Speichern von 100 µL der einzelnen Fraktionen, einschließlich der Spalte durchströmten während des Ladens der Baculovirus überstand, der Waschpuffer und das Eluat gesammelt. Infizieren Sie diese Baculovirus-Fraktionen, HT1080 um den Reinigungsprozess (siehe Abschnitt 6) zu bewerten.
8. Reinigen Sie die Spalte mit Spalte Reinigung Puffer und Waschpuffer. Zu guter Letzt spülen Sie die Spalte mit 5 CV steril 20 % Ethanol in Wasser mit einer linearen Durchflussrate von 7,0 mL/min und bei 4 ° c Lagern
9. Reinigen Sie die Chromatographie-System mit Wasser, 1 N Natriumhydroxid, nochmals mit Wasser, und 20 % Ethanol in Wasser mit einer linearen Durchflussrate von 50,0 mL/min und Lagern Sie das System in 20 % Ethanol.

5. Konzentration des Baculovirus

1. Pre-Sterilisieren Sie Zentrifugen-Röhrchen mit einem Autoklaven. Jede Ultrazentrifugen Rohre in einer Gewebekultur Haube ein gleiches Volumen des Baculovirus überstand hinzufügen. Messen Sie das Rohr Gewicht, indem Sie ein Gleichgewicht und stellen Sie das Gewicht des Inhalts der Ultrazentrifuge Rohre mit sterilen PBS.
2. Platzieren Sie jedes der Ultrazentrifuge Rohre gegen Eimer des Rotors SW 32 Ti.
3. Ausführen der Ultrazentrifuge bei 80.000 × g für 90 min bei 4 ° C.
4. Öffnen Sie der Ultrazentrifuge Rohre in einer Gewebekultur Kapuze und aseptisch Aspirieren Sie die Flüssigkeit ohne das Baculovirus Pellet.
5. Aufzuwirbeln Sie das Pellet jedes Rohr durch pipettieren kräftig nach oben und unten mit 200 µL PBS mit 0,5 % (w/Vol) BSA.
6. Die konzentrierte Baculovirus auf Cryovials (50 bis 100 µL pro Fläschchen) übertragen und speichern bei-80 ° C.

6. die Titration des Baculovirus

1. Zählen Sie am Tag vor der Infektion, HT1080 Zellen unter Verwendung eines Hemocytometer nach der Färbung Zellen mit Trypan blau. 1 x 10⁵ HT1080 Samenzellen pro Bohrloch in einer 6-Well-Platte in 2 mL der Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS). Samen mehrere zusätzliche Brunnen, die genaue Anzahl der Zellen zum Zeitpunkt der Infektion bestimmen zu können. Kultur der Zellen in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO₂.
   Hinweis: HT1080 Zellen sind für die Titration verwendet, da sie ein höheres Maß an Heparan Sulfat im Vergleich zu den anderen Zelle Linien¹⁶zum Ausdruck bringen. Da HT1080 Zellen anhaftend, Titration ist einfacher und weniger zeitaufwendig im Vergleich zu der traditionellen Sf9-basierte Titration.
2. Am Tag der Infektion bestimmen Sie die Anzahl der Zellen pro Bohrloch durch zählen von Zellen aus Brunnen. Infizieren Sie durch das Hinzufügen der verwässerte original Baculovirus beiseite vor Spalte Reinigung und mit Proben aus der Spalte durchströmten, Waschen und Elution Brüche hinterlegt hatte, die die Zellen. Bestimmen Sie für jede Probe die Verdünnung und Volumen empirisch basierend auf infektiöse Baculovirus Teilchen, und infizieren Sie jede Vertiefung in dreifacher Ausfertigung zu.
3. Analysieren Sie zwei Tage nach der Infektion, die Zellen für die Expression des Gens von Interesse. Zellen können mit einem Durchflusszytometer, wenn sie einer fluoreszierenden Proteins (z. B. GFP)^{17 Ausdruck}analysiert werden.
4. Der Titer (infektiösen Einheiten pro mL) basierend auf der Anzahl der Zellen zum Zeitpunkt der Infektion, der Verdünnungsfaktor und Prozentsätze der fluoreszierenden Proteins in den Zellen mit der Formel zu berechnen: (Anzahl der Zellen während der Infektion × Prozentsatz fluoreszierenden Proteins positive Zellen × Verdünnungsfaktor) / Volumen des Baculovirus in mL.
   Hinweis: Beispielsweise ist wenn die Gesamtzahl der Zellen pro Bohrloch zum Zeitpunkt der Infektion ist 1,2 × 10⁵, fluoreszierenden Proteins beträgt 5 %, der Verdünnungsfaktor 100, und das Volumen der verdünnten Baculovirus hinzugefügt ist 10 µL, die Titer 6 × 10⁷ infektiösen Einheiten (IE) /mL.

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Ergebnisse

Das Protokoll dargestellt ist in einem Flussdiagramm (Abbildung 1). Schritte umfassen die Transiente Transfektion von Sf9 Zellen mit Bacmid DNA Baculovirus anhaftende Kultur in einer Platte, die spätere Verstärkung in serumfreien SUSPENSIONSKULTUR, Nuklease Behandlung und Klärung durch Zentrifugation und Filtration herstellen, und die Reinigung mit der Heparin-Affinitätschromatographie gefolgt von Konzentration mit Ultrazentrifugation.

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Diskussion

Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt die Herstellung von Baculovirus in Sf9 Zellen in SUSPENSIONSKULTUR und Reinigung des Baculovirus mit einem Heparin-Affinitätschromatographie. Die Parameter, die in diesem Protokoll verwendeten den Ertrag maximieren und minimieren die Inaktivierung von infektiösen Baculovirus. Das Protokoll zur Verfügung gestellt hier zeigt, dass eine deutlich verbesserte Regeneration Baculovirus Teilchen im Vergleich zu Rückforderungen von anderen⁹erreicht.

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Akta Avant 150	GE Healthcare	28976337	Chromatography system
POROS Heparin 50 µm Column	ThermoFisher Scientific	4333414	Heparin column
Ultracentrifuge	Beckman-Coulter	Non-catalog item	Concentrates virus at high-speed
Polyallomer Ultracentrifuge tube	Beckman-Coulter	326823	Concentrates virus at high-speed
MaxQ 8000 orbital shaker incubator	ThermoFisher Scientific	Non-catalog item	Shaker for suspension culture
250 mL Erlenmeyer flasks	ThermoFisher Scientific	238071	Flask for suspension culture
1 L Erlenmeyer flasks	ThermoFisher Scientific	238072	Flask for suspension culture
Microscope (Olympus CKX41)	Olympus	Non-catalog item	Cell monitoring and counting
Table top centrifuge	ThermoFisher Scientific	75253839/433607	For clarification of Baculovirus supernatant
50 ml Conical tube	ThermoFisher Scientific	14-959-49A	For collection of Baculovirus supernatant
6-well plate	ThermoFisher Scientific	07-200-80	Tissue culture treated plate
10-cm plate	ThermoFisher Scientific	08-772E	Tissue culture treated plate
Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF	EMD-Millipore	SCHVU05RE	Filtration unit
Kanamycin	ThermoFisher Scientific	15160-054
Tetracycline	Sigma-Aldrich	T7660
Gentamycin	ThermoFisher Scientific	15750-060
Bac-to-Bac Vector Kit	ThermoFisher Scientific	10360-014	Baculovirus expression system
DH10B-T1R  Competent cell	ThermoFisher Scientific	12331-013	Competent cell for bacmid
TE buffer	In-house	Non-catalog item	10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0.
Plasmid Maxiprep kit	ThermoFisher Scientific	K2100-06	For bacmid purification
Sf9 Cells	ThermoFisher Scientific	11496-015	Insect cells
Grace’s Insect Cell Culture Medium	ThermoFisher Scientific	11605-094	Transfection medium
PBS	ThermoFisher Scientific	20012227	Washing cells, diluting samples
HyClone SFX-Insect cell media	GE Healthcare	SH30278.02	Serum-free insect cell growth medium
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014	Enzyme to degrade DNA and RNA
Baculovirus plasmid (bacmid) DNA	In-house	Non-catalog item	Bacmid for Baculovirus Production
Cellfectin II	ThermoFisher Scientific	10362	Transfection reagent for insect cells
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4737	Stabilizes Baculovirus
Cryovial	Thomas Scientific	1222C24	For storage of Baculovirus
HT1080 cell line	ATCC	CCL-121	Fibroblast cell line
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429	Growth media for cell lines
Wash buffer	In-house	Non-catalog item	20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride
Elution buffer	In-house	Non-catalog item	20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride
Column cleaning buffer	In-house	Non-catalog item	20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride
Sterile water	In-house	Non-catalog item	For Akta Avant cleaning
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	1.09137	For Akta Avant cleaning
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7073	For Akta Avant cleaning