Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll um zu zeigen, wie die Zelle Ladungszustand durch UV-Einwirkung auf bestimmte Bereiche, die mit dem Ausdruck des fluoreszierenden Proteins, Eos, in lebenden Tieren erreicht wird.

Zusammenfassung

Tierischen und pflanzlichen Gewebe besteht aus unterschiedlichen Populationen von Zellen. Diese Zellen interagieren im Laufe der Zeit zum Aufbau und Erhalt des Gewebes und können verursachen Krankheit wenn gestört. Wissenschaftler haben clevere Techniken um Eigenschaften und natürliche Dynamik dieser Zellen innerhalb von intaktem Gewebe zu untersuchen, zum Ausdruck bringen, fluoreszierende Proteine in Teilmengen von Zellen entwickelt. Jedoch erfordern manchmal Experimente mehr ausgewählten Visualisierung von Zellen im Gewebe, manchmal auf die einzelne Zelle oder Bevölkerung der Zellen Art und Weise. Um dies zu erreichen und Einzelzellen innerhalb einer Bevölkerung der Zellen zu visualisieren, haben Wissenschaftler einzellige Ladungszustand der fluoreszierende Proteine genutzt. Um diese Technik zu demonstrieren, zeigen wir hier wie UV-Licht auf eine Eos exprimierenden Zelle des Interesses an einem intakten, direkte Leben Zebrafisch. Wir Bild dann diese Photoconverted Eos⁺ Zellen 24 h später um festzustellen, wie sie im Gewebe verändert. Wir beschreiben zwei Techniken: einzelne Zelle Ladungszustand und Photoconversions der Bevölkerung der Zelle. Diese Techniken können verwendet werden, zu visualisieren, Zell-Zell-Interaktionen, Zelle-Schicksal und Differenzierung und Zelle Migrationen, so dass es eine Technik, die in zahlreichen biologischen Fragestellungen anwendbar ist.

Einleitung

Mehrere unterschiedliche Zellen interagieren, um aufzubauen und zu pflegen komplexe tierischen und pflanzlichen Geweben. Diese Zellen sind oft eingefügten und schwer zu unterscheiden von Nachbarn auf eine einzelne Zellenebene ohne Hochauflösende Mikroskopie, die Fixierung des Gewebes erfordern. Zu verstehen, wie diese Gewebe bilden, sind gepflegt und werden krank, es war jedoch wichtig, zu untersuchen, wie einzelne Zellen im Gewebe sind im Laufe der Zeit interagieren. Idealerweise benötigen diese Experimente die Kennzeichnung einzelner Zellen innerhalb eines Gewebes in einer nicht-invasive Weise ohne das Erfordernis einer Fixierung. Wissenschaftler haben jetzt zahlreiche Techniken, um diese Aufgabe^1,2,3,4zu erreichen entwickelt.

Die Entdeckung und Umsetzung von Quallen grün fluoreszierenden Proteins (GFP) wurde ein spannender Ansatz, der für die Kennzeichnung von verschiedenen Zellen in einem Gewebe Umwelt¹erlaubt. Mit zellspezifische Promotoren, ist es möglich, eine Teilmenge von Zellen genetisch zu wählen, die¹bezeichnet werden. Alternativ kann virale induzierte Expression von GFP vom Benutzer ausgewählte Ausdruck der GFP^3,4einsetzbar. Obwohl ziemlich nützlich, erlaubt vermittelten Genexpression der GLP nicht vom Benutzer ausgewählte Ausdruck in einer Teilmenge von Zellen im Gewebe; und virale Ausdruck der GFP, zwar vorteilhaft, kann invasive. Mit dem Aufkommen von GFP-Derivaten und clevere Techniken wie Brainbow verschiedene fluoreszierende Proteine mehr spärlich in den Geweben zum Ausdruck zu bringen ist es möglich, einzelne Zellen und die Interaktionen zwischen ihnen in komplexen Gewebe^2, zu visualisieren geworden. ⁵. jedoch diese Ansätze Zellen in einer zufälligen beschriften. Wenn das gewünschte Experiment erfordert Visualisierung einer einzelnen Zelle oder Population von Zellen, die durch den Versuchsleiter definiert ist, sind sie daher beschränkt. Mit solchen Experimenten wäre es vorteilhaft, ein genetisch ausgedrückt fluoreszierendes Protein zu haben, die manipuliert werden können, um in eine einzelne Zelle Art und Weise unterscheiden es von anderen Leuchtstofflampen und nicht fluoreszierenden Zellen.

Um dieses Ziel zu erreichen und die Zellbiologie einzelner Zellen innerhalb einer komplexen lebendes Gewebe zu visualisieren, nutzt die wissenschaftliche Gemeinschaft Einzelzelle Ladungszustand verschiedene fluoreszierende Proteine^6,7,8. Mit genetisch kontrolliert Ausdruck eines Photoconvertible Proteins (z.B. Eos, Kaede, etc.), die Übergänge von Grün auf rot fluoreszierenden UV ausgesetzt (488 nm) Licht, können wir eine einzelne Zelle unterscheiden, von seiner Eindringmittel beschrifteten Nachbarn^6,7,8. Dieser Ansatz nutzt eine Vorrichtung an unsere confocal Mikroskop das Licht von einem Laser-Stapel zu einer Beugung begrenzte Region of Interest kann direkt angeschlossen. Mit dieser Technik können wir entweder einzelne Zellen oder größere Populationen in einem frei definierbaren Weise^9,10,11beschriften. Die Technik ist minimal-invasiv im Vergleich zu einzelnen Zelle Injektionen von viralen GFP. Als ein Proof of Concept zeigen wir, dass wir Photoconvert einzelner Zellen in ein Ganglion im peripheren Nervensystem und Photoconvert größere Populationen wie Zellen befindet sich auf der Bauchseite des Rückenmarks^{9,10können, 11,12}. Wir können diese Photoconverted-Zell-Populationen 24 h später dann visualisieren, um Einblick in ihre Bewegung und Differenzierung während der Entwicklung.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden von der University of Notre Dame institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt.

1. Vorbereitung der Zebrafisch-Probe

1. Legen Sie einen erwachsenen Mann und einem Erwachsenen weiblichen Tg (Cabrio Protein) in einer Paarung Kammer pro Standardverfahren¹³. Verwenden Sie in diesem Manuskript Tg(sox10:eos) Fisch⁹ wegen Zugang aber andere transgenen Linien mit Photoconvertible Protein gleichermaßen genutzt werden kann. Richten Sie mehr als eine Kammer für den Fall, dass Fische nicht verlegen zu tun. Lassen Sie die Fische über Nacht in der Kammer verbleiben.
2. Sammeln Sie am nächsten Morgen Eiern in 100 mm Petrischalen. Eiern bis zu 24 h nach Befruchtung (hpf) Reifen vor dem Screening zu ermöglichen.
3. Wenn Tiere oben heterozygot für das Transgen waren, Filtersätze Bildschirm 24 hpf Gerichte für Tg(sox10:eos) + Embryonen mit 488 nm Lichtquelle und GLP auf dem sezierenden Mikroskop. Tg(sox10:eos) + Embryonen zu isolieren und zu 48 Reifen erlauben hpf.
4. Dechorionate Embryonen manuell mit einer Nadel oder Pinzette.
5. Bereiten Sie und Mikrowellen Sie-5 mL 0,8 % niedrig schmelzende Punkt Agarose-Lösung.
   1. Sobald Agarose kühl anfühlen wird, legen Sie 3-4 narkotisierten Tg (Sox10:eos) + 48 hpf Fisch in der Mitte von einem 10 mm Glas-Deckgläschen unten Petrischale.
   2. Fügen Sie genügend Agarose bedecken die Oberfläche des Deckglases, etwa 1 mL. Verwenden Sie eine Sonde Nadel, um Fisch auf ihren Seiten zu arrangieren. Lassen Sie Agarose zu festigen, um die Montage der Tiere zu gewährleisten. Es möglicherweise notwendig, ständig der Zebrabärbling neu zu ordnen, bis der Agar¹⁴erstarrt. Erstarrung dauert ca. 2 Minuten.
6. Nachdem die Agarose für 2 min erstarrt ist, fügen Sie langsam Embryo Medium mit 0,02 % Aminobenzoic Acid Ester (Tricaine), Schüssel, bis die Bodenfläche des Agar und Gericht untergetaucht ist. Dies sollte etwa 3 mL.

2. Mikroskop Montage und unkonvertierte Imaging

1. Öffnen Sie konfokale Software und wählen Sie die Erfassung und Fokus-Fenster [Abb. 1]. Wählen Sie unter das Aufnahmefenster imaging Lab-spezifische Konvertierungseinstellung unter der Einnahme Drop-down-Registerkarte [Abb. 1] einstellen. Hier wird die Lab-spezifische Einstellung genannt "Imaging-Fisch."
2. Probe auf konfokalen Umfang und bringen in den Fokus mit Kurs und Feineinstellung Knöpfe.
3. Öffnen Sie das Fenster und suchen Sie die gewünschte Region von Interesse (d.h. Dorsal Root Ganglien).
4. Wählen Sie die c488 Laser im Menü Filter setzen. Stellen Sie die Belichtung auf 300 ms, Laserleistung bis 5 und zu intensivieren, 75 [Abb. 2].
5. Kontrollkästchen Sie das 3D im Abschnitt Typ zu erfassen . Wählen Sie im Bereich 3D Capture aktuelle Position und überprüfen Sie Bereich um Stromzu. Legen Sie in diesem Abschnitt den Bereich bis 35, die Zahl der Flugzeuge bis 36 und die Schrittweite auf 1. Das Angebot kann erhöht oder verringert, um Platz für die Tiefe der imaging-Bereich. Für das Rückenmark ist ein Wert zwischen 35-40 Stapeln in der Regel ausreichend [Abb. 5].
6. Wählen Sie aktuelle Position [Abb. 5].
7. Klicken Sie auf Start am unteren Rand des Aufnahmefensters Bild zu erwerben.

3. Single-Cell Ladungszustand

1. Öffnen Sie konfokale Software und wählen Sie die Erfassung und Fokus-Fenster [Abb. 1]. Wählen Sie unter das Aufnahmefenster imaging Lab-spezifische Konvertierungseinstellung unter der Einnahme Drop-down-Registerkarte [Abb. 1] einstellen. Hier nennt man die Lab-spezifische Einstellung "Fisch Abtragen vollen Chip."
2. Wählen Sie die c488 und c541 Laser im Menü Filter setzen. Wenn nicht die gleiche Mikroskop-Software verwenden, finden Sie das Menü, verschiedene Laser und wählen Sie die 488 nm und 541 nm Laser auszuwählen. Die Belichtungen auf 300 ms eingestellt, Laserleistung bis 5 und zu intensivieren, 75 [Abb. 2]. Diese Lasereinstellungen werden auf die Produktion von genügend Fluoreszenzsignal ohne Immunofluoreszenz oder Toxizität ausgewählt. Wenn Toxizität oder Immunofluoreszenz visualisiert wird, reduzieren Sie Laserleistung oder Belichtung.
3. Öffnen Sie das Fenster und klicken Sie auf die Registerkarte "Photomanipulation" im Fenster "Fokus". Laserparameter entsprechend anpassen. Ändern Sie die Laserleistung Stack auf 2, und klicken Sie dann auf Go. Ändern Sie die Raster-Blockgröße auf 1 und klicken Sie auf festlegen. Ändern Sie doppelklicken Sie auf 4. Ändern Sie die Laserlinie auf v405 [Abb. 3].
4. Öffnen Sie die erweiterten Einstellungen im Fenster "Aufnahme". Wählen Sie die Registerkarte "Photomanipulation" und ändern Sie die Doppelklick-Wiederholungen in 2. Klicken Sie auf "OK" [Abb. 4].
5. Wählen Sie die Registerkarte "XY" im Fenster "Fokus". Überprüfen Sie die Laserparameter aus Schritt 2 im Register Fotomanipulation [Abbildung 3, Abbildung 4]. Photoconvert die Zelle ohne Ladungszustand der umgebenden Zellen Lasereinstellungen gesetzt.
   1. Wenn Ladungszustand benachbarter Zellen vorhanden ist, reduzieren Sie Laserleistung. Wenn Ladungszustand der Zellen nicht auftritt, können Laserleistungen erhöht werden. Laserleistung soll optimal, Photoconvert nur die Region von Interesse und nicht die Umgebung.
6. Das Kontrollkästchen Sie Timelapse unter Typ zu erfassen. Klicken Sie auf [Abbildung 6A] starten .
7. Sobald das live Zeitraffer-Fenster öffnet, wählen Sie das Werkzeug Kreis in der oberen Symbolleiste [Abb. 7]
8. Zeichnen Sie einen Kreis, in welcher Region der Zelle. Rechtsklick den gezeichneten Kreis, FRAP Regionauswählen, und warten Sie 3 Sekunden. Der ausgewählte Bereich sollte dimmer werden [Abb. 8]. Klicken Sie auf Aufzeichnung beenden.
9. Wenn mehr als ein Tier imaging, gehen Sie auf die Registerkarte "XY" im Fokus-Menü und wählen Sie Position 2 zurück. Wiederholen Sie Schritte 4.1-4.6.
10. Um eine Population von Zellen zu konvertieren, folgen Sie dem Protokoll und Laser Parameter für Schritte 4.1-4.4 außer statt Zeichnen eines Kreises des Interessenbereichs FRAP, verwenden Sie das Linienwerkzeug. Zeichnen Sie eine Linie auf die Region des Interesses und die Region mit den gleichen Parametern, die oben aufgeführten FRAP.

4. Post-Ladungszustand Imaging

1. Nachdem alle Punkte Photoconverted sind. Wählen Sie die Labor-spezifischen standard Bildstapel Einstellung in der Precoversion imaging Schritt 3 beschrieben. Dies finden Sie unter der Einnahme Drop-down-Registerkarte im Fenster "Aufnahme" [Abb. 5] einstellen.
2. Wählen Sie die c488 Laser und stellen Sie die Belichtung auf 300ms Laserleistung bis 5 und zu intensivieren, 75 [Abb. 2].
3. Wählen Sie die c541 Laser finden Sie unter das gleiche Menü wie die c488 Laser. Stellen Sie die Belichtung auf 500 ms, Laserleistung bis 10 und bis 75 [Abb. 9] verstärken.
4. Kontrollkästchen Sie das 3D im Abschnitt Typ zu erfassen . Wählen Sie im Bereich 3D Capture aktuelle Position und überprüfen Sie Bereich um Strom zu. Legen Sie in diesem Abschnitt den Bereich bis 35, die Zahl der Flugzeuge bis 36 und die Schrittweite auf 1. Die Palette-Anzahl kann erhöhen oder verringern um die gewünschte bildgebenden Tiefe [Abb. 5] unterzubringen.
5. In der Registerkarte "XY-Fokus" gibt es mehrere Punkte, die multipoint Liste Option im Fenster "Aufnahme". Wenn dies nicht der Fall ist, wählen Sie aktuelle Position.
6. Klicken Sie auf Start am unteren Rand des Aufnahmefensters Bild zu erwerben.

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Ergebnisse

Ladungszustand der fluoreszierenden Proteinen kann verwendet werden, um verschiedene Zellen in einem Gewebe⁶beschriften. Um dies zu demonstrieren, wurden Tg(sox10:eos) Fisch⁹ verwendet, um das Photoconvertible Protein Eos unter die regulatorischen Sequenzen des sox10. Die Tg(sox10:eos) Tiere bei 48 hpf waren zunächst montiert, und dann ein Image erstellt um eine unspezifische Ladungszustand erkennen, die mögliche...

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Diskussion

In komplexen Gewebe organisieren verschiedene Zelltypen in bestimmten Domänen. Vor kurzem wurden Techniken zur Bezeichnung einzelner Zellen innerhalb dieser großen Gewebe Strukturen^1,2,3genutzt. Hier zeigen wir zwei Techniken, die in ähnlicher Weise genutzt werden können, um einzelne Zelle Interaktionen und Zelle Bevölkerung Wechselwirkungen in komplexen Gewebe sichtbar zu machen. Der Vorteil der Ladungszustand Technik ist ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tg(sox10:eos) zebrafish animals			Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame
100 X 15 mm petri dish	VWR	25384-302
Embryo medium			Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.
0.8% Low Melting Point Agarose	dot scientific inc	9012-36-6
35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish	Ted Pella Inc.	14021-20
Needle dissecting probe
0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine)	Fluka analytical	A5040-250G
Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters	Zeiss Axiozoom
Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets	3i spinning disk confocal
UV light source (laser) for photoconversion	405 nm laser
Slidebook software	3i
Methylene blue	Kordon